Name: אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: למדו שיטה יעילה וזולה למדידת אורך טלומרים ופעילות טלומראז בבעלי חיים שונים באמצעות qRT-PCR. השיטה מאפשרת לחקור את הקשר בין דינמיקת הטלומרים להזדקנות תאית ומחלות קשורות לגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. פרוטוקול אורך הטלומרים 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד ה-DNA </li></ol> רוב שיטות בידוד DNA יכולה להיות בשימוש. המעבדה שלנו מעדיפה Qiagen DNeasy קיט (# 69,506) למקורות דם. בהתאם למקור של ה-DNA, כגון buccal או מקורות אחרים, ניתן להשתמש בשיטת בידוד שונה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים: </li></ol> כל פריימרים הם מדוללים בריכוז של מניית 100pmoles/μl במי כיתה PCR ומאוחסנים ב -20 ° C עד הצורך. מניות עבודה של פריימרים נעשות טריות ומאוחסנות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה קצרה של זמן (כמה חודשים). פריימרים רגילים שמשו לטלומרים וβ-גלובין, SCG, כפי שתוארו בO&#39;Callaghan et al. 20 . רצפי פריימר: 1 Telo: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &quot; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &quot; 1 SCG: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &quot; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; הערה: צבעי יסוד הם מדוללים לריכוז עבודה של 10pmoles/μl, לפני הוספה לתערובת תגובה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול הסדרה של הדנ&quot;א הגנומי: </li></ol> דילולים סדרתי של הדנ&quot;א הגנומי לTelo וג&#39;ין עותק בודד (SCG) נוצרים כדי ליצור עקומת ערך Ct סטנדרטית עבור assay. הדנ&quot;א הגנומי משמש היה שחולץ מן הלימפוציטים מדגימות דם. דילולים אלה נוצרים על ידי דילול PCR DNA עם כיתה H 2 0 לכל ריכוז בפקטור של 1.68 להניב שני הסטים של דילולים סדרתי שמשתמשים באותו הדנ&quot;א הגנומי. הריכוזים המתחילים כבר מותאמים המבוססים על ניסוי וטעייה, וייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בעת שימוש בחומרים כימיים שונים, כלי נגינה, DNA ממינים אחרים, סוגי תאים, ומשמש SCG. הערה: דילול סידורי באמצעות הדנ&quot;א הגנומי נעשים על ידי ערבוב בעדינות ומחכה לפחות 15 דקות לשעה אחת befoלקיחה מחדש של DNA לדילול הבא. דילול כל דורש זמן להדנ&quot;א הגנומי לנתק. לאחסון, aliquot דילולים סדרו לטווח ארוך לרצועות PCR לאחסון ב -80 ° C. כל רצועת PCR הוא הפשיר והשתמשה פעם אחת, כדי למנוע מחזורי ההפשרה הקפאה שעלול לגרום נזק לדנ&quot;א. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובה לRT-PCR </li></ol> מכשיר בשימוש: Cycler אור Roche480 מגיב: רוש האור Cycler SYBR הירוק לדלל דגימות DNA בדיקה לריכוז סופי של 10 ng / μl. אנחנו בודקים באמצעות ריכוז Nanodrop או קיוביט. בנוסף, אנו לדלל את ה-DNA מ10ng/μl ל5ng/μl הסופי. אנחנו לא לבדוק את הריכוז שוב. מרכיבי תגובה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> Telo </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ P&gt; <td> 6 μl </td><td> H20 </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> 1 Telo </td><td> 0.2 μl </td><td> SCG 1 </td><td> 0.6 μl </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8 μl </td><td> SCG 2 </td><td> 1.4 μl </td></tr><tr><td> Rxn תמהיל </td><td> 10 μl </td><td> Rxn תמהיל </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> DNA או דילול סדרתי </td><td> 2 μl </td><td> DNA או דילול סדרתי </td><td> 2 μl </td></tr></tbody></table> הערה: מיקס מאסטר נעשה ללא DNA ועם עודף של 5% עד 10%. שניהם Telo וSCG מנוהלים יחד על אותה צלחת שימוש בתכנית הבאה. לבדיקת דיוק, לפחות שלושה משכפל של כל דגימה ובקרה יש להפעיל. וריאציות בפריימרים המשמשים עשויות להשפיע על התוצאות. הפרוטוקול שלנו כבר מותאם לעבודה באופן הבא את האור Cycler Roche480 ופריימרים שלנו. בתוךלפגל itial 10 דקות לפגל 95 מעלות צלזיוס רכיבה על אופניים 95 ° C 10 שניות אחיזה 60 ° C ההמתנה 5 שניות 72 מעלות צלזיוס ההמתנה 11 שניות ורכישה אחת חזור על 45 עד 55 פעמים כנדרש 2. (QTD) איתור Telomerase כמותית פרוטוקול (בהתבסס על ערכת QTD על ידי בעלות הברית ביוטק, Inc חתול. מס MT3012) לחלץ הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים או רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repellet ולהסיר 1x PBS. * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 200 μl של מאגר תמוגה x 1 לכל 10 -10 5 6 תאים או 40-100 מ&quot;ג של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה מדגם XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר 160 μl של supernatant לתוך צינור טרי ולקבוע את ריכוז חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ומהיר להקפיא את התמצית שנותרה על קרח / אתנול יבש, החנות ב -80 ° C. </li></ol> * בtמצבו, הטלומראז בתאים או רקמות קפואים הוא יציב במשך לפחות שנה. כשהפשרת לשימוש, resuspend התאים באופן מיידי במאגר 1 X תמוגה. 2.1. בקרת assay שליטת חום איון: לכל דגימה, לחמם טיפול תמצית שליטה נוספת על ידי דוגרים על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני assay פעילות טלומראז. עקומת סטנדרט לתבנית שליטת TSR: בצע כמותי Real-Time PCR באמצעות דילולים של TSR, oligonucleotide עם רצף דומה לפריימרים הטלומרים כלולים בערכה כדי ליצור עקומה סטנדרטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים סדרו 01:05 לריכוז TSR המניות (0.5 amoles / μl) עם מאגר תמוגה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את assay סטנדרטי איתור הטלומראז באמצעות μl 1 של דילול כל TSR, כולל ריכוז המניות. ניתן לאחסן דילולים אלה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות. </li></ol> 2.2. Assay פעילות Telomeraseבאמצעות QTD Real-Time PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, להוסיף את הדברים הבאים לצינור PCR או קיר דק PCR צלחת (נפח כולל μl 25.0): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12.5 μl של Premix QTD 2 x </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.0 μl של תא או תמצית רקמות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 11.5 μl של מים מוסמכים PCR </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית בזמן אמת מערכות איתור PCR על פי התכנית שלהלן: - 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (תגובת הטלומראז) - 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (שלב הפעלה ראשוני PCR) 35-40 מחזורים של: - שנייה 95 מעלות צלזיוס למשך 30 (denaturation) - 60 שניות מעלות צלזיוס למשך 30 (חישול) - 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (ארכה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינורות PCR בCycler התרמית ולהפעיל את תכנית רכיבה על אופניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את מחזור הסף או C ערך T לאחר סיום מחזורים. מחזור הסף הוא המחזור שבו עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית של ΔRn הוא זוהה לראשונה. </li></ol> 2.3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Generatעקומת סטנדרט EA באמצעות קריאות t C ולהשוות פעילות טלומראז. </li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אורך הטלומרים מספק סמן סלולרי ייחודי ללמוד תא לחוץ והזדקנות ומציע תובנות לתוך המנגנונים של הזדקנות. מאז תפקידה בהזדקנות היה ראשון הוצע, מספר רב של המחקרים נעשה נוגע אורך הטלומרים לגיל, תוחלת חיים, מחלות הקשורות לגיל, סרטן, ולחץ. במשך עשרות שנים, ברמה של מדידות אורך הטלומרים הזהב הייתה ניתוח שבר הגבלת מסוף באמצעות הכלאה דרום. עם זאת, לאחרונה שיטה זולה, מהירה, וקלה לביצוע על ידי Cawthon התפתחה. באמצעות PCR כמו בזמן אמת, Cawthon הציע חלופה שימושית למדידת אורך הטלומרים, מה שהופך את הל...

הטלומרים הם חוזרים DNA hexamer (TTAGGG) רצפים שנמצאו בקצוות של הכרומוזומים. בכל שכפול של תא, קצוות הכרומוזומים אלה מקוצרים. אם הם הופכים לקצרים מדי, כרומוזומים יכולים לעבור התכת הטלומרים קצה, רקומבינציה החריגה, והשפלות. לכן תחזוקת אורך הטלומרים מספיק ממלאת תפקיד מרכזי ביציבות כרומוזום ותא הגנה 38. תחזוקת אורך הטלומרים היא קריטית גם לגנים שנמצאו בסמוך לקצוות הכרומוזומים, מאז שכפול הדנ&quot;א אינו יכול להמשיך עד הסוף של כרומוזומים 1-2. כתוצאה מכך, מניעת ההתקצרות הטלומרים עשויה לשפר את יציבות תא. מחקרים רבים דיווחו כי אורך הטלומרים הוא מתואם עם תוחלת חיים של האורגניזם ומצב חולה, כגון בסרטן 3-4, סוכרת 5, ומחלות לב וכלי דם 6,7. בנוסף, הטלומרים התקצרו כבר קשורים ללחץ מופרז אואורח חיים לא בריא 8, אולי על ידי קידום ההזדקנות המוקדם של תאים ומות 9. מצד השני, כמה מחקרים מצאו כי אין הבדל משמעותי בין אורך הטלומרים ואריכות ימים וגיל 39 קשור מחלה, 40, 41. אחד מהמנגנונים המולדים של התא של הגנה מפני התקצרות הטלומרים הוא על ידי הפעלה משלה אנזים טלומראז ההפוך טרנסקריפטאז (טרט). אנזים זה והמקטע שלה, טלומראז RNA (TERC), RNA ללא קידוד, השתמשו הטלומרים כתבנית להוסיף הטלומרים חוזר לכרומוזום 10 מסתיים. למרות פעילות telomerase נעדר ממספר סוגים של תאים ומנגנונים אחרים מעורבים בתחזוקת אורך הטלומרים, פעילות telomerase גדלה מתואמת עם אורך הטלומרים מוגבר. הפעלת Telomerase כבר נקבע כאחד מהמנגנונים שבאמצעותם תאים מגיבים לנזק ולהדגיש ולמנוע הזדקנות ומוות בטרם עת. לדוגמה, כבר telomeres הודגם באוכלוסייה של יהודים אשכנזים יוצאי דופן עם 11 תוחלת חיים, מוטציות בTERC או טרט הוכחו לתרום למחלה קטלנית 12, ורגולציה epigenetic של הטלומראז הוכח יש השפעה על מחלות הקשורות לגיל 13. מאז גילויו, אורך הטלומרים הוצע כסמן ביולוגי למצב בריאות במודלים של בעלי חיים שונים, כמו גם בבני אדם, אך המחקרים המוקדמים הללו היו קשים לשכפל באופן נרחב, כי השיטה הייתה מייגע, ארוכה ויקרה. בשנת 2002, ועוד יותר מכוון בשינה 2009, הציע Cawthon והפגין פרוטוקול חדש, מדויק, מהיר ופשוט המבוסס על PCR להעריך אורך הטלומרים ועוד יותר לחקור את תפקידה בהיבטים שונים של ביולוגיה של תא, הזדקנות ומחלה 19. בחירת שיטת מדידת הטלומרים הנכונה עבור מחקר היא חיונית. כיום, ישנן שיטות שונות המשמשות למדידת אורך הטלומרים, כל אחד עם עצמויתרונות וחסרונות. באופן מסורתי, אורך הטלומרים נמדד באמצעות ניתוח דרום כתם של שברי הגבלת מסוף (TRFs), הכולל: א. לעכל את ה-DNA עם אנזימי הגבלה שלא לקצץ בחזרות הטלומרים על מנת לקבל TRFs, ב. כתם דרומי של TRFs אלה נעשה על ידי קביעת אורך TRF הממוצע באמצעות בדיקה telomeric 14, 37. למרות ששיטה זו היא מאוד מדויקת עם מקדם קטן של וריאציה, הוא מדד ישיר, ויכול להיות יתרון למדידת אורך הפצה, ניתוח TRF הוא יקר, עבודה אינטנסיבית ודורש לפחות 3 מיקרוגרם של ה-DNA. שיטה זו היא גם רגישה לטלומרים קצרים וקביעת אורך יכול להיות מבולבלת על ידי דנ&quot;א subtelomeric, אשר יכול להיות מזוהה על ידי הבדיקה נאותה (TTAGGG) n כמו רצפים שהם מכילים 15, 42. שיטה נוספת מאוד מדויקת במדידת אורך הטלומרים היא ניתוח יחיד הטלומרים התארכות אורך (סטלה), Singlשיטת ה-PCR מולקולה מבוססת שדורשת כמות קטנה של DNA בלבד. בשיטה זו, פריימרים עשויים להכיר בסככה G-העשירה בסופו של הכרומוזומים ולהיקשר לרצף subtelomeric ייחודי על כרומוזום אחד, אשר מגביר את הטלומרים של כרומוזום מסוים. ההגברה המתקבלת היא אז דמיינו ידי כתם דרום. לשיטה זו יתרון של להיות מדויק מאוד והוא מסוגל לזהות טלומרים קצרים outlier 16. לרוע המזל, מכיוון שלא כל הכרומוזומים קצוות G-עשירים ורצף subtelomeric שמיש, אורך הטלומרים יכול להימדד רק על כרומוזומים ספציפיים ומדידות אלה עשויות שלא לייצג את אורכו של כל הטלומרים בתא 15. שיטה נוספת שכבר מתורגלת היא השימוש בחומצות גרעין פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות לגילוי אורך הטלומרים. תפרחת כמותית הכלאה באתרו (Q-דגים) מאפשרת לנו לדמיין את הטלומרים במהלך metaphase, שם הרחובaining של הטלומרים עם בדיקה הרשות הפלסטינית באופן יחסי לגודל שלהם מאפשר השוואה של הטלומרים בין כרומוזומים ספציפיים. למרות ששיטה זו יכולה לשמש גם לתאים בשלבי ביניים, כאן לא יכול להיות מזוהה על אורך הטלומרים לכרומוזומים שונים, אשר מציג מגבלה בעת מדידת אורך הטלומרים בתאים מזדקנים או לעתים רחוקות חלוקת 17. דגים במקום זרימה משתמש cytometry זרימה, וכיום הוא השיטה רגישה ביותר למדידת אורך הטלומרים של תאי דם בסביבה הקלינית, אבל דורש טכנאים מיומנים מאוד 18. נכון לעכשיו, השיטה הסטנדרטית למדידת אורך הטלומרים ממוצע במעבדה שלנו מנצלת את הדיוק, הרגישות, וקלות כמותי בזמן אמת PCR. שיטה זו התאפשרה למדידת אורך הטלומרים על ידי הפיתוח של פריימרים רומן למנוע את הסינתזה של מוצרי שמקורם בדימר פריימר, אשר במקרה אחר היה מיוצרת כבassay tandard בשל האופי החוזר של הטלומרים. עבור assay זה, מדידת אורך הטלומרים מיוצגת על ידי T / S היחס, מספר העותק חוזר הטלומרים למספר גני עותק יחיד. מאז יש קשר ישיר בין יחסי אורך הטלומרים ומספר פריימרים הטלומרים שכותרתו מחייב את ה-DNA בשלבי ההתחלה של ה-PCR, יחס T / S הוא ביחס ישר לאורך הטלומרים. יחס T / S נמדד על ידי השוואה את ההבדל ב-CT, מספר מחזור השבר שבמדגם של הצטברו תפרחת חוצה סף שהוא כמה סטיות תקן מעל תפרחת תחילת המחקר, בין דגימות עם פריימרים הטלומרים וSCG פריימרים 19. שיטה זו זכתה לביקורת על מדידתו העקיפה של אורך הטלומרים, אשר יכול להוביל למדידה לא מדויקת, למשל, במקרה של כפילויות כרומוזום או וריאציות של מספר עותקים 15. כמו כן, השוואה בין מחקרים היא לעתים קרובות דיfficult, אבל סטנדרטי oligomers פותחו כדי למדוד את אורך הטלומרים 20 מוחלט. שיטה זו קדמה משופרת על ידי Cawthon, באמצעות assay qPCR זמנית בצבע אחד. ב assay זה, ה-PCR הייתה לרוץ בטמפרטורות נמוכות יותר לכמה מחזורים הראשונים, כדי למנוע מחייב פריימר-dimer וגן הטלומרים ובקרה נותחו באותו הצינור PCR להימנע משגיאה נוספת. את מדידות אורך הטלומרים המתקבלות מתואמות חזקות עם אורך הטלומרים נמדד על ידי ניתוח כתם דרומי של TRFs ודיוק גבוה יותר היה 15, 19, 36. באותו הרגע, qRT-PCR היא השיטה הנוחה זמינה רק לבדיקת מדגמים גדולים ורק דורשת כמות קטנה של DNA לביצוע. חלק חיוני של שיטה זו הוא אמצעי בקרת איכות מקיפה, כך שכאשר עושה את זה כמו שצריך, בשיטה זו יכולה לספק מידע השוואתי רב ערך על אורך הטלומרים. בנוסף, בשיטה זו הייתה מותאמת לשימוש מעבר למדידת לויקוציטים<html> אורך הטלומרים במגוון רחב של רקמות שונות 42. בנוסף לכך, על מנת להבין את הביולוגיה מאחורי תחזוקת אורך הטלומרים ויחסי גומלין בין שתי תופעות המנוגדות (כלומר קיצור הטלומרים במהלך שכפול והתארכות על ידי אנזים טלומראז) נוסף, אנו מלווים את שיטת אורך הטלומרים עם assay נוסף שמודד את פעילות טלומראז. לצורך כך, אנו משמשים פרוטוקול הגברה חזור Telomeric, assay במבחנה. בקצרה, lysed, נשמר, תאי enzymatically פעילים מסונתזים חוזר telomeric על גבי מצע oligonucleotide באמצעות הטלומראז, ואת המוצרים באמצעות PCR היו מוגבר בנוכחות SYBR הירוקה. התוצאות נותחו על ידי השוואת מדגם וערכי סף ה-CT בקרה. מאז הטלומראז הוא אנזים רגיש לחום, חום נוסף שטופל שליטה לרוץ לצד כל מדגם 21. יש צורך &quot;jove_content&quot;&gt; בעת מדידת אורך הטלומרים יכולה לספק תובנה חשובה התפקיד האפשרי של אורך הטלומרים בפתופיזיולוגיה של הזדקנות ומחלות, אורך הטלומרים אינו מאפיין סטטי ומידע נוסף כדי להבין פונקצית הטלומרים. מחקרי פעילות telomerase יכולים להוסיף מידע על מנגנוני רגולצית אורך הטלומרים. לדוגמה, ההפעלה המבוקרת של הטלומראז יכולה לשמור על אורך הטלומרים והתפשטות תאים, אך הפעלה בלתי מבוקרת של הטלומראז יכולה לגרום לסרטן. שתי שיטות קדימה זולות וישרות אלה בשילוב סיפק לנו לא רק עם ראיות חזקות יותר לכיוון קשר בין אורך הטלומרים ויציבות תא, אלא גם תובנה נוספת לתוך המנגנונים האפשריים של התקצרות הטלומרים והתאוששות. בעזרת שיטות אלה אנו מקווים להבהיר את התגובה של התא להזדקנות ומצבים שונים של התפשטות תאים נוספים עם המטרה הסופית של הבנה טובה יותר של mechanis המרכזיMS של ביולוגיה של תא.

<table><tbody><tr><td>זיהוי טלומרז כמותי </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, תערובת תגובת התחלה חמה מוכנה לשימוש עבור PCR בזמן אמת מבוסס SYBR Green I באמצעות LightCycler 480 Instrument</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707516</td><td></td></tr></tbody></table>

אורך הטלומרים ופעילות telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

הטלומרים הם רצפי דנ&quot;א חוזרים בקצה קצוות של הכרומוזומים שהם מגוונים באורך ובבני האדם יכול להגיע לאורך של 15,000 זוגות בסיסים. הטלומרים משמש כמנגנון bioprotective התשה כרומוזום בכל חלוקת תא. באורך מסוים, הטלומרים להיות קצרים מדי כדי לאפשר לשכפול, תהליך שעלול להוביל לחוסר יציבות כרומוזום או מוות של תאים. אורך הטלומרים מוסדר על ידי שני מנגנונים מנוגדים: התשה והתארכות. ההתשה מתרחשת כמו כל תא מתחלק. בניגוד לכך, התארכות היא באופן חלקי מווסתת על ידי אנזים טלומראז, שמוסיף רצפים חוזרים בקצוות של הכרומוזומים. בדרך זו, יכול אולי להפוך את הטלומראז מנגנון הזדקנות וממריץ כדאיות תא. אלה הם אלמנטים קריטיים בשמירה על חיי תא ומשמשים כדי להעריך את הזדקנות תאים. בכתב היד הזה נתאר שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה להערכת אורך הטלומרים ברקמות מרובותים ומינים. השיטה זו מנצלת את שני מרכיבים עיקריים, בד בבד החוזרת של רצף הטלומרים והרגישות של qRT-PCR כדי לזהות להעתיק מספרי הפרשים של דגימות שנבדקו. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.

דוגמה של assay qRT-PCR אורך הטלומרים מוצגת באיור 1. בפנל השמאלי העליון, שכותרתו דגימות באדום וירוק מייצגות את מיקומם של נושאים שנבדקו על 96 גם הצלחת. בלוח הימני העליון, עקומת ההגברה הפגינה. כל נושא נבדק על ידי שני מבחני (ג&#39;ין העתקת הטלומרים ויחיד), אשר נעשה בtriplicates. בשל להעתיק מספרי דנ&quot;א שונים המיוצרים בשני מבחני של אנשים שנבחרו, מספר המחזורים עד לאיתור התפרחת מגיע לעקומת מעריכית שונה בין מבחני. בצינורות מספר עותק גבוהים יותר (כלומר assay הט...

שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה מתוארת מעריך כי אורך הטלומרים ברקמות ומינים באמצעות qRT-PCR מרובים. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לספק שיטה קצרה, מדויקת וזולה להערכת אורך הטלומרים ופעילות הטלומרים ברקמות ובמינים מרובים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד DNA גנומי לקביעת אורך הטלומרים באמצעות quantitative real-time PCR. השלב השני הוא בידוד וליזה של תאים מאותה רקמה בבופר השומר על תפקוד הטלומראז, ומדידה כמותית של הטלומראז באמצעות real-time PCR.בסופו של דבר, הן קביעת אורך הטלומרים והן זיהוי פעילות הטלומראז משמשים למציאת הקשרים בין אורך הטלומרים לבין הסניסנס של התאים, מנגנונים אפשריים של קיצור טלומרים ותגובות התאוששות להזדקנות ומצבים של התרבות תאים. נחשפתי לשיטות אלו לראשונה כאשר חיפשתי דרך מהירה ופשוטה למדוד את אורכי הטלומרים ואת פעילות הטלומראז. המשמעות של טכניקה זו מתרחבת לאבחון מחלות הקשורות לגיל ומוות מוקדם, מכיוון שהיא מדווחת על מצב התא, המשקף את מצב האיברים ואת מצבו הכללי של הגוף.מר אור בוגו, טכנאי במעבדתי, ידגים את ההליך הזה. כדי להתחיל בהליך, בודדו DNA מדם הנבדק באמצעות ערכת Qiagen DNE, המנוסחת במיוחד למקורות דם בשלב הסופי. אלוטו את ה-DNA במים בדרגת PCR ומדדו את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.בשלב הבא, הכין תמיסות אם של פריימרים ל-PCR כפי שתואר על ידי OC Callahan et al עבור הגן בעותק בודד או בקרת ה-SCG ועבור הטלומרים, על ידי דילולם לריכוז של 100 picomoles per microliter. בעוד הפריימרים עוברים רהידרציה, הכן סדרת דילול של ה-DNA שהבודד באמצעות מים בדרגת PCR. התחל בדילול ה-DNA מהתמיסה המקורית עם מים בדרגת PCR לריכוז מקסימלי של 6.1 nanograms per microliter עבור תגובות טלומרים ו-1.8 nanograms per microliter.עבור תגובות SCG, המתינו לפחות 15 דקות לפני המעבר לדילול הבא. לאחר 15 דקות, הכינו את הדילול הבא בהתאם לטבלה המוצגת כאן. חזרו על פעולה זו עבור כל אחד מהדילולים המפורטים.בשלב הבא, הכינו את תגובות ה-PCR בלוח PCR סטנדרטי. כל דגימה, יחד עם בקרות ה-SCG, תרוץ בשלוש חזרות. ראשית, הוסיפו שש µL של מים בדרגת PCR לכל באר, ולאחר מכן הוסיפו 10 µL מתערובת התגובה של cyber green.לאחר מכן, הוסיפו את הפריימרים בכמויות המוצגות כאן לבארים המתאימות להם. בשלב הבא, דללו בעשרה פעמים מנה (aliquot) מכל אחד מהפריימרים מהמלאי באמצעות מים בדרגת PCR, כך שהריכוז הסופי יהיה 10 picomoles per microliter. לבסוף, הוסיפו שני microliters מה-DNA המדולל בסדרה לבארים המתאימות וכסו את הפלטה בגיליון פלסטיק דביק כדי לאטום את התכנים.לאחר מכן, הכניסו את הפלטה למכשיר ה-real-time PCR. בהמשך, הגדירו תוכנית במכשיר ה-Roche four 80 light cycler, המתחילה בשלב דנטורציה של 10 דקות ב-95 °C, ולאחר מכן מחזורים של 95 °C למשך 10 שניות, 60 °C למשך חמש שניות ו-72 °C למשך 11 שניות.בסך הכל למשך 50 מחזורים, בצע מדידות cyber green לאחר כל מחזור. לאחר מכן, התחל בתוכנית ברגע שהתרמוסייקלר סיים את פעולתו. קבע את קו ה-CT בתחילת העקומת האקספוננציאלית ורשום את ערכי המחזור מהנקודה שבה כל דגימה חוצה את קו הסף.בשלב הבא, חשבו את היחס בין מספרי המחזורים של דגימות הטלומר לבין אלה של הגן בעותק בודד. מכיוון שלטלומר ישנם מספר אזורים שיעברו הגברה בכל מחזור, ערכי ה-CT של הטלומר יהיו נמוכים יותר מאלו של מספר העותקים של הגן הבודד, מה שיוביל ליחס של פחות מאחד. לבסוף, חשבו את אורך הטלומר בהתבסס על עבודתם של Terry Etal, שבה יחידת יחס של טלומר אחד לכל עותק גן בודד שקולה לאורך טלומר ממוצע של 4,270.זוגות בסיסים בלויקוציטים מבצעים מדידות של פעילות טלומראז באמצעות הגילוי הכמותי של טלומראז מבית Allied Biotech. כדי להתחיל במדידות, אספו 10⁵ עד 10⁶ תאי דם פריפריים ושטפו אותם ב-PBS. לאחר מכן, השקיעו אותם ב-500 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-200 µL של lysis buffer בריכוז 1x מהערכה והדגירו על קרח למשך 30 דקות.לאחר הדגירה, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 12,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. כדי לשקיע את שיירי התאים, העבירו 160 µL מהעלייה שנוצרה למבחנה נקייה, והקפיאו במהירות (flash freeze) את שאר העלייה באמבט של אתנול וקרח יבש לפני אחסנה בטמפרטורה של 80- °C לשימוש חוזר. לאחר מכן, קבעו את ריכוז החלבון בעלייה באמצעות בדיקת BCA סטנדרטית.עבור כל דגימה שנאספה, חשב את כמות החלבון הדרושה לבדיקה בהתאם לטווח העבודה של ערכת הטלומראז. מכיוון שהטלומראז הוא אנזים רגיש לחום, בטל את פעילותו של חצי מכל דגימה לשימוש כביקורת שלילית על ידי דגירה ב-85 degrees Celsius למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכן את עקומת הסטנדרט הכמותית על ידי דילול סדרה של תמיסת המקור.דללו את תמיסת המלאי של TSR Oligonucleotides פי חמישה ביחס של 1:5 באמצעות באפר ליזיס. ל-TSR Oligonucleotides רצף זהה לזה של פריימרים של טלומרים והם בריכוז ידוע. לאחר מכן, הכינו את תערובת המאסטר (master mix) המורכבת מ-12.5 µL של 2x quantitative telomerase detection premix ו-11.5 µL של מים בדרגת PCR לכל דגימה, וערבבו.לאחר מכן, העבירו בפיפט 24 µL של תערובת המאסטר (master mix) לכל מבחנה שבשימוש. לאחר חלוקת תערובת המאסטר, הוסיפו לבארות מיקרוליטר אחד (1 µL) מכל תבנית (template), שהיא עבור הסטנדרט, דגימה שעברה חימום והפעלה, או דגימה רגילה. לאחר מכן, אטמו את הפלטה באמצעות יריעת פלסטיק דביקה וערבבו את הדגימות באמצעות וורטקס (vortexing).לאחר מכן, העבירו אותם למערכת גילוי ה-real-time PCR. הגדירו את תוכנית ה-PCR כך שתתחיל ב-25 °C למשך 20 דקות. במהלך זמן זה, תתרחש תגובת הטלומראז.המשך ב-95 °C למשך 10 דקות עבור שלב ההפעלה הראשוני של ה-PCR. לאחר מכן בצע 40 מחזורים של 95 °C למשך 30 שניות, 60 °C למשך 30 שניות ו-72 °C למשך 30 שניות, כדי להגביר את תבניות הטלומרים שהוספו במהלך 20 הדקות ב-25 °C.לבסוף, הפעילו את התוכנית ואספו את ערכי מחזור הסף (threshold cycle) עבור כל דגימה. לאחר מכן, צרו עקומת סטנדרט באמצעות ערכי ה-CT והשתמשו בה כדי לחשב את פעילות הטלומראז בדגימות המוצגות.להלן תוצאות PCR בזמן אמת של נסיין בן 65. הגן של הטלומר, המיוצג על ידי הקווים האדומים הבהירים, מגיע לעקומה האקספוננציאלית לאחר כ-27 מחזורים. קבוצת הקווים השנייה מייצגת הגברה של גן בעל עותק יחיד, שקיים בעותק אחד בלבד בגנום, ולפיכך יש לו פחות עותקים מאשר לדגימות הטלומר המיוצגות על ידי הקווים האדומים.בנוסף, הגן בעותק בודד מגיע לעקומה האקספוננציאלית לאחר כ-31 מחזורים. הקווים החומים מייצגים את עקומת הסטנדרט עבור 33, המבוססת על דילול סדרתי של ריכוזי דגימה ידועים. עקומת הסטנדרט עבור הלוגריתם של הריכוז לעומת ערכי הסף מוצגת כאן.קו ישר מאשר כי המ 희לוש הסידורי נמדד ונטען במדויק. תוצאות אנליזת ה-real-time PCR משמשות לאחר מכן להערכת אורך הטלומרים. יחידה אחת של יחס בין טלומר לעותק גן בודד שקולה לאורך טלומר ממוצע של 4, 270 base pairs בלויקוציטים, ונתונים אלו מביאים ליחס של 0.87, המהווה ממוצע של 3, 715 base pairs ואורך בינוני עבור אדם בגיל זה.באמצעות תוצאות מבחני ה-quantitative real-time PCR, ניתן להבהיר את הקשר בין פעילות הטלומרים לבין היחס בין מספר עותקי הטלומר למספר עותקי גן בודד. גרף זה מראה קשר חזק בין שני המבחנים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההזדקנות לחקור סנסינציה (הזדקנות) תאית באורגניזמי מודל, בדמוגרפיה של חולים ובמערכות איברים.

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טלומראז מתבטא במוח היילוד וגם באזורים שונים במוח הבוגר. אנו מציגים מבחן TRAP לא רעיל שחוסך זמן לניתוח פעילות הטלומראז באזורים שונים במוח העכבר וזיהוי הבדלים בפעילות הטלומראז בין מוחות עכברים זכרים ונקביים.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

טלומרים וטלומראז ממלאים תפקידים חיוניים בהזדקנות ובגידולים. מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד ליצור שני אללים של טלומראז הניתנים להשראת עכברים וכיצד להשתמש בהם במחקרים על ניוון/התחדשות רקמות וסרטן.

ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג&#39;ל

כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לכימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנטי לא רדיואקטיבי, תוך התמקדות באופטימיזציה של פרמטרי ביצועים שונים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG, כגון כמויות חיץ וריכוזי בדיקה.

אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת אורך הטלומרים היחסי (TL) באמצעות בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית מונוכרום (MMqPCR). בדיקת MMqPCR היא שיטה חוזרת, יעילה וחסכונית למדידת TL מדנ"א אנושי במחקרים מבוססי אוכלוסייה.

מונוכרום מולטיפלקס כמותי PCR מדידת אורך טלומרים 

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט...

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

למדו שיטה יעילה וזולה למדידת אורך טלומרים ופעילות טלומראז בבעלי חיים שונים באמצעות qRT-PCR. השיטה מאפשרת לחקור את הקשר בין דינמיקת הטלומרים להזדקנות תאית ומחלות קשורות לגיל.

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

גלה סרטונים נוספים