דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

זכרון מטבולית הוא התופעה שמתרחשת סיבוכי סוכרת להתמיד ולהתקדם ללא הפרעה גם לאחר euglycemia מושגת pharmaceutically. כאן אנו מתארים מודל סוכרת דג זברה שהוא ייחודי בכך שהיא מאפשרת בדיקה של רכיבי epigenetic mitotically המסירים של זיכרון מטבולים

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מודל דג זברה לסוכרת מסוג 1, שיכול לשמש לגילוי הבסיס המולקולרי של סיבוכי סוכרת, וחשוב מכך, קביעת הבסיס הגנטי להתמדתם. זה מושג על ידי גרימת היפרגליקמיה תחילה עם סדרת זריקות של התרופה הסוכרתית STZ, ודגירה של הדגים בטמפרטורה מופחתת. לאחר מכן, לאחר שלושה שבועות, נקבעות רמות הגלוקוז בדם בצום כדי להבטיח שהמצב ההיפרגליקמי הושרה והתרופה מופסקת כדי להתחיל התאוששות של תאי בטא.

לאחר מכן נכרת סנפיר הזנב ומאפשר לו להתחדש כדי לבודד רכיבים הניתנים להעברה גנטית של זיכרון מטבולי ולהסיר גורמים שעלולים לסבך את הסביבה ההיפרגליקמית הקודמת. לבסוף, מבוצעת בדיקת התחדשות סנפירים כדי לתעד הפחתה מתמשכת בהתחדשות הסנפירים ולזהות שינויים מושרים ברקמה המועברת באמצעות מבחן מעניין. היתרון העיקרי של מודל דג הזברה הסוכרתי על פני המודל הקיים הוא שניתן לחקור זיכרון מטבולי בסביבה גליקמית U אמיתית בקיץ למה שהיה נראה בחולים לאחר השתלת לבלב.

אנו מצפים שהמודל ישמש לגילוי השינויים האפיגנטיים העומדים בבסיס הזיכרון המטבולי והתמדה של סיבוכי סוכרת כדי ליצור דגי זברה עם סוכרת, הכינו מיכל התאוששות עם מי דגים רגילים ומיכל הרדמה של מי דגים עם דילול של 1 עד 1000 של שני פנוקסיאתנול מתחת למכסה אדים. הכינו תמיסה של 0.3% של STREPTOZOTOCIN או STZ על ידי הוספת שישה מיליגרם STZ לשני מיליליטר של 0.09% נתרן כלורי, והניחו מיד את התמיסה על קרח בצינור נפרד. יש מספיק מי מלח לשליטה.

דגים ממלאים מזרק חצי CC המצויד במחט בגודל 27 וחצי עם STZ או פתרונות בקרה, ומבטיחים שלא יילכדו בועות אוויר. הרדמו דג בודד על ידי הכנסתו למי הרדמה והמתנה עד שתנועת השחייה תיפסק כדקה עד שתיים. לאחר ההרדמה הניחו את הדג לזמן קצר על מגבת נייר כדי לספוג עודפי מים, ואז הניחו את הדג בסירת דרך ושקלו אותו.

לאחר מכן, הניחו את הדג על משטח יציב. לאחר מכן הכנס את המחט מעבר לשיפוע לתוך ההיבט האחורי של הצפק הגחוני והזריק 0.35 מיליגרם לגרם TZ או נפח שווה ערך של תמיסת בקרה לחלל הצפק של הדג לאחר ההזרקה. הנח את הדג במיכל מי ההתאוששות ופקח עליו לפעילות שחייה רגילה.

לאחר הזרקת מספיק דגים לניסוי, העבירו אותם למיכלי חיים רגילים ושמרו על טמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה המופחתת היא קריטית לאינדוקציה יעילה של היפרגליקמיה כדי לגרום למצב ממושך של היפרגליקמיה גבוהה מאוד, לעקוב אחר לוח זמנים של זריקות תכופות בשלב האינדוקציה, ולאחר מכן זריקות תחזוקה שבועיות כפי שמוצג כאן לאיסוף דם. לקביעת FBGL, הכינו צינור PCR מסומן לכל דגימת דם המכילה חמישה מיקרוליטרים של מי מלח רגילים.

לאחר הרדמת הדג מכתים את עודפי המים, מניחים את הדג על מגלשת מיקרוסקופ ובעזרת אזמל, מסירים את הראש בבסיס האופרקולום, אוספים את הדם שמשתחרר על המגלשה ומוסיפים אותו במהירות לצינור ה-PCR של פיפטינג מי מלח סטרילי ורגיל למעלה ולמטה כדי לוודא שהדם לא נקרש מיד מניחים את הדגימה על קרח. קבע את נפח דגימת הדם על ידי מדידת הנפח הכולל של הנוזל בצינור והפחתת חמשת המיקרוליטרים של מי מלח. העבירו חמישה מיקרוליטרים של הדם המדולל מכל צינור PCR לתוך צינור מיקרו פוגה בנפח 1.5 מיליליטר, והשתמשו בערכת בדיקת הגלוקוז בכרום קוונטי בהתאם להוראות היצרן כדי לקבוע את ריכוז הגלוקוז בדם.

לאחר הרדמת דג, הניחו אותו בצלחת פטרי ותחת סקופ ניתוח, השתמשו באזמל סטרילי בגודל 10 כדי לקטוע את סנפיר הקיפוד על ידי חיתוך קו ישר פרוקסימלי לנקודת ההסתעפות הראשונה של קנה הנשימה השומני לשלב הצמיחה ההתחדשות של הבדיקה. הנח את הדג במיכל התאוששות בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס כדי לדמות סנפירים מתחדשים. לאחר הרדמת דג, מורחים את הסנפיר כך שהוא מורחב במלואו ומשתמשים במשקף חיתוך המצויד במצלמה ובתוכנת NIS Element.

אסוף תמונות בהגדלה של x אחד כדי למדוד צמיחה מתחדשת. הדפס את התמונות והשתמש בתוכנת image J ובלוח ציור כדי לעקוב אחר כל אזור הצמיחה החדשה לדיוק המעקב. ודא שאין צללים או טיפות מים ובצע כל מדידה חמש פעמים כדי לחשב את הממוצע.

כדי לנרמל את המדידות, יש למדוד את אורך אתר הקטיעה לאורך ציר הגחון הגבי ולחלק את השטח שנקבע קודם לכן במדידה זו. לאחר יצירת קבוצה של דגי DM והבקרות שלהם לאחר 21 יום, קבעו את ה-FBGL עבור תת-קבוצה של הקבוצה וחלקו את דגי ה-DM לשתי תת-קבוצות למשך הניסוי. המשך זריקות STZ שבועיות לאחת הקבוצות כאשר בקרות DM עבור הקבוצה השנייה מפסיקות את זריקות STZ ודוגרות על הדגים בטמפרטורה רגילה.

תוך 14 יום, דגי הזברה הללו יחזירו את השליטה הרגילה באינסולין ובגלוקוז בדם באמצעות התחדשות הלבלב. דגים אלה נקראים כיום זיכרון מטבולי או MM, דגים ביום 30 לאחר הסרת התרופות קוטעים את סנפירי הביקורת של דגי DM ו-MM כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה כדי לאפשר צמיחה של רקמת זיכרון מטבולית. החזירו את הדג לתנאי מים רגילים להתחדשות הסנפיר למשך 30 יום ביום ה-60.

בצע קטיעה שנייה בתוך הרקמה שהתחדשה בתקופה שבין 30 ל-60 יום ובצע בדיקת התחדשות סנפיר קנדל, בודד את הרקמה ובצע בדיקה מעניינת. דג זברה סוכרתי מסוג 1 לא רק מציג את הסיבוכים המשניים הידועים של רטינופתיה ונפרופתיה, אלא גם מציג סיבוך נוסף פגוע בהתחדשות סנפיר הקיפוד כפי שניתן לראות כאן 72 שעות לאחר הקטיעה. סיבוך זה נמשך עקב זיכרון מטבולי בדגים שהחזירו את בקרת הגלוקוז התקינה לאחר תקופה היפרגליקמית כפי שמוצג כאן, דגי הזברה מ"מ מציגים גירעון בהתחדשות הסנפיר של כ-40% בהשוואה לדגי ביקורת, והפגיעה נצפתה עד 150 יום לאחר הקטיעה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליזום את המצב ההיפרגליקמי בדגי הזברה, למדוד את רמות הגלוקוז בדם בצום, לבצע מחקרי התחדשות סנפירים, ובסופו של דבר לייצר דגי זיכרון מטבוליים.