הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין שלפוחיות חד-למלריות ענקיות באופן התואם את השלמות התפקודית של חלבוני הממברנה המשולבים בקרום השלפוחית. זה מושג על ידי הנחת שומנים או ליפוזומים קטנים על משטח מוליך כמו מגלשת זכוכית מצופה ITO. השלב השני הוא אידוי הממס בצורה מבוקרת כדי להשיג סרט שומנים אחיד על המשטח המוליך.

לאחר מכן, החזירו בזהירות את סרט השומנים במאגר מתאים והכינו את תא היווצרות האלקטרו. השלב האחרון הוא להפעיל מתח מתנודד על פני סרט השומנים כדי ליצור שלפוחיות מילר ענקיות. בסופו של דבר, השלפוחיות יצולמו כדי לקבוע את גודלן ואיכותן ולהשוות לשלפוחיות שנוצרו בטכניקה קלאסית.

הדגמה חזותית של פרוטוקול זה שימושית מכיוון שתצהיר שומנים יכול להיות קשה לשלוט בו, תלוי במשתנים רבים והוא הבדיקה הטובה ביותר על ידי בדיקה חזותית. לפני שתתחיל בהליך זה, הסר את השומנים מהאחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס וחמם לטמפרטורת החדר. במידת האפשר, בצעו את הניסוי באטמוספירה של גז אינרטי כמו תא כפפות.

לאחר מכן, כסו את השומנים בארגון יבש או בגז חנקן ובכל השלבים צמצמו את החשיפה לאוויר. אם השומנים אינם מסופקים בממס אורגני, השעו 0.3 מיליגרם שומנים בכלורופורם או ציקלו היין ב-10 מיליגרם למיליליטר. שימו לב שהיצרנים הצהירו שהריכוזים הם בדרך כלל נומינליים בלבד.

השתמש באתנול כדי לנקות את שני הצדדים של 2 מגלשות זכוכית מצופות ITO בגודל 25 מילימטר על 37.5 מילימטר. לאחר מכן הוסף עוד 0.1 אחוז DPPE אדום טקסס לשומנים להדמיה פלואורסצנטית. מדוד את התנגדות פני השטח בעזרת מולטימטר כדי לוודא שהצד המצופה ITO של מגלשות הזכוכית פונה כלפי מעלה, מה שמסומן על ידי התנגדות של כמה מאות אוהם.

שאפו את השומנים למזרק עמיד לממס כאשר מחט המזרק לא ממש נוגעת במשטח ה-ITO. מרחו לאט את השומן על ידי הזזת המחט קדימה ואחורה על פני השקופית. מכסים את המשטח באופן שווה, מחפשים ברק קשת על משטח הזכוכית.

לאחר מכן, ההחלקות עוברות במהירות לתוך ואקום, מייבשות ושואבות את התא לפחות מוואקום אחד למשך 0.5 עד שעה. כדי להסיר כל ממס עקבות. שחרר את הוואקום עם גז אינרטי.

מרחו שכבה דקה של שומן סיליקון על שני צידי אטם סיליקון ולאחר מכן הניחו את האטם על השקופית. השאר לפחות חמישה מילימטרים של שקופית לא מכוסה חשופה בקצה אחד של השקופית. לאחר מכן, הרטיבו בזהירות כל באר על ידי הנחת מחט מזרק בגודל 27 בקצה האטם ומרחו לאט לאט את מילוי כל אטם בכ-10% עם ערימות מילי-מולריות.

לאחר שהשומנים יקבלו לחות, המשיכו במהירות בשלבים הנותרים. מכיוון שסרטי שומנים מתחילים להתפרק, ודא מיד את הצד המוליך של השקופית בעזרת המולטימטר. לאחר מכן החל את הפנים המוליכות השנייה של ITO לחלק העליון של האטם.

הקפד על לפחות חמישה מילימטרים של תלייה מחוץ לאזור האטם ומול המתלה הראשון, ולחץ בעדינות כדי להבטיח אטימה טובה. נקה את שני התלויים באמצעות אתנול. כעת אבטח את כריך ההחלקה של ITO למגעים חשמליים כגון מוטות נחושת או קצף אטם.

גרפיקה זו מציגה תצוגה מפוצצת של החדר ומכלול המגעים כהפניה. ניתן למצוא תוכניות מפורטות בפרוטוקול הטקסט באמצעות מולטימטר. ודא שאין קצר חשמלי בין המגעים ושהמגעים מתחברים כראוי למשטחי ה-ITO.

לאחר מכן, הכניסו את תא היווצרות האלקטרו לתנור וחממו את התא 10 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההיתוך הגבוהה ביותר של כל אחד מהליפידים הקיימים. מדוד את הפער בין שני המשטחים המצופים ב-ITO כדי לקבוע את משרעת גל הסינוס. משרעת גל הסינוס צריכה להיות כ-0.7 וולט RMS עבור כל פער מילימטרי בין משטחי ה-ITO, החל גל סינוס של 10 הרץ למשך 60 עד 90 דקות.

חבר את הגנרטור לתא היווצרות האלקטרו ואשר את המתח באמצעות מולטימטר. לאחר 60 עד 90 דקות של היווצרות אלקטרו, אמורות להיווצר שלפוחיות ענקיות. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד בקוביית סינון לצבע אדום טקסס כדי לדמות את הליפוזומים.

הליפוזום צריך להיות כדורי, בעיקר אלה דרך העין וללא פגמים כמו חוטים התלויים מהליפוזום. השלבים הקודמים כיסו את ההכנה הקלאסית של ליפוזומי ענק משומנים טהורים. מוצגת תכשיר מאתגר יותר באמצעות ליפוזומים קטנים.

לאחר מכן, הכינו תמיסת אשלגן פחמתי רוויה של 44% לחות יחסית ב -20 מעלות צלזיוס. השתמש במיכל פלסטיק של יוגורט וגרנולה עם עליונה מקננת ששונתה עם חורים בכוס העליונה. מניחים את תמיסת המלח הרוויה ועודפי המלח בכלי אטום היטב עם מדף פנימי.

החלף את המדף לאחר המילוי וודא שהנוזל נמצא חמישה עד 10 מילימטרים מתחת למדף. הנח חיישן לחות בחריץ בצד המיכל. נקה את שני הצדדים של שקופיות זכוכית מצופות ITO עם אתנול.

השתמש במולטימטר כדי לקבוע איזה צד מוליך ולתייג את הצד הלא מוליך בשם המדגם. לאחר מכן, יש לשמן קלות את שני הצדדים של אטם סיליקון אחיזה אחד או יותר. הנח את המוליך של המגלשה, מקם על הספסל והחל את אטמי הסיליקון על כל שקופית שעליה יוחל השומן.

ודא שיש לפחות חמישה מילימטרים של שקופית חשופה בקצה אחד כדי להתחבר למנגנון היווצרות האלקטרו. החלק את האטם כדי להבטיח אטימה טובה, דלל את הכנת השלפוחית במאגר איזו מודי דל מלח לכ-1 עד 2 מיליגרם למיליליטר. מרחו את השומן על השקופית בטיפה אחת עד 10 מיקרוליטר.

הניחו את המגלשה על המדף הפנימי מעל תמיסת המלח הרוויה ואטמו היטב את המיכל. השאירו בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות עד לילה. כעת ניתן להשתמש בשקופית להיווצרות אלקטרו של ליפוזומים ענקיים כפי שהוצג קודם לכן בפרוטוקול הקלאסי.

שימו לב למראה הקשת של המשקעים הבודדים. תמונה זו מציגה ליפוזומים אלקטרו שנוצרו משומנים שהופקדו מתוך כלורופורם, החיצים מצביעים על ליפוזומים ענקיים. בתמונה זו יש מעט מאוד אזורים מטושטשים ולכן מעידה על הכנה טובה.

בתמונה הבאה יש אזורים מטושטשים רבים ולכן מעידה על הכנה לקויה בדרך כלל. שימו לב שחץ 2 מציין אזור עם ליפוזומים שאינם ניתנים להבחנה וכי לא ניתן להתמקד בליפוזומים באזור המצוין על ידי חץ 3. מוצג כאן הגדלה של פי 10 של ליפוזומים שנוצרו בהצלחה משומנים שהופקדו על ידי התייבשות של ליפוזומים קטנים.

החיצים מצביעים על שלושה ליפוזומים באיכות טובה בגודל של כחמישה עד 20 מיקרומטר בהגדלה של פי 40. ניתן לראות טבעת שקופה בקצה הליפוזום, המעידה על ליפוזום חד או כמעט לומלי. הקפסאיצין הפעיל TR PV זרמים יוניים אחד שנרשמו בכתמי קרום שומנים שנכרתו מהליפוזומים הענקיים שנוצרו מצולמים כאן.

זרם הדליפה הצביע על התנגדות איטום של 500 מגה לפני הוספת קפסאיצין. קפסאיצין רווי הפעיל זרם T RRP V גדול. הזרם חוזר קרוב לקו הבסיס כאשר קפסאיצין נשטף מהתיקון תוך כדי ניסיון הליך זה.

חשוב להישאר גמיש מכיוון שגורמים רבים משפיעים על אופן התייבשות השומנים ויוצרים שכבה אחידה על מצע הזכוכית. עיין בסעיף פתרון הבעיות המקוון שלנו ושנה את הטמפרטורה, הלחות, ריכוז השומנים וגודל הטיפות כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.