Name: מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: למד מבחני colorimetric מהירים להבחנה בין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular הטרוגניות. השיטות מנצלות את השונות בריאקטיביות של מרכיבי הסוכר לזיהוי מהיר ויעיל של חומצות גרעין וסוכרים מחזרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת וירג&#39;יניה וJeffress זכרון הנאמנות (J-971). אנו מודים ל &#39;קולומבוס, ק ג&#39;אין, ופ רנדולף לדיונים מועילים וקריאה ביקורתית של כתב היד.

1. Assay של בנדיקט להפחתת סוכרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט של בנדיקט - קרבונט 940 מ&quot;מ נטול מי נתרן, מייבשי ציטרט הנתרן mM 588, 68 מ&quot;מ נחושת pentahydrate (II) סולפט. ריאגנט זה ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר (RT) לפחות שישה חודשים ללא שינוי ניכר בתגובתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 6x. כך, 600 תגובות μl, להוסיף 100 μl של ריאגנט של בנדיקט לצינור נקי 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge (למשל, אפנדורף מותג), לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה; הנפח האופטימלי ניתן לקבוע על סמך העצמה של היווצרות צבע בהרצה ראשונית. אם מדגם מספיק זמין אז להתחיל בניסויים כאלה בנפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חמש שישיות מעוצמת התגובה הכוללת, 500 μl של דגימה במקרה זה), ואז לדלל במבחנים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לטויהיה להביא את הנפח הסופי עד 600 μl; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Blank ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של מדגם זה ב475 ננומטר. </li></ol> 2. Assay Orcinol של יאל לסוכרי פנטוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט של יאל הטרי - קריאטין מונוהידראט 24.2 המ&quot;מ orcinol (ראה איור 2b למבנה של תרכובת זו), 6 M HCl, 0.025% hexahydrate כלוריד הברזל w / v הערה.:לאחסון ממושך, המגיב של יאל יכול להיות מוכן כמו שני פתרונות נפרדים מלאי: (i) מגיבים [0.05% w / v FeCl3 • 6H 2 O בריכוז HCl] וכן (ii) מגיב monohydrate orcinol B מ&quot;מ [422 הכין ב95 אתנול%]. מגיב יכול להיות מאוחסן בRT במשך שישה חודשים; B המגיב ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך חודש אחד, מכוסה בנייר כדי לצמצם את חשיפת אור. פתרוני מניות אלה מעורבים ב15 (א): 1 (ב) יחס לפני השימוש v / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ&quot;ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של יאל לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל, לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לצינור להביא fנפח inal ל 1.0 מ&quot;ל; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב660 ננומטר. </li></ol> 3. Assay Diphenylamine של Dische לסוכרים 2&#39;-deoxypentose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט diphenylamine של Dische - 60 המ&quot;מ diphenylamine, חומצה אצטית קרחונית ז 11, חומצה גופרתית 179 מ&quot;מ, 62% v / v אתנול. מגיב זה יכול להיות מראשpared מראש ולאחסן בRT במכל כהה, או מכוסה בנייר כסף, כדי להגביל את החשיפה לאור. בשל רגישות לאור מגיב לא צריך להיות מאוחסן ללא הגבלה זמן, אף שבפועל זה יכול להיות מוכן בכל שנים עד שלושה חודשים, ללא שינוי ניכר בתגובתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ&quot;ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של Dische לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל, לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לצינור להביא נפח הסופי למיליליטר 1.0; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה וallow לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב 600 ננומטר. </li></ol> 4. הערות שימוש נוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחלקות הבאות של מולקולות הן תרכובות התייחסות מתאימות לבקרת תגובות חיוביות ושליליות לכל assay: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של בנדיקט - חיובי = החופשי ריבוז, פרוקטוז, גלוקוז; השלילי = רנ&quot;א, דנ&quot;א, ATP, וכו &#39;. (כל saccharide החסר פונקציונלית סוכר הפחתה חינם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יאל של - החיובי = רנ&quot;א (תמצית השמרים של האופה לדוגמה), ריבוז, ה-ATP, UMP; השלילי = השור serאממ אלבומין (BSA) או כל חלבון אחר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dische של - חיובי = DNA (למשל העגל התימוס); שלילי = רנ&quot;א, ATP, וכו &#39;. (כל הלא 2&#39;-deoxygenated נוקלאוטיד) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחנים אלה נמצאו להיות די גמישים לתרכובות המשמשות לעתים קרובות בטיהור חלבונים: למשל, מלחים נפוצים כגון NaCl, (NH 4) 2 SO 4, ו-K 2 SO 4 לא התערב, והתגובות מופיעות בדרך כלל אינן מושפעות את התוכן של ממס. חומרי ניקוי או סוכני chaotropic כגון אוריאה עשויים להשפיע על תגובתיות של המבחנים אם pH הוא בסיסי ביותר, וניטראלי לטווח pH חומצי הוא בדרך כלל אופטימלי ביותר למבחנים של Dische יאל של ובגלל כימית התגובה הבסיסית (ראה את הטקסט ואת הפרוטונים באיור 2b, ג). תנאים לא טובים עלולים להיות תגובה, interferents חשוד, וכו &#39;. צריך להיבדק על בסיס מקרה לפי מקרה, תוך שימוש חיובי ושלילי שליטת הניסויים wתרכובות התייחסות ith. </li></ol>

<ol><li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%3A+A+Compendium+of+Methods+from+Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th, Wiley. (1999).</li>
<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoet%2C+D+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th, John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+RLP+%22The+Biochemistry+of+the+Nucleic+Acids%22">The Biochemistry of the Nucleic Acids</a>. , 10th, Chapman and Hall. (1986).</li>
<li>Rice, P. A., Correll, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRice%2C+PA+%22Protein-nucleic+acid+interactions%3A+Structural+biology%22">Protein-nucleic acid interactions: Structural biology</a>. , RSC Pub. (2008).</li>
<li>Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+in+charge%3A+Magnesium+ions+in+RNA+folding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).</li>
<li>Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+histone-like+protein+HU+specifically+recognizes+similar+structures+in+all+nucleic+acids.+DNA%2C+RNA%2C+and+their+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids.</a> J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5(1908).</li>
<li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li>
<li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li>
<li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li>
<li>Burton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+conditions+and+mechanism+of+the+diphenylamine+reaction+for+the+colorimetric+estimation+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.</a> Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).</li>
<li>Vogel, J., Luisi, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+and+its+constellation+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hfq and its constellation of RNA.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).</li>
<li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li>
<li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li>
<li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+protein+assay+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> מבחני colorimetric מוצגים כאן מציעים גישה פשוטה במהירות כדי להעריך את האופי הכימי של תערובות biomolecular, כגון הם נתקלו בעת טיהור חלבונים, RNAs או מתחמים מlysate כל התאים בהכנה למחקרים נוספים. כביולוגיה מבנית רודפת מכלולים נוספים יליד דמוי, אתגרים גדולים יותר בהדרגה, כגון הטרוגניות מדגם, יהיה נשקף מהמתחמים מסובכים ורבי מרכיבים. מכלולים מולקולריים הם לעתים קרובות רק באופן שולי יציבים, והבידוד המוצלח שלהם עשוי לדרוש תנאים פחות מחמירים טיהור (למשל, כפי שנמצא למתחמי sn...

הרבה מביולוגיה של תא מתרחשות באמצעות אינטראקציות מולקולריות המעורבות DNA ו-RNA. 4 חומצות גרעין באופן טבעי אלה (NAS) אינטראקציה זה עם זה, 5, 6 עם חלבונים ועם שורה של תרכובות מולקולה קטנה וligands in vivo (למשל, קטיונים divalent 7). האינטראקציות עשויות להיות קצרים או ארוך חיים (ודינג), עשוי לנוע בין גבוה עד בינוני לזיקה נמוכה (כוח התרמודינמית), וגם יכול להציג וריאציה משמעותית בתכונות כימיות וסגולית - כמה עמותות הן ספציפיות (למשל, ה-DNA · · גורמי תעתוק, RNA · · · גורמי שחבור), ואילו אינטראקציות אחרות הן בהכרח הרבה יותר כללי (למשל, ה-DNA · · · חלבונים חיידקיים היסטון דמויים הו 8). אינטראקציות לא ספציפיות עם NAS יכולות להיות השלכות מעשיות לניסויים במבחנה מעורבת תערובות של biomolecules, כפי שזה אפשרי, בסבירות גבוהה, כי חלק NAS יקשר עם ביומולקולות של עניין, לפחות תחת משנה חלק מתנאי הניסוי בשימוש (חוזק יוני, pH פתרון, וכו &#39;). קח, לדוגמה, ייצור של חלבון של עניין (POI) באמצעות ביטוי יתר של חלבון Heterologous רקומביננטי בתרבית תאי חיידקי Escherichia; הליך כזה מבוצע באופן שגרתי כמעט בכל מעבדת ביולוגיה מבנית 9 בהכנות לניסויים נוספים, כאמור. כאפיון ביוכימי / biophysical, התגבשות, וכו &#39;., מאמצים ראשוניים בדרך כלל להתמקד בהשגת כמות מספקת של נקודתי העניין בצורה טהורה ככל האפשר, באופן אידיאלי כדגימה כימית הומוגנית וbiophysically monodisperse. לאחר ההפרעה של תאים פונדקאיים, בשלבים המוקדמים של עבודת טיהור טיפוסית שואפים לבודד את נקודת העניין מE. חלבונים, חומצות גרעין coli, פסולת דופן תא,ורכיבים אחרים של lysate הסלולרי. עם זאת, המארח NAS עשוי לשתף לטהר עם POI מכמה סיבות physicochemical - POI הבסיסי ביותר עשוי הלא במיוחד נפתח DNA מארח / רנ&quot;א; POI יכול להיות פעילות הגנרית NA-מחייבת (לדוגמה, HU הנ&quot;ל); POI יכול להיות חלבון ספציפי למדי NA-מחייב אבל תערוכת תגובה צולבת עם RNAs המארח או DNAs; המארח NAS עלול ליצור אינטראקציה עם מטריצת כרומטוגרפיה ובכך פשוט שיתוף elute עם POI, וכן הלאה. ללא הבחנה, בעלת זיקה גבוהה מחייב של המארח NAS לPOI יכול להוות בעיה מציקה, כי זיהומי NA סביר יפריעו ניסויים במורד זרם (לדוגמה, מבחני אנאיזוטרופיה קרינה של POI • RNA מחייב 10). לחלופין, POI בלתי צפוי · · · עמותות NA גם ניתן לראות במקרה, כאינטראקציות כאלה להאיר קיבולת חומצת גרעין המחייב של נקודת העניין. כך או כך, בין אם הם מרכיבי NAS או מזהמים עיקריים, צריך לכמת ראשון ולזהות את הסוג (DNA, RNA) של שיתוף מטהר NAS בהכנה לניסויים במורד זרם. מספר שיטות אנליטיות קיימות לאיתור וquantitating NAS במדגם. רוב השיטות הזמינות באופן מהותי או spectrophotometric (למשל, 260 ערכי ספיגה ו260 / A 280 ratios), fluorometric (למשל, מחייב thiazole כתום או צבעי ניאון אחרים לנ&quot;א), או colorimetric (רגישות של נוקלאוזידים לתגובות כימיות שchromophores תשואת קליטה באזור UV-VIS של הספקטרום האלקטרומגנטי), כפי שתואר לאחרונה על ידי דה מיי et al. 1 עם זאת, הצעד החיוני לזיהוי הסוג של polynucleotide כRNA או DNA הוא מעבר להיקף של רבים מאלה quantitation גישות. כאן אנו מספקים סדרה של מבחני colorimetric לזהות במהירות את סוגי רכיבי NA במדגם חלבוניים. הפרוטוקולים מתוארים כאן גיבוצע ביעילות ללא צעדים נוספים של בידוד זיהומי NA הפוטנציאליים, ולהסתמך על הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים 11, assay orcinol לpentoses 12,13, ותגובות של diphenylamine 14,15 2&#39;-deoxypentoses (תרשימי 1 ו 2) . מבחנו של בנדיקט (איור 2a) מנצל את היכולת של השרשרת הפתוחה (אלדהיד) הטופס ליניארי, של סוכר aldose להפחית Cu 2 +, עם חמצון קשור של קרבוניל של הסוכר למחצית carboxylate וייצור של Cu 2 O כ משקע אדום מסיס. תגובה זו תהיה מבחן חיובית עם הפחתת סוכרים חינם כגון aldoses וketoses (אשר להמיר לaldoses המתאים דרך ביניים enediol), אך לא עם סוכרי פנטוז שנעולים בצורה מחזורית כחלק מעמוד השדרה קוולנטי של DNA או RNA polynucleotide. בגלל הדרישה של מינימליסטי פונקציונלי hemiacetal חופשי, שיתוף אחרmpounds שיכולים בדיקה חיובית בבדיקה זו - ולכן יפעל כinterferents פוטנציאלי - כולל α-hydroxy-קטונים ואוליגוסכרידים קצרים (מלטוז disaccharide למשל). שניהם יאל של orcinol (האיור 2b) ותגובות diphenylamine של Dische (איור 2 ג) מבוססות על הרס ראשוני של עמוד שדרת polynucleotide, דרך depurination של nucleoside וחומצה או עוד יותר הידרוליזה בסיס קטליזאטור של נוקלאוטידים ההורי, כדי להניב furan-2 -Carbaldehyde (furfural) נגזרים; הנגזרים האלה אז להגיב עם או polyhydroxy פנול כגון orcinol (יאל של) או diphenylamine (Dische של) ריאגנטים ליצירת מוצרי עיבוי צבעוניים של מבנה כימי הידוע ברובם. דנ&quot;א לעומת רנ&quot;א ספציפי של assay של Dische נובע מהעובדה שסוכר הפנטוז חייב להיות 2&#39;-deoxygenated כדי להיות רגיש לחמצון לאלדהיד ω-hydroxylevulinyl, אשר עוד מגיב עם diphenylamineתחת תנאים חומציים להניב בהירים כחולים מעובים (איור 2 ג). שימוש בפרוטוקולים היעילים שתוארו כאן, יש לנו מצאנו שתגובות colorimetric סוכר ספציפיים אלה יכולים להבחין בין רנ&quot;א ודנ&quot;א, וגם מצביעות על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, או ריבוז במדגם biomolecular.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב או ציוד </td><td> ספק / חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות, הערות </td></tr><tr><td> סודיום קרבונט נטול מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> dihydrate ציטרט הנתרן </td><td> סיגמא </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> נחושת (II) pentahydrate סולפט </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> monohydrate Orcinol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> המרוכז HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> hexahydrate כלוריד Ferric </td><td> סיגמא </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamine </td><td> אולדריץ </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> ריבוז </td><td> סיגמא </td><td> R-7500 </td><td> הכנה על 1% w / v בH 2 O </td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית מהשמרים של האופה (cerevisiae ס) </td><td> סיגמא </td><td> R6750 </td><td> הכנה ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O; חנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> חומצה דאוקסיריבונוקלאית (מלח נתרן), מעגל התימוס </td><td> סיגמא </td><td> D1501 </td><td> הכנה ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O; חנות ב 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים, ציוד ובטיחות חומרים מפורטים בfollowing שולחן הסדר בו הם מופיעים בסעיף הפרוטוקול. אלא אם צוין אחר (לעיל), כל ריאגנטים ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר הסביבה ותאורה. עבור כל פריטים שאינו מופיעים ברשימה שלהלן (לדוגמה, צינורות microcentrifuge), היצרן / דגם / מגוון שנמצא במעבדה הביוכימית תקן הרגיל יכול לשמש (למשל, 1.5 צינורות Eppendorf מותג ml microfuge). צינורות פלסטיק סטנדרטיים microfuge אמורים לשמש לפעולות כרוכות בצנטריפוגה (למשל, לחומר חלקיקי משקעים סמכו לסוף כל פרוטוקול). אין חומר מסוים עדיף, כל עוד את הצינורות יכולים להיות אטומים; צינורות פוליפרופילן הטיפוסיים המופיעים במעבדות ביוכימיה לעבוד היטב. במונחים של חששות בטיחות וסילוק פסולת, אמצעי זהירות מעבדה סטנדרטי (משקפי מגן, ברדסי קטר) צריך להיות למימוש בקילוף מראש, עובד עם, והשלכה של פתרונות המכילים אצטית מרוכזים, הידרוכלורית, או חומצות גופרתיות. לחומרים כימיים אורגניים כגון orcinol או diphenylamine, כפפות nitrile עדיפות על מגוון הלטקס המשותף (גומי טבעי). </td></tr></tbody></table>

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין rna ו-dna בדגימות biomolecular

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

ניסויים ביוכימיים בדרך כלל דורשים ידע מדויק, בשלב מוקדם, של חומצות הגרעין, חלבונים ומרכיבים אחרים בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות. חומצות גרעין ניתן לאתר באמצעות כמה גישות הוקמו, כולל שיטות אנליטיות שspectrophotometric (למשל, 260), fluorometric (למשל, כריכה של צבעי ניאון), או colorimetric (תגובות כימיות chromogenic nucleoside ספציפיים). 1 למרות שאנחנו לא יכולים להבחין RNA מ-DNA, 260/280 יחס מועסק בדרך כלל, כפי שהוא מציע 2 הערכה פשוטה ומהירה של התוכן היחסי של חומצות גרעין, אשר סופגות בעיקר ליד 260 ננומטר וחלבונים, אשר סופגים בעיקר ליד 280 ננומטר. יחסים &lt;0.8 נלקחים כמצביעות על דגימות חלבון &quot;טהורות&quot;, ואילו חומצת גרעין טהורה (NA) מאופיינת ביחסים&gt; 1.5 3. הוwever, יש תרחישים שבם תכולת החלבון / אנ לא יכולה להיות ברורה או מהימן להסיק ממדידות spectrophotometric UV-VIS פשוטות. לדוגמה, (אני) דגימות עשויות להכיל חלבונים אחד או יותר שהם יחסית נטולי החומצות האמינו ארומטיים האחראיות על ספיגה ב≈ 280 ננומטר (TRP, Tyr, Phe), כפי שקורה עם כמה חלבונים קטנים RNA-מחייבים, ו (Ii) דוגמאות ניתן להציג ביניים A 260 / A 280 יחסים (~ 0.8 &lt;~ 1.5), שבו תכולת החלבון / NA הרבה פחות ברור, ואף עלול משקפות חלק-זיקה גבוה קשר בין מרכיבי החלבון ואנ. לתרחישים כאלה, נתאר להלן חבילה של מבחני colorimetric מהירות להבחין RNA, DNA, והפחתת סוכרים במדגם פוטנציאלי מעורב של ביומולקולות. השיטות להסתמך על רגישות ההפרש של pentoses ופחמימות אחרות לבנדיקט, יאל של (orcinol), והמגיבים של Dische (diphenylamine); הפרוטוקולים היעילים יכול להיות completed בעניין של דקות, ללא כל פעולה נוספת שיש לבודד את הרכיבים. את המבחנים ניתן לבצע במקביל להבחנה בין רנ&quot;א ודנ&quot;א, כמו גם להעיד על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, וריבוז (1 איור).

תוצאות מוצגות באיור 3 ליישום מבחנים אלה לcolorimetric תרכובות התייחסות ידועה. מידע איכותי יציג מוצגים ל( ב), והמבחנים של בנדיקט (א), של יאל orcinol של Dische diphenylamine (ג), ועקומות רגילות לשלושת מבחנים אלה מוצגים באיור 4. בלוחות 3 (AC), לוחות השמאל להראות ניסויים שליטים חיוביים / שליליים באמצעות analytes כראוי תגובתי / unreactive; תוצאות חזותיות אלו מוצגים באתר, בcuvettes כמתואר בפרוטוקולי 1-3 (לעיל). זכות תתי פנלים להראות סדרת טיטרצי...

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ&quot;א, דנ&quot;א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע אם דגימה הטרוגנית פוטנציאלית של ביומולקולות מכילה חומצת גרעין או סוכרים מפחיתים. ואם כן, הבחין בין RNA ל-DNA על סמך התגובתיות השונה של חלקי הסוכר שלהם. זה מושג על ידי יישום תחילה של מבחן בנדיקט כדי לקבוע אם התערובת הביו-מולקולרית מכילה סוכרים מפחיתים חופשיים.כקובץ שלב שני, נעשה שימוש בארסן או בדיקה, הקובעת אם רכיבי סוכר כלשהם מכילים טבעות פנטו או לא. המנות הבאות מגיב דיפניל אמין משמש כדי לקבוע אם סוכר הפנטו הוא דאוקסיריבוז כמו ב- DNA או לא כמו ב- RNA. התוצאות מראות את סוג הביופולימר המבוסס על תוצרי צבע מובחנים בקלות שנוצרו על ידי תגובתיות דיפרנציאלית של רכיבים מבוססי סוכר בדגימה, אותם ניתן לנתח מול עקומות סטנדרטיות באמצעות מדידות פוטומטריות ספקטרו.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון אלקטרופורזה באמצעות צבעים פלואורסצנטיים, ירוק פיקו או סייבר גולד, הוא שאין מגבלה על בסיס גודל, מטען או מרכיב סוכר, והיא יעילה בזמן ובעלות לבדיקה להפחתת סוכרים. הכן נפח מתאים של שישה x מגיב בנדיקט המורכב מ-940 מילי-מולרי נטול מים, נתרן פחמתי 588 מילי-מולארי, נתרן ציטראט דיהידרט ו-68 מילי-מולרי נחושת. שני סולפט פנטה הידרט.עבור כל דגימה לבדיקה, הוסף 100 מיקרוליטר של שישה x מגיב בנדיקט לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף בין 10 ל-500 מיקרוליטר דג

rapid-colorimetric-assays-to-qualitatively-distinguish-rna-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

סרטון זה מציג את פרוטוקול זיהוי האותות במהלך הכלאה כרומוגנית של RNA באתרו. טכניקה זו יכולה לשמש לאבחון זיהום אונקוגן פעיל חזותית בדגימת רקמה שלמה.

RNA CISH Signal Detection: טכניקה לזיהוי אותות כרומוגניים במהלך הכלאה של RNA באתרו בדגימות רקמות שלמות

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מעקב גנומית דנ א (gDNA) זיהום בדגימות ה-RNA. השיטה הציג מנצל תחל ספציפיות עבור אזור פנימי מרווח משועתקים (ITS) של גנים ribosomal DNA (rDNA). השיטה מתאים זיהוי אמין, רגיש לזיהום DNA ברוב פרוקריוטים, אאוקריוטים.

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

מחקר זה מציג שיטה איתנה לבידוד mRNA אקסונים באמצעות הכנסות ממברנה נקבוביות, המאפשרת הפרדה מלאה בין נוירונים לנויריטים וטיהור RNA. בשילוב עם RTddPCR, הגישה מאפשרת כימות מוחלט של תמלילים בעותק נמוך, ומקלה על מחקרים של העברת mRNA ותרגום מקומי עם רגישות גבוהה, שחזוריות ויישום ניסויי רחב.

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

אנו מתארים פרטים ניסיוניים של הסינתזה של חלקיקים בדוגמת וreconfigurable משני מבשרים ממדיים (2D). מתודולוגיה זו יכולה לשמש ליצירת חלקיקים במגוון צורות, כולל פאונים ומכשירים נאחזו בסולמות אורך נעים בין מייקרו לקנה מידה של סנטימטר.

אוריגמי השראה עצמית הרכבה של חלקיקים בדוגמת וReconfigurable

למד מבחני colorimetric מהירים להבחנה בין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular הטרוגניות. השיטות מנצלות את השונות בריאקטיביות של מרכיבי הסוכר לזיהוי מהיר ויעיל של חומצות גרעין וסוכרים מחזרים.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

גלה סרטונים נוספים