סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ
11 במרץ 2013
סרטון זה מדגים את הנהלים משמשים לגידול תרביות ראשוניות של עוברי Xenopus עצב ותאי שריר והתועלת של תכשיר זה לביצוע הקלטות מהדקות סימולטניים לפני ואחרי-הסינפטי תיקון.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להוציא תרביות ראשוניות של נוירוניםC של העמוד השדרה המחוברים סינפטית ותאי שריר מעוברי xenopus. זאת מושגים תחילה על ידי השראת רבייה ב-xenopus באמצעות הזרקה של human chorionic gonadotropin לצפרדעים זכרים ונקבות ואיסוף ביצים מופרות. השלב השני הוא הסרת מעטפת הג'לי, העובר והקרומים מעוברי שלב 22.
בשלב הבא, מבודדים נוירונים של עמוד השדרה ושרירים מהעובריים, ומסירים את העור ומשליכים אותו. השלב האחרון הוא זריעה של התאים המבודדים לצלוחי תרבית ומתן אפשרות להיווצרות של צמתים עצביים-שריריים (neuromuscular junctions) תפקודיים. לבסוף, ניתן להוכיח קיומן של קשרי סינפסה תפקודיים באמצעות הקלטות patch clamp זוגיות סימולטניות מנוירונים ומתאי שריר בתרבית.
היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מניבה תכשיר סינפטי של חולית הנגיש בקלות. ניתן להשתמש בה כדי לנטר שחרור של מוליכים עצביים באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים פוסט-סינפטיים, תוך מדידה סימולטנית של הופעת יונים פרה-סינפטיים. יתרה מכך, השיטות ברורות ופשוטות, ואינן דורשות ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ דיסקציה, ולאחר מכן ניתן לאחסן את התרביות בטמפרטורת החדר בתוך תוצר תרבית פשוט.
הכנה זו עשויה להועיל במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית, כולל האופן שבו אירועים פרה-סינפטיים, ביוכימיים וביופיזיקליים מצומדים לשחרור מוליכים עצביים. בנוסף, היא שימושית גם לחקר נוירומודולציה, סינפטוגנזה ופלסטיות סינפטית. כדי להתחיל בהליך זה, הכין את התמיסות הנדרשות בהתאם למאמר המצורף. לאחר מכן, הכן לפחות שני כלי מיקרו-דיסקציה על ידי הדבקת סיכת מינוצ'ין (minuchin pin) לקצה של פיפטת זכוכית מסוג פסטייר.
בעזרת דבק אקרילי מסוג Sano, אפשרו לקצה החד של הסיכה לבלוט מעבר לקצה הפ pipette בכ-0.5 סנטימטרים. יומיים לפני הכנת התרביות, זהו זוג XUS שמוכן להרבייה על ידי התבוננות ב-aika אדום בולט בטופר של הנקבה ובפיגמנטציה כהה על המשטח המישורי של כפות הרגליים הקדמיות של הזכר. לאחר מכן, דגו כל צפרדע בעזרת רשת והחזיקו אותה כשהצד הבטני פונה כלפי מטה בכיור עם הרשת, כך שהיא תוכל להימלט.
הזריקו מיליליטר אחד של HCG דרך הרשת ובאופן תת-עורי לאחד משקי הלימפה הגביים כדי להבטיח שהחיות לא ידרסו את הביצים שהוטלו וההופרה לאחרונה. התקינו רצפה מסוננת עם גודל רשת של half inch, המותאמת לגובה של one to two inches בתחתית המיכל. לאחר מכן, הניחו את זוג הרביה יחד במיכל מים מכוסה בנפח של 10 gallon.
השאירו את הצפרדעים ללא הפרעה למשך 12 עד 48 שעות, עד שניתן יהיה להבחין בביצים מופרות על הרצפה מתחת לרשת. לאחר מכן, הוציאו את בעלי החיים מהמיכל, אך השאירו את הביצים ללא הפרעה למשך 24 שעות נוספות לפחות. ניתן להזרבית זוג צפרדעים זה שוב לאחר שש שבועות.
בשלב הבא, שחררו את העוברים מהתחתית של המיכל והעבירו אותם לארבעה או חמישה צלחות תרבית של 60 על 15 מילימטר המכילות 10%saline. מיינו את העוברים לפי שלב ההתפתחות בהתאם לסכמה של new coupe and Faber; עוברים בעלי מראה חלק עם גוונים בהירים של חום ולבן, כפי שמוצג משמאל, הם אידיאליים. לעומת זאת, עוברים בעלי כתמים שחורים או לבנים גדולים, כפי שמוצג מימין, הם בדרך כלל אינם בריאים ואינם ניתנים לשימוש.
בתוך מ supported-laminar flow hood, סמנו ומלאו עד למחציתם בערך צלחות תרבית סטריליות בקוטר 360 ומסוג 15 מילימטר עם 10% saline, וצלחת אחת עם CMF. בעזרת פיפט פסטור מזכוכית סטרילית, העבירו חמישה עד 10 עוברים בשלבים 22 עד 24 לאחת הצלחות המכילות 10% saline. תחת מיקרוסקופ סטריאו-זום בתוך המכסה, הסירו את מעטפת הג'לי ואת קרום הווללה (viel membrane) מכל עובר באמצעות שני זוגות פינצטות סטריליות. שטפו את העוברים החשופים על ידי העברתם אחד אחד דרך שתי הצלחות הנותרות של 10% saline, ולבסוף אל הצלחת המכילה CMF.
בשלב הבא, החזיקו כל עובר בעדינות אך בבטחון באמצעות פינצטה והשתמשו בכלי למיקרו-דיסקציה כדי להסיר את צינור העצבים ואת המיוטומים הנלווים, הנמצאים בחלק הגבי (dorsal) ביותר של בעל החיים. בצעו זאת על ידי ביצוע שלושה חתכים: אחד בכל קצה של מיקומו של צינור העצבים, וחתך שלישי ממש בוונטרלי (ventral) לו. לאחר מכן, העבירו כל מקטע של צינור עצבים ומיוטומים שבודדו לחלק נקי של הצלחת, הרחק מגבשושי החלמון ומפסולת אחרת.
לאחר כ-15 דקות ב-CMF, השתמש בפינצטה כדי להסיר את העור הפיגמנטרי מהרקמה שהודחקה והשלך את העור. לאחר 30 עד 60 דקות נוספות, התאים יצרו ערימה דמוית חול ככל שיתנתקו זה מזה. בהליך זה, הפשר מבחנה של 10 milliliter של תווך תרבית, לאחר מכן הוסף 70 microliters של ITS בריכוז 35 nanograms per milliliter, BDNF label ומלא את צלחות התרבית הסטריליות בנפח 35 millimeter בערך עד מחציתן בתווך תרבית L 15.
השתמשו בצלחת תרבית אחת עבור כל עובר ש dissection שלו בוצע. כדי להכין פיפט לזריעה, החזיקו את שני קצותיה של פיפט פסטורי מזכוכית והניחו את החלק המצר במגע עם להבה. לאחר מכן, משכו את הקצוות זה מהזה למרחק של כ-10 סנטימטרים.
לאחר מכן, שברו את הקצה כדי לקבל חוד של כ-0.2 מילימטרים. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת הזריעה כדי לשאוב את ערימת החול מעל עובר אחד. הקפידו למזער את כמות התמיסה הנשאבת.
בשלב הבא, פלט את התאים לתחתית של צלחת תרבית ופזר אותם במספר שורות. לאחר מכן, השאר את הצלחות עם התאים המפוזרים ללא הפרעה למשך 15 דקות לפחות, כדי לאפשר לתאים זמן להיצמד לצלחת. לאחר 12 עד 24 שעות בתרבית, התאים המפוזרים יפתחו מאפיינים מורפולוגיים מובחנים.
לדוגמה, תאי שריר מקבלים צורה של כישור ונוירונים של חוט השדרה מפתחים שלוחות ארוכות. ניתן לאשש קשר סינפטי תפקודי בין הווריקוסיטיות לבין תאי השריר באמצעות רישומי אלקטרופיזיולוגיה בזוגיות בו-זמנית. לשם כך, הכינו שתי אלקטרודות patch לרישום, אחת עבור הווריקוסיטיות הפרה-סינפטית ואחת עבור תא השריר.
לאחר מכן, מלא את האלקטרודה הפרה-סינפטית בתמיסה המכילה info terin ואת האלקטרודה הפוסט-סינפטית בתמיסה פנימית של אשלגן. לאחר מכן, החלף את המצע בצלחת התרבית ב-NFR. העבר את הצלחת למיקרוסקופ הפוך המצויד באופטיקה של ניגודיות פאזה (phase contrast), בצע patch של הבלט (varicosity) הפרה-סינפטי באמצעות האלקטרודה המכילה amphotericin ושל תא השריר הפוסט-סינפטי באמצעות האלקטרודה השנייה כדי לאשר את תפקוד הסינפסה, גרם לדפולריזציה של הבלט באמצעות מגבר patch clamp, וצפה בזרמים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים הסימולטניים.
איור זה מציג תצוגה בהגדלה של 5x של תאים ותרבית מיד לאחר הזריעה, וזוהי אותה תרבית בהגדלה של 40x. כאן מוצג המפגש העצבי-שרירי (neuromuscular junction) בתרבית, המראה את גוף התא העצבי (neuronal soma), את הבליטה הפרה-סינפטית (presynaptic varicosity) ואת תא השריר הפוסט-סינפטי. כאן מוצגים הזרמים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים.
בתגובה למדרגות מתח של 10 millivolt שהופעלו על הvaricosity הפרהסינפטי, ממינוס 30 millivolts ועד פלוס 40 millivolts, פוטנציאל ההחזקה עבור שני התאים היה מינוס 70 millivolts. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן להשלימה תוך כשעתיים. לאחר מכן ניתן לקבל תרביות תאים חיות תוך 24 שעות, וניתן לתחזק אותן במשך מספר ימים. תכשיר זה נמצא בשימוש כבר מספר שנים, ומסייע בהסברת חלק מהתכונות הבסיסיות של התמסורת הנוירו-שרירית.
תקוותנו היא שסרטון זה יאפשר את המשך הגילויים על ידי סיוע לחוקרים להכיר טוב יותר טכניקה רבת עוצמה ופשוטה זו.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את הפרוצדורות המשמשות לגידול תרביות ראשוניות של תאי עצב ותאי שריר עובריים של Xenopus. הכנה זו שימושיות לביצוע הקלטות patch clamp סימולטניות של קצוות פרה- ופוסט-סינפטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- עוברי Xenopus מהווים מודל בעל ערך לחקר הפיזיולוגיה של הסינפסים.
- תרביות ראשוניות מאפשרות לבחון צמתים עצביים-שריריים.
- הקלטות סימולטניות מספקות תובנות לגבי מנגנוני השחרור של מוליכים עצביים.
- הטכניקה נגישה ודורשת מינימום של ציוד ייעודי.
מטרת המחקר
- להשגת תרבייות ראשוניות של נוירונים של חוט השדרה ותאי שריר המחוברים סינפטית.
- לבחינת הקשרים התפקודיים בין נוירונים לתאי שריר.
- לחקר שאלות מפתח בפיזיולוגיה סינפטית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של רבייה בקרפדות Xenopus ואיסוף ביצים מופיות.
- בידוד נוירונים של חוט השדרה ותאי שריר מעוברים.
- זריעה של תאים מבודדים לצלחוני תרבית.
- הקלטות patch clamp זוגיות בו-זמנית מנוירונים ומתאי שריר.
תוצאות עיקריות
- ניתן להקים קשרים סינפטיים תפקודיים בתרבית.
- בתאי תרבית מתפתחים מאפיינים מורפולוגיים מובחנים.
- הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מאשרות פעילות סינפטית.
- ההכנה יעילה לחקר שחרור מוליכים עצביים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה פשוטה לחקר הפיזיולוגיה הסינפטית.
- היא מאפשרת לחקור נוירומודולציה ופלסטיות סינפטית.
- הטכניקה בעלת ערך למתן מענה לשאלות יסוד במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת שיתוף-תרבית זו של עצב-שריר ב-Xenopus מספקת מודל של חוליית חיים לחקר מנגנוני העברה סינפטית, ומאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות לגילוי נוירומודולטורים. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות סימולטניות, פרה- ופוסט-סינפטיות, מספקות נתונים כמותיים ומקושרים סיבתיות על תפקוד תעלות יונים ושחרור מוליכים עצביים, דבר התומך בביטחון חיזוי לגבי השפעותיהם של תרכובות מובילות על הפיזיולוגיה הסינפטית. הנגישות של ההכנה, התאימות לטמפרטורת החדר וההיווצרות המהירה של סינפסים מקלות על פיתוח בדיקות הניתנות להרחבה (scalable) לסריקה פנוטיפית של תרכובות המשפיעות על עירור נוירונלי או על פלסטיקה סינפטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות שילוב של מדידות זרם יוני פרה-סינפטי עם קריאות של שחרור נוירוטרנסמיטורים פוסט-סינפטיים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על השפעות של מודולציה של תעלות יונים על הפלט הסינפטי בהקשר של חולייתנים.
- ערך ניבוי: מספק תובנה מכניסטית לגבי האופן שבו מטרות מולקולריות משפיעות על התפקוד הסינפטי, ובכך מסייע במיון תיק מועמדים לנוירומודולטורים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצר סינפסות יציבות ופונקציונליות תוך 12–24 שעות, מה שמאפשר חלונות זמן מתאימים לסריקת תרכובות.
- פלט כמותי: מספק מדידות בו-זמניות של זרמים פרה-סנפטיים ופוסט-סנפטיים כנקודות קצה אלקטרופיזיולוגיות מתואמות לניתוח תגובה למינון.
- יכולת הרחבה ושימוש חוזר: עושה שימוש במצעי תרבית פשוטים ובשמירה בטמפרטורת החדר, מה שתומך בהתאמה לבארות מרובות ובשיתוף ריאגנטים בין פרויקטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את הביולוגיה של המעבר העצבי-שרירי בחולייתנים, וישים למחקרי הפרעות נוירו-מוסקולריות ודיספונקציה סינפטית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין מעורבות של מטרות מולקולריות (למשל, מודולטורים של תעלות יונים) לתוצאות סינפטיות תפקודיות, ובכך מספק מידע לחיזויים של יעילות פרה-קלינית.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר זיהוי מוקדם של השפעות לא ספציפיות (off-target) על ההעברה הסינפטית, ובכך מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים של פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מדדים מכניסטיים המנחים החלטות לגבי קידום התרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי קישור אירועים ביופיזיים פרה-סינפטיים (זרמי יונים) לתגובות פוסט-סינפטיות (שחרור נוירוטרנסמיטורים).
- סריקה: מספקת פלטים אלקטרופיזיולוגיים דו-פרמטריים הניתנים לשחזור, המתאימים לשילוב של patch clamp אוטומטי בסריקות בעלות תפוקה בינונית.
- אנליזה: מייצרת עקומות זרם פרה- ופוסט-סינפטיות מסונכרנות המאפשרות ניתוח קורלציה, קביעת IC50/EC50 ואפיון קינטי של השפעות תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מודולציה של תעלות יונים לשינויים בעוצמה סינפטית, ומספקת קריאה תפקודית המותאמת לסממנים ביולוגיים לצורך תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סינפטית של חולייתנים הניתנת לשימוש חוזר לסריקות איטרטיביות על פני מספר מחלקות של מטרות (למשל, תעלות יונים, GPCRs, רגולטורים של SNARE).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בפרמקולוגיה סינפטית על ידי אספקת מדידות פרה- ופוסט-סינפטיות ישירות וסימולטניות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושיחזוריות של הבדיקה באמצעות פרוטוקולי תרבית מוגדרים ויציבות בטמפרטורת החדר.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים אלקטרופיזיולוגיים מקושרים סיבתית, ובכך מגביר את הביטחון בתרגום של מעורבות המטרה (target engagement).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף תרכובות מותאם סיכון בהתבסס על השפעות מתוקפות על שחרור שלפוחיות סינפטיות ועירור פרה-סינפטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפירוק תאי מקור (primary cell dissociation), אלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp וטיפול ברקמות חולייתים.
- תלוי במערכות אלקטרופיזיולוגיות בעלות יכולת הקלטה בערוץ כפול ובמיקרו-מניפולטורים לצורך התמקדות בזוגות של נוירון-שריר.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי התפתחות העוברים, עיתוי הנתיחה ותנאי התרבית בין המשתמשים השונים כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- התאמה למודלים הרלוונטיים למחלה עשויה לדרוש הפרעה גנטית או פרמקולוגית של עוברי Xenopus כדי לחקות פתופיזיולוגיה אנושית.
- מוגבל למחקרי סינפסה אקוטיים (מספר ימים לאחר הזריעה) בשל מגבלות של צמיחת יתר, מה שמחייב ביצוע ניסיוני בעיתוי מדויק.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Pre-experimental Preparation
3:24
Microdissection of Xenopus embryos
4:51
Preparation of Nerve-muscle Co-cultures
5:52
Patch Clamping Nerve-muscle Synapses
7:02
Results: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures
7:36
Conclusion
