סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ Xenopus עצבי שרירי Co-תרבויות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג תרביות ראשוניות של נוירונים ותאי שריר בעמוד השדרה המחוברים סינפטית מעוברי קסנופוס. זה מושג על ידי השראת רבייה תחילה בקסנופוס על ידי הזרקת כוריוני אנושי בטרופין לצפרדעים זכרים ונקבות כאחד ואיסוף ביצים מופרות. השלב השני הוא הסרת מעיל הג'לי והפאטל והממברנות מעוברי שלב 22.

לאחר מכן, תאי עצב ושרירים בעמוד השדרה מבודדים מהעוברים, והעור מוסר ומושלך. השלב האחרון הוא צלחת התאים המבודדים לצלחות תרבית ולאפשר היווצרות צמתים עצביים-שריריים פונקציונליים. בסופו של דבר, ניתן להדגים קשרים סינפטיים פונקציונליים באמצעות הקלטות מהדק טלאי מזווג בו זמנית מנוירונים ותאי שריר בתרבית.

היופי בטכניקה זו הוא שהיא מניבה תכשיר סינפטי נגיש לחולייתנים. ניתן להשתמש בו כדי לנטר שחרור נוירוטרנסמיטר עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות פוסט-סינפטיות ובמקביל מדידת התרחשות יונים פרה-סינפטיים. יתר על כן, השיטות ברורות ופשוטות, אינן דורשות ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ מנתח, ולאחר מכן ניתן לאחסן את התרביות בטמפרטורת החדר במדיום תרבית פשוט.

הכנה זו יכולה להיות שימושית במענה על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית, כולל כיצד אירועים פרה-סינפטיים, ביוכימיים וביופיזיים משולבים עם שחרור נוירוטרנסמיטורים. בנוסף, זה שימושי גם לחקר נוירומודולציה סינפטוגנזה ופלסטיות סינפטית כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את הפתרונות הנדרשים על פי כתב היד הנלווה. לאחר מכן ייצרו לפחות שני כלי חיתוך מיקרו על ידי הדבקת סיכת מינוצ'ין לקצה פיפטה מזכוכית.

בעזרת דבק אקרילי של סנו, אפשר לקצה החד של הסיכה להשתרע מעבר לקצה הפיפטה כ- 0.5 סנטימטרים. יומיים לפני הכנת התרביות, זהו זוג XUS מוכן לרבייה על ידי התבוננות באייקה טופר אדמדם בולט על הנקבה ופיגמנטציה כהה על פני השטח המישוריים של הכפות הקדמיות של הזכר. לאחר מכן, רשת כל צפרדע והחזק את הצד הגחוני שלה כלפי מטה בכיור עם הרשת כדי שתוכל לברוח.

יש להזריק מיליליטר אחד של HCG דרך הרשת ובאופן תת עורי לתוך אחד משקי הלימפה הגביים כדי להבטיח שבעלי החיים לא ירמסו את הביצים שזה עתה הוטלו והופרו. התקן רצפה מוקרנת בגודל רשת של חצי אינץ' המותקנת בסנטימטר עד שני סנטימטרים בתחתית המיכל. לאחר מכן הניחו את זוג הרבייה יחד במיכל מים מכוסה של 10 ליטר.

השאירו את הצפרדעים ללא הפרעה למשך 12 עד 48 שעות עד שנצפו ביצים מופרות על הרצפה מתחת למסך. לאחר מכן הוציאו את בעלי החיים מהמיכל, אך השאירו את הביצים ללא הפרעה למשך 24 שעות נוספות לפחות. ניתן לגדל את זוג הצפרדעים הזה לאחר שישה שבועות.

לאחר מכן, שחררו את העוברים מתחתית המיכל והעבירו אותם לארבע או חמש צלחות תרבית בגודל 60 על 15 מילימטר המכילות 10% מלח. מיין את העוברים לפי שלב לפי התוכנית של עוברי קופה ופאבר חדשים בעלי מראה חלק עם דוגמנות בהירה, חומה ולבנה כמו אלה משמאל הם אידיאליים. מצד שני, עוברים שיש להם כתמים שחורים או לבנים גדולים כמו אלה שבצד ימין הם בדרך כלל לא בריאים ולא שמישים.

בתוך תווית קולט אדים למינרית וממלאים כמחצית הדרך צלחות תרבית סטריליות בגודל 360 על 15 מילימטר עם 10% מלח ואחת עם CMF. באמצעות פיפטה סטרילית מזכוכית מעבירה חמישה עד 10, שלב 22 עד 24 עוברים לתוך אחד הכלים המכילים 10% מלח עם שמונה של מיקרוסקופ מנתח זום סטריאו בתוך מכסה המנוע, הסר את שכבת הג'לי ואת קרום הוויל מכל עובר באמצעות שני זוגות מלקחיים סטריליים. שטפו את העוברים החשופים על ידי העברתם בזה אחר זה דרך שני הכלים הנותרים של 10% מלח, ולבסוף לתוך הכלי המכיל CMF.

לאחר מכן, החזיקו כל עובר בעדינות אך בחוזקה עם זוג מלקחיים והשתמשו בכלי המיקרו-דיסקציה כדי להסיר את הצינור העצבי ואת המיוטומים הנלווים, הממוקמים בהיבט הגבי ביותר של החיה. עשו זאת על ידי יצירת שלוש פרוסות, אחת משני קצות המיקום של הצינור העצבי ושלישית רק גחונית אליו. לאחר מכן העבירו כל מיוטום צינור עצבי מנותח לחלק נקי של המנה הרחק מגרגירי החלמון ופסולת אחרת.

לאחר כ-15 דקות ב-CMF, השתמש במלקחיים כדי להרים את העור הפיגמנטי מהרקמה המנותחת ולהשליך את העור. לאחר 30 עד 60 דקות נוספות, התאים ייצרו ערימת חול כשהם מתנתקים זה מזה. בהליך זה, יש להפשיר שפופרת של 10 מיליליטר של מדיום תרבית, לאחר מכן ב-70 מיקרוליטר של ITS ב-35 ננוגרם למיליליטר, תווית BDNF ולמלא את כלי התרבות הסטריליים של 35 מילימטר בערך באמצע הדרך במדיום תרבית L 15.

השתמש בצלחת תרבית אחת לכל עובר שניתחת. כדי לייצר פיפטת ציפוי, החזיקו את שני הקצוות של פיפטה דביקה מזכוכית והניחו את החלק המחודד על להבה. ואז משוך את הקצוות לכ -10 סנטימטרים.

לאחר מכן נתק את הקצה כדי להיכנע לקצה של כ- 0.2 מילימטרים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה הציפוי כדי למצוץ את ערימת החול מעובר אחד. הקפד למזער את כמות התמיסה שנמשכה.

לאחר מכן, הוציאו את התאים לתחתית צלחת תרבית וצלחו אותם למספר שורות. לאחר מכן השאירו את הכלים של תאים מצופים ללא הפרעה למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לתאים זמן להיצמד למנה. לאחר 12 עד 24 שעות בתרבית, תאים מצופים יפתחו מאפיינים מורפולוגיים מובהקים.

לדוגמה, תאי שריר הופכים לצורת ציר ונוירונים בעמוד השדרה מפתחים תהליכים ארוכים. ניתן לאשר מגע סינפטי תפקודי בין שתן, דליות ותאי שריר באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים זוגיים בו זמנית. לשם כך, הכינו שתי אלקטרודות תיקון להקלטה, אחת לדליות הקדם-סינפטיות ואחת לתא השריר.

לאחר מכן מלאו את האלקטרודה הפרה-סינפטית בתמיסה המכילה טרין מידע ואת האלקטרודה הפוסט-סינפטית בתמיסה פנימית של אשלגן. לאחר מכן, החלף את המדיה בצלחת התרבות ב- NFR. לאחר מכן העבירו אותו למיקרוסקופ הפוך המצויד באופטיקה של ניגודיות פנים, טלאו את הדליות הקדם-סינפטיות עם האלקטרודה המכילה אמפוטריצין ואת תא השריר הפוסט-סינפטי עם האלקטרודה השנייה כדי לאשר את הפונקציונליות של הסינפסה, דה-פולריזציה של הדליות עם מגבר מהדק טלאי, והתבוננו בזרמים הפרה-סינפטיים והפוסט-סינפטיים בו זמנית.

איור זה מציג תצוגת עוצמה של פי חמישה של תאים ותרבית מיד לאחר הציפוי, וזו אותה תרבית ב-40 x. הנה הצומת העצבי-שרירי בתרבית, המראה את תא השריר העצבי, הפרה-סינפטי, הדליות והפוסט-סינפטי. מוצגים כאן הזרמים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים.

בתגובה ליישום של צעדי מתח מצטברים של 10 מילי-וולט שהוצגו לדליות הפרה-סינפטית ממינוס 30 מילי-וולט לפלוס 40 מילי-וולט, פוטנציאל ההחזקה של שני התאים היה מינוס 70 מילי-וולט לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשעתיים. לאחר מכן ניתן להשיג תרביות תאים ברות קיימא תוך 24 שעות וניתן לשמור עליהן למשך מספר ימים. תכשיר זה כבר נמצא בשימוש כבר מספר שנים, ועוזר להסביר כמה מהתכונות הבסיסיות של העברה עצבית-שרירית.

אנו מקווים שהסרטון הזה יאפשר את המשך הגילוי בכך שיסייע לחוקרים להכיר טוב יותר את הטכניקה העוצמתית והפשוטה הזו.