מבוא לקורא המיקרו-לוחיות
קורא המיקרו-לוח הוא מכשיר רב-מודולי המאפשר לבצע ולמדוד בו זמנית מגוון ניסויים. קוראי מיקרו-פלאט יכולים לבצע מדידות ספיגה, פלואורסצנטיות וluminescence.…
קורא המיקרו-לוח הוא מכשיר נפוץ המאפשר למדוד בו זמנית דגימות רבות, כאילו נערכים בו זמנית ניסויים זעירים רבים.
מנגנון זה משמש בשילוב עם לוחות multiwell, כמו צלחת 96 היטב.
ללא קשר לסוג הניסוי המנוהל עם קורא המיקרו-לוח, עקומות סטנדרטיות משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע את הערך של דגימות ניסיוניות, כמו גם פקדים חיוביים ושליליים.
קוראי מיקרו-לוח מגיעים בצורות, גדלים ותפאורות שונים. לקוראי מיקרו-לוח רבים יש יכולות רב-מודליות המאפשרות לבצע בדיקות רבות ושונות. שיטות אלה כוללות את היכולת לבצע סוגים שונים של מדידות, כגון ספיגה, פלואורסצנטי ומדידות זוהרות.
לוחות Multiwell הם רכיבים אינטגרליים לקורא המיקרו-לוחות ומשמשים להחזקת הדגימות הנמדדות על ידי המכונה. לוחות אלה יכולים להיות בגדלים שונים, יש סוגים שונים של תחתיות בארות ומספרים שונים של בארות. סוג הצלחת המשמשת תלוי בבדיקה.
מגש הטעינה משמש כדי להביא את צלחת 96-well לתוך המכונה.
ממשק מחשב משמש בדרך כלל להפעלת קורא הלוחות ולשליטה בהגדרות ובפרמטרים שלו, כגון אורך הגל והמצב. תוכנת קורא הלוחות כוללת ממשק משתמש גרפי של הצלחת המאפשר לך לבחור אילו בארות נטענות בדוגמאות.
צינורות רב-ערוציים משמשים לעתים קרובות לטעינת לוחות רב-באריים. המאגרים מכילים את הפתרונות עבור הפיפטה הרב-ערוצית.
לעתים ניתן לטעון את וולס באמצעות פיפטה סטנדרטית בערוץ יחיד.
דוגמאות ותקנים נטענים בשכפול או משולש כדי לתת דין וחשבון על שגיאות ההצינורות. כאן אתה רואה צלחת טעונה משולשת.
העקום הסטנדרטי משתמש בדגימות עם ריכוזים ידועים, המניבים ערכי ספיגה שונים. נתונים אלה משמשים לאחר מכן ליצירת גרף שבו נוצרת שורה של התאמה מיטבית.
הריק משמש לקביעת מידת המדידה שלך שאינה רלוונטית מבחינה ניסיונית והיא נובעת מהמאגרים שבהם המדגם שלך מדולל או ריאגנטים שאליהם המדגם שלך חשוף. הערכים המתקבלים ממדידות אלה נקראים "הרקע". הריק אינו מכיל דוגמה כלשהי.
השליטה החיובית מציינת אם ההסתה עבדה כראוי או לא. זה נותן תוצאה טובה. הפקד השלילי הוא משתנה בקרה שבו לא צפויה מדידה/אפקט. זה לא צריך להניב שום תוצאה..
ברגע שהצלחת מוכנה, הגיע הזמן לטעון את הדגימות. כדי למנוע מדידת הדגימות הלא נכונות או טעינת הצלחת בצורה לא נכונה, חשוב לכוון את הצלחת כראוי במגש הטעינה. זכור לנקוט זהירות בעת טעינת דגימות במגש, כדי לא לכפות את המגש לתוך המכשיר או לתפוס את הגפיים בתוך המכשיר.
לאחר טעינת המגש, פרמטרים כגון המצב, אורך הגל וסדר הטעינה היטב מוגדרים בתוכנה לפני קריאת הצלחת.
לאחר הגדרת הפרמטרים, הלוח נקרא והקורא יוצר קריאה מתוך ערכים בתוך התוכנה.
לאחר קריאת הלוח, השתמש בערך הממוצע של הדגימות הריקות כדי להחסיר את הרקע מכל הדגימות כולל העקומה הסטנדרטית.
לאחר הקריאה, ערכי הריכוז הידועים של הסטנדרטים מתווים כנגד הערכים הנמדדים שלהם, ספיגה במקרה זה.
כאשר הערכים התווו, ניתן לחשב את קו ההתאמה הטובה ביותר באמצעות רגרסיה ליניארית. ניתן לבצע זאת בקלות באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
מקדם הקביעה, מדד סטטיסטי של מידת הערך של השורה מנבאת נקודות נתונים בפועל, צריך להיות בין 0.90-0.99, כאשר 0.99 נחשב לערך הטוב ביותר ומסמל כי הקו מתאים לנתונים בצורה מושלמת.
באמצעות קו ההתאמה הטובה ביותר, אנו יכולים לחשב את ערכי הריכוז של דגימות ניסיוניות או פקדים בכל באר על-ידי חיבור ערך הספיגה עבור Y ולאחר מכן פתרון המשוואה עבור X. ניתן להעריך ערכי ריכוז גם על-ידי ציור קו מערך הספיגה בציר Y לקו ההתאמה הטוב ביותר ולאחר מכן לציר X.
סוגים רבים של קוראי מיקרו-לוחית מודדים ספיגה, המוגדרת כיחס הלוגריתמי של אור הנופל על אובייקט לאור המועבר דרך אובייקט.
ברדפורד assay הוא דוגמה של ספיגה מבוסס מיקרופלסטיק קורא בדיקות, שבו דגימות חלבון מתווספים לצלחת עם ריאגנט "ברדפורד". תרכובת זו נקשרת לחלבונים במדגם, וגורמת לשינוי בספיגתה.
בבדיחות מבוססות פלואורסצנטיות, פלואורוכרום מופעל על ידי אורך גל מסוים של אור ובתורו גורם להתרגשות של הפלואורוכרום, הפולט אור באורך גל אחר.
בעת עבודה עם ריאגנטים רגישים לאור, הקפד לשמור אותם מכוסים כדי למנוע הלבנת תמונות והרס הניסוי.
בדיקות זוהרות פולטת אור באמצעות תגובה כימית ולעתים קרובות משתמשות בלוציפראז. לוציפראז מגיע ממספר מקורות כגון גחליליות. בתגובת לוציפראז, אור נפלט כאשר לוציפראז נתקל חמצן, ATP, ומגנזיום בסדרה של תגובות.
מבדים זוהרים יש יישומים רבים ושונים. דוגמה ליישום זה היא מדידת הייצור והזיהוי של מינים חמצן תגובתי בסרטן.
יישומים אחרים, המשתמשים בקוראי מיקרו-לוח, כוללים בדיקות תפוקה גבוהה באמצעות בארות 384 ו-1536. בבחינתים האלה, לוחיות רישוי נטענות על ידי רובוט. לא, לא סוג כזה של רובוט. רובוט ניתן לתכנות אשר הופך טיפול מדגם מדויק ביותר לאוטומטי.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לקורא המיקרו-לוחיות. בסרטון זה, הראינו מהו קורא מיקרולטים(A), כיצד משתמשים בו(B), כיצד להפעיל מכשיר זה(C), כיצד לפרש נתוני קורא מיקרו-לוחות, ויישומים מסוימים באמצעות קורא מיקרו-לוחית(D). תודה שצפיתם.
קורא המיקרו-לוח הוא מכשיר נפוץ המאפשר למדוד בו זמנית דגימות רבות, כאילו נערכים בו זמנית ניסויים זעירים רבים.
מנגנון זה משמש בשילוב עם לוחות multiwell, כמו צלחת 96 היטב.
ללא קשר לסוג הניסוי המנוהל עם קורא המיקרו-לוח, עקומות סטנדרטיות משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע את הערך של דגימות ניסיוניות, כמו גם פקדים חיוביים ושליליים.
קוראי מיקרו-לוח מגיעים בצורות, גדלים ותפאורות שונים. לקוראי מיקרו-לוח רבים יש יכולות רב-מודליות המאפשרות לבצע בדיקות רבות ושונות. שיטות אלה כוללות את היכולת לבצע סוגים שונים של מדידות, כגון ספיגה, פלואורסצנטי ומדידות זוהרות.
לוחות Multiwell הם רכיבים אינטגרליים לקורא המיקרו-לוחות ומשמשים להחזקת הדגימות הנמדדות על ידי המכונה. לוחות אלה יכולים להיות בגדלים שונים, יש סוגים שונים של תחתיות בארות ומספרים שונים של בארות. סוג הצלחת המשמשת תלוי בבדיקה.
מגש הטעינה משמש כדי להביא את צלחת 96-well לתוך המכונה.
ממשק מחשב משמש בדרך כלל להפעלת קורא הלוחות ולשליטה בהגדרות ובפרמטרים שלו, כגון אורך הגל והמצב. תוכנת קורא הלוחות כוללת ממשק משתמש גרפי של הצלחת המאפשר לך לבחור אילו בארות נטענות בדוגמאות.
צינורות רב-ערוציים משמשים לעתים קרובות לטעינת לוחות רב-באריים. המאגרים מכילים את הפתרונות עבור הפיפטה הרב-ערוצית.
לעתים ניתן לטעון את וולס באמצעות פיפטה סטנדרטית בערוץ יחיד.
דוגמאות ותקנים נטענים בשכפול או משולש כדי לתת דין וחשבון על שגיאות ההצינורות. כאן אתה רואה צלחת טעונה משולשת.
העקום הסטנדרטי משתמש בדגימות עם ריכוזים ידועים, המניבים ערכי ספיגה שונים. נתונים אלה משמשים לאחר מכן ליצירת גרף שבו נוצרת שורה של התאמה מיטבית.
הריק משמש לקביעת מידת המדידה שלך שאינה רלוונטית מבחינה ניסיונית והיא נובעת מהמאגרים שבהם המדגם שלך מדולל או ריאגנטים שאליהם המדגם שלך חשוף. הערכים המתקבלים ממדידות אלה נקראים "הרקע". הריק אינו מכיל דוגמה כלשהי.
השליטה החיובית מציינת אם ההסתה עבדה כראוי או לא. זה נותן תוצאה טובה. הפקד השלילי הוא משתנה בקרה שבו לא צפויה מדידה/אפקט. זה לא צריך להניב שום תוצאה..
ברגע שהצלחת מוכנה, הגיע הזמן לטעון את הדגימות. כדי למנוע מדידת הדגימות הלא נכונות או טעינת הצלחת בצורה לא נכונה, חשוב לכוון את הצלחת כראוי במגש הטעינה. זכור לנקוט זהירות בעת טעינת דגימות במגש, כדי לא לכפות את המגש לתוך המכשיר או לתפוס את הגפיים בתוך המכשיר.
לאחר טעינת המגש, פרמטרים כגון המצב, אורך הגל וסדר הטעינה היטב מוגדרים בתוכנה לפני קריאת הצלחת.
לאחר הגדרת הפרמטרים, הלוח נקרא והקורא יוצר קריאה מתוך ערכים בתוך התוכנה.
לאחר קריאת הלוח, השתמש בערך הממוצע של הדגימות הריקות כדי להחסיר את הרקע מכל הדגימות כולל העקומה הסטנדרטית.
לאחר הקריאה, ערכי הריכוז הידועים של הסטנדרטים מתווים כנגד הערכים הנמדדים שלהם, ספיגה במקרה זה.
כאשר הערכים התווו, ניתן לחשב את קו ההתאמה הטובה ביותר באמצעות רגרסיה ליניארית. ניתן לבצע זאת בקלות באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
מקדם הקביעה, מדד סטטיסטי של מידת הערך של השורה מנבאת נקודות נתונים בפועל, צריך להיות בין 0.90-0.99, כאשר 0.99 נחשב לערך הטוב ביותר ומסמל כי הקו מתאים לנתונים בצורה מושלמת.
באמצעות קו ההתאמה הטובה ביותר, אנו יכולים לחשב את ערכי הריכוז של דגימות ניסיוניות או פקדים בכל באר על-ידי חיבור ערך הספיגה עבור Y ולאחר מכן פתרון המשוואה עבור X. ניתן להעריך ערכי ריכוז גם על-ידי ציור קו מערך הספיגה בציר Y לקו ההתאמה הטוב ביותר ולאחר מכן לציר X.
סוגים רבים של קוראי מיקרו-לוחית מודדים ספיגה, המוגדרת כיחס הלוגריתמי של אור הנופל על אובייקט לאור המועבר דרך אובייקט.
ברדפורד assay הוא דוגמה של ספיגה מבוסס מיקרופלסטיק קורא בדיקות, שבו דגימות חלבון מתווספים לצלחת עם ריאגנט "ברדפורד". תרכובת זו נקשרת לחלבונים במדגם, וגורמת לשינוי בספיגתה.
בבדיחות מבוססות פלואורסצנטיות, פלואורוכרום מופעל על ידי אורך גל מסוים של אור ובתורו גורם להתרגשות של הפלואורוכרום, הפולט אור באורך גל אחר.
בעת עבודה עם ריאגנטים רגישים לאור, הקפד לשמור אותם מכוסים כדי למנוע הלבנת תמונות והרס הניסוי.
בדיקות זוהרות פולטת אור באמצעות תגובה כימית ולעתים קרובות משתמשות בלוציפראז. לוציפראז מגיע ממספר מקורות כגון גחליליות. בתגובת לוציפראז, אור נפלט כאשר לוציפראז נתקל חמצן, ATP, ומגנזיום בסדרה של תגובות.
מבדים זוהרים יש יישומים רבים ושונים. דוגמה ליישום זה היא מדידת הייצור והזיהוי של מינים חמצן תגובתי בסרטן.
יישומים אחרים, המשתמשים בקוראי מיקרו-לוח, כוללים בדיקות תפוקה גבוהה באמצעות בארות 384 ו-1536. בבחינתים האלה, לוחיות רישוי נטענות על ידי רובוט. לא, לא סוג כזה של רובוט. רובוט ניתן לתכנות אשר הופך טיפול מדגם מדויק ביותר לאוטומטי.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לקורא המיקרו-לוחיות. בסרטון זה, הראינו מהו קורא מיקרולטים(A), כיצד משתמשים בו(B), כיצד להפעיל מכשיר זה(C), כיצד לפרש נתוני קורא מיקרו-לוחות, ויישומים מסוימים באמצעות קורא מיקרו-לוחית(D). תודה שצפיתם.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.