Name: ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למד שיטה לבידוד סיבי שריר שלד מעוברים וזחלים של דג הזברה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מורפולוגיה של סיבי שריר בודדים ולוקליזציה של חלבונים תוך-תאיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לחברים במעבדה דאולינג (אהרון Reifler, טרנט וו, אנג&#39;לה באסטה, וויליאם טלפר) שתרמו לפיתוח של הטכניקה ולייצור של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מכון טאובמן, המחלקה לרפואת הילדים באוניברסיטת מישיגן, ובחלק ממענקים מניוון השרירים האגודה (JJD MDA186999) והמכונים הלאומיים לבריאות (JJD 1K08AR054835).

1. Coverslips הכנת פולי-L-ליזין מצופה (זמן: 1 שעות) coverslips הציפוי מאפשר ליישוב myofiber מהיר והידבקות. זה עשוי להתבצע במהלך שלב הניתוק של בידוד myofiber (שלב 2 להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור ולמקם Parafilm על החלק התחתון של צלחת פטרי 60 מ&quot;מ (מותג כלשהו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו תלושי לכסות מיקרוסקופ זכוכית (בקוטר מ&quot;מ 12) על Parafilm בצלחת תרבית רקמת 60 מ&quot;מ או למקם אותם באופן אישי בבארות בודדות של 24 גם צלחות. </li></ol> הערה 1: coverslips העגול הקטן אלה מסייעים להתרכז מספרי myofiber ולצמצם את השימוש בנוגדנים עודף. הערה 2: coverslips גודל אחר יעבוד, עם זאת, הכמויות של חומרים כימיים ועוברים המשמשים צריכים להיות בהתאם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50-200 μl של פתרון poly-L-ליזין (0.01%) על כל מכסה זכוכית בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את coverslips לשבת לפחות אחד הוur ב 37 ° C. incubations יותר לא להשפיע לרעה על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר-L-ליזין פולי פתרון ממכסה הזכוכית ולשטוף פעמיים עם מינימום של 100 PBS μl 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר coverslips לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips מוכן לmyofibers עכשיו. </li></ol> הערה 3: כדי להבטיח סטריליות, ציפוי יכול להיעשות במכסת מנוע ועל coverslips autoclaved. הערה 4: שמור על צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם Parafilm בתחתית. התקנה זו תשמש במהלך ציפוי myofiber וimmunolabeling (מאוחר יותר צעדים). 1 אלטרנטיבי: במקום coverslips הציפוי מייד לפני השימוש, ניתן להשתמש בם מניית coverslip מצופה. צלחת 60 מ&quot;מ פטרי המכילה מינימום של 2 מיליליטר פולי-L-ליזין יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס המכילה coverslips רב. עם חלופה זו מתחילה בצעד 1.5 לעבד את coverslips לmyofibers. חלופה 2: אנחנו גם coverslips מעיל בפולי-L-ornithine. Tשלו הוא יותר עבודה אינטנסיבית, אבל הוא שימושי עבור culturing לטווח ארוך יותר, כי coverslips מצופה פולי-L-ornithine יכול להיות UV שטופל. עם טיפול UV וטכניקה סטרילית זהירה בדרך כלל יכול להישמר myofibers החי בתרבות מן 4-7 ימים. 2. דיסוציאציה של עוברי דג הזברה וציפוי של myofibers (זמן: 1 עד 3 שעות) הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי הטוב ביותר חל עד 3 DPF (לאחר ימי הפריה) עוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי דג הזברה לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר סטנדרטי ולהסיר כמה שיותר מים דגים עודפים ככל האפשר. בדרך כלל, ניתן להשתמש בם 10-20 עובר לכל צינור, אם כי פחות. באמצעות יותר מ 20-25 עוברים לעתים קרובות תוצאות בהכנה של צפיפות יתר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר chorions לפני הניתוק, באופן ידני באמצעות # 5 מלקחיים. לחלופין, ההסרה סיסית כימי מושגת עם טיפול Pronase 10-15 דקות. בדרך כלל, ההסרה הקודמת של סיסית נחוצה רק כאשר אישור מראש של mutפנוטיפ או מורפולוגיה נמלה נדרש, או בעת שימוש בשלבים שבו עוברים הם בקעו באופן טבעי מהסיסי שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 900 μl של CO 2 תקשורת עצמאית לצינור המכיל את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של collagenase הסוג השני 100 μl, ריכוז 3.125 מ&quot;ג / מיליליטר סופי (פתרון collagenase המלאי ב31.25 מ&quot;ג / מיליליטר מדולל ב 1x PBS) להתחיל דיסוציאציה. גם Collagenase IV יכול לשמש לדיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב עוברים על שייקר מסלולית, וtriturate כל 30 דקות ב RT באמצעות Pipetman P1000 לטחינה הדקה. </li></ol> הערה 2: לפקח על ניתוק עובר בזהירות; מעל או מתחת לניתוק (בעיקר יותר) הן הסיבות הנפוצות ביותר לכישלון פרוטוקול. פעמים לעיכול משתנות בהתאם לעוצמת טחינה דקה, מספר עוברים לכל צינור, וגיל העוברים. כמו כן, לעתים קרובות פחות (בהשוואה לסוגים פראיים) לעוברים ממוטציות שרירי שלד. פתק3: זמן עיכול הממוצע לגיל עובר: DPF 1 = 1 שעות, 2 DPF = 1.5 שעות, 3 DPF = 2 שעות, וDPF 4 = 2-2.5 שעה. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול כאשר לא כל עוברים גלויים, עדיין חתיכות מוצקות עדיין גלויות - זה חיוני כדי למנוע overdigestion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות עם עוברים ניתק ב0.8-2.3 XG במשך 3-5 דקות לתאי גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתאי pelleted ולשטוף 2x עם CO 2 תקשורת עצמאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת CO הטרי 2 תקשורת עצמאית לresuspend תאים. 1 מיליליטר משמש בדרך כלל לpreps של 10-20 עוברים. הנפח וניתן לשנותם מבוסס על מספר עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000, עובר השעיה עובר דרך מסנן 70 מיקרומטר. זה מסייע להסיר פסולת לא רצויה מההכנה. </li></ol> הערה 4: השעיה עובר יכולה להיות מסוננת בפעם שנייה דרך מסנן 40 מיקרומטר כדי להסיר פסולת לא רצויה נוסף. מסינון כפול, התאוששות היא approximately 800 μl מנפח התחלתי של 1 מיליליטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 50-100 μl של ההשעיה myofiber לכל coverslip מצופה פולי-L-ליזין. </li></ol> הערה 5: ביצוע שלב 2.9 בצלחות פטרי עם Parafilm על הקרקעית, שהוכן קודם לכן. Parafilm שומר ההשעיה myofiber את ההפעלה מcoverslips המצופה. שמור על צלחות פטרי מכוסות כדי למנוע אידוי. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר myofibers ליישב כ 1 שעות על coverslips המצופה בטמפרטורת חדר. </li></ol> הערה 6: myofibers יתחיל להתיישב בתוך 5-10 דקות. עם זאת, עבור קובץ מצורף myofiber טוב, מינימום של 1 שעות (1-2 hr) מומלץ. מאפשר myofibers להסתפק עוד לא יפגע בהכנה. לincubations יותר (כולל בלילה), ניתן להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת. עם אנטיביוטיקה וטכניקה סטרילית בדרך כלל יכולות להישמר תרבויות חיות עבור 1-2 ימים. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ &#39;בשידור חיyofibers ניתן לצפות בשלב זה. Myofibers מעוברים 2 DPF ומאוחר יותר יהיה לראות כתאים מפוספסים ומוארכים (איור 1). בשלב זה, myofibers מוכן לניתוח בשידור חי או לimmunolabeling עכשיו. </li></ol> באור 7: שריר שלד מ1 DPF עוברים אינו צלחת סיבים מוארכים וכברור מפוספסים. במקום זאת, myoballs הגדול גלוי. בנוסף, במהלך לאחר ניתוק שלב pelleting (שלב 2.6), 1 DPF myoballs צריך להיות centrifuged למינימום של 8 דקות בXG 5,000 להשיג גלולה. לניתוח של עוברים בשלב זה, מומלץ להשתמש בקו המהונדס להביע EGFP במיוחד בשרירי שלד 23. זה יאפשר זיהוי של תאים ממקור שריר לעומת מקורות אחרים. 3. הקרינה Immunostaining של myofibers דג הזברה הניתק (זמן: כ יום 1) 3.1. Immunolabeling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חלק שלתקשורת מmyofibers דבק coverslip המצופה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים באמצעות paraformaldehyde 4% או מתנול. לPFA, להסיר ½ נפח התקשורת ולהחליף עם אותה הכמות של PFA. תקן עבור 10 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר נפח כולל, להחליף עם 50-100 μl של PFA, ולתקן עבור נוספת 10 דקות. לקיבעון אלכוהול, מתנול קר כקרח או אצטון יכול להיות מיושם על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או 5 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף myofibers לפחות 3-5x עם 1x PBS או 1x PBS בתוספת Tween .0.1%. ממוצע לשטוף נפח 50-100 μl לכל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חסימת פתרון לmyofibers (עובד מלאי) ודגירה 20-60 דקות בטמפרטורת חדר. פתרון חסימה משתנות בהתאם לנוגדנים הראשוניים ומשניים. שני הנפוצים ביותר בשימוש במעבדה הם (1) 1x PBS, 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, 1% בסרום כבשים, 0.25% טריטון סופיים X-100 ו (2) X-100, 2 מ&quot;ג / מיליליטר טריטון 0.2% (0.2 % BSA) ו -5% בסרום כבשים / עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חסימת פתרון ולהוסיף נוגדנים עיקריים מדוללים או בנעילת פתרון או PBS. דגירה myofibers הלילה בשעה 4 ° C. הקפד גם Parafilm או לעטוף בניילון נצמד את צלחת פטרי המכילה coverslips טעון myofiber מצופה בנוגדן. חתיכות קטנות של מגבת נייר טבולה ניתן להוסיף ליצירת תא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן ראשוני מcoverslips ולשטוף coverslips 3-5x למשך 5 דקות עם PBS או פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים משני בריכוז מתאים בדילול מלא ב1x PBS או פתרון חסימה ל1-2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדנים משני ולשטוף myofibers 3-5x בPBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. </li></ol> 3.2. coverslips הרכבה <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1-2 טיפות של מגיב antifade לשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בזהירות את coverslip המצופה וimmunolabled באמצעות מלקחיים ומקום (myofibers למטה) coverslip על מגיב antifade בשקופית מיקרוסקופ. </li></ol> הערה 1: שימו לב לכיוון של גcoverslip oated הוא קריטי. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1-2 Kimwipes על משטח מוצק קשה. במהירות להפוך את השקופיות עם coverslips המצופה נח על מגיב antifade ולמקם אותו (coverslip למטה) על Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ אור לפינות של שקופית מיקרוסקופ כדי להסיר antifade העודף וליצור חותם חזק בין השקופיות וcoverslip </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לantifade שנותר לו להתייבש במשך 5-10 דקות ב RT, אז myofibers מוכן לתמונה (2A דמויות ו-B) או בחנות ב 4 ° C. </li></ol> 4. סידן הדמיה של תא חי באמצעות GCaMP3 ניתן לבצע ניסויי תא חיים בmyofibers לפני הקיבוע (בעקבות צעד 2.10). הפרוטוקול הבא מתאר הדמיה לחיות בmyofibers להביע 24 GCaMP3, מחוון סידן מקודדים גנטי, המתבטא על ידי האמרגן שרירי שלד הספציפי דג הזברה α-אקטין (pSKM) 23. לחלופין,בטכניקה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש צבעי מחוון סידן כגון פורע-2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עובר עם pSKM: GCaMP3 לבנות בשלב 1-2 התאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב3 DPF, לאסוף זחלים ולהכין myofibers כמפורט בסעיפים 1 ו -2. לאפשר myofibers לדבוק למינימום של 1 שעה. לטכניקה זו, coverslips מכין במנות 24 גם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל תקשורת עודפת, ולהוסיף 300 μl של תקשורת העצמאית הטרי CO 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה. myofibers החיובי GCaMP3 צריך להיות גלוי תחת הקרינה ירוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המצלמה להקלטה, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון קפאין 30 מ&quot;מ בCO 2 תקשורת עצמאית. כדי לעורר את התאים, בעדינות פיפטה 300 μl של פתרון קפאין לתוך הבאר בהגדלה. בתוך 5-10 שניות, myofibers החיובי GCaMP צריך להגיב לקפאין עם גידול מהיר בקרינה (איור 3). MyofibERS עשוי גם להתכווץ. ראוי לציין, קפאין גורם לשחרור סידן מחנויות reticulum sarcoplasmic 25. סוכנים אחרים, כגון KCl 26 וryanodine 4, יכולים לשמש כדי לחקור שחרור סידן מתנהלת. </li></ol>

<ol><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li>
<li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+myoplasmic+gap%3A+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li>
<li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Nerve%22%5BJournal%5D)">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li>
<li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%3A+structure%2C+expression%2C+molecular+details%2C+and+function+in+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity%3A+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+myofibril+assembly%3A+integrins+pave+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystroglycan%3A+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li>
<li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li>
<li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myopathies%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li>
<li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Zebrafish+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease%3B+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li>
<li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling%2C+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li>
<li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene%2C+CACNB1%2C+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li>
<li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((accordion%2C+a+zebrafish+behavioral+mutant%2C+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2%2B+pump+SERCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li>
<li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li>
<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים.

דג הזברה הוא מודל למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה ללימוד פיתוח שרירים ובתפקוד ב25,27,28 vivo. גם הם צמחו כנכס בעל ערך לדוגמנות מחלות שריר אנושי 14,15,20,29. אמנם ננקטו צעדים גדולים כדי לקדם את השימוש ויישום של דג הזברה לחקר תפקוד שרירים ומחלות שריר, יש צורך קריטי מתמיד כדי לפתח כלים שיאפשר יותר בניתוח מעמיק שמחמאות הגנטיות, מורפולוגיים, התנהגותיים ותפקודיים דג הזברה יתרונות כבר מציע 17. לכן יש לנו להתאים ופיתחו טכניקה פשוטה וחזקה לאפיון של my...

שריר שלד הוא רקמה מאוד מיוחדת אחראית ליצירת כוחות ההתכווצות הכרחיים לתנועתיות. התכווצות היא יזם באמצעות תהליך המכונה צימוד עירור והתכווצות (EC) שממיר את אותות חשמליים לשחרור סידן מחנויות תאית 1,2. שחרור סידן תוך תאי מפעיל את sarcomere לקצר וליצור כוח. הרכיבים ספציפיים הרבים של המכונות מולקולריות האחראים לתיווך צומת neuromuscular שידור 3, צימוד EC 4,5, והתכווצויות תלויות יקטין שרירן 6 ימשיכו להיות הנושא המתמשך של מחקר אינטנסיבי. בנוסף, חלבונים שמייצבים את קרום השריר במהלך 7,8 ההתכווצות לתווך שאיתות בין myofiber והמטריצה ​​תאית 7,9 זוהו ונחקרו בפירוט רב. מוטציות במספר גנים חשובים למבנה שרירפונקצית nd זוהה כגורמים למחלות שריר שלד אנושיים <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">(http://www.musclegenetable.org/).</a> מחלות אלו, מסווגים רחב כmyopathies שלד וניוון שרירים המבוססים על מאפיינים קליניים וhistopathologic, קשורות לחולשת שרירים, נכות לכל החיים, ו10,11 תמותה המוקדם. דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מצטיינת לדוגמנות ולומד מחלות שריר שלד אנושיות 8,12,13. זה כבר מועסק כדי לאמת את המוטציות גנטיות חדשות 8, מגדיר את ההיבטים חדשים של הפתופיזיולוגיה המחלה 14,15, ולזהות גישות טיפוליות חדשות 15,16. כוחו של דג הזברה לחקר מחלת שריר אדם מתייחס למספר רב של צאצאים, ההתפתחות המהירה של מבנה שריר ותפקוד, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה, ואת הקלות של מניפולציה גנטית ותרופתית של הזברה מתפתחתדגים 17. אנו ואחרים 12,18,19 לאחרונה פיתחנו טכניקה פשוטה לבידוד המהיר ויעיל של myofibers מדג הזברה מתפתחת. מתודולוגיה זו אפשרה הבחינה של myofibers בפירוט רב יותר מאשר יכול להיות מסופק על ידי ניתוח עובר שלם. הטכניקה נוצלה לאפיון של לוקליזציה subcellular חלבון 20 כמו גם לזיהוי מאפייני histopathologic חשובים כחלק ממחקרי אימות במודלים של מחלה חדשה שפותחו 21. יתר על כן, myofibers המבודד יכול בנוסף לשמש הדמיה חיות וללימודי אלקטרו 22, טכניקות שתאפשרנה החקירה של היבטים מרכזיים של תפקוד שרירים. הפרוטוקול הספציפי לבידוד myofiber, יחד עם שתי דוגמאות של ניסויים האנליטי שלאחר מכן, הוא מפורט בחלקים הנותרים של כתב היד הזה.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית 24 בארות</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 מדיום עצמאי</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>LS004186</td><td>לוט 41H12764</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג IV</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m מסנן</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m מסנן</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-&אלפא;-אקטינין</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Alexa Fluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>פישרברנד</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין</td><td>סיגמא</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>קפאין</td><td>סיגמא</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

דג הזברה הוכיחה להיות מערכת מודל יקרת ערך לחקר תפקוד שרירי שלד ולחקר מחלות שריר אנושיים. למרות יתרונות רבים המוצעים על ידי ניתוח vivo של שרירי שלד בדג הזברה, לדמיין את סביבת החלבון המורכבת והמחוטב האחראי על תפקוד שרירים, במיוחד בכל עוברים, יכול להיות בעייתי. הפרעה זו נובעת מגודלו הקטן של שרירים שלד דג הזברה (60 מיקרומטר) ואת הגודל קטן עוד יותר של sarcomere. כאן אנו מתארים ולהדגים שיטה פשוטה ומהירה לבידוד myofibers שלד מעוברים וזחלי דג הזברה. אנו גם פרוטוקולים הממחישים טכניקות הכנת הודעה שימושיות לניתוח מבנה שרירים ובתפקוד. באופן ספציפי, אנחנו פירוט הלוקליזציה הבאה immunocytochemical של חלבוני שריר שלד והניתוח איכותני של שחרור סידן מגורה באמצעות הדמיה סידן תא חי. בסך הכל, בסרטון וידאו זהמאמר מספק שיטה ישר קדימה ויעילה לבידוד והאפיון של myofibers שלד דג הזברה, טכניקה המספקת צינור ללימודים שלאחר מכן מספר עצום של מבנה שריר ותפקוד.

immunolabeling ניאון של myofibers (איור 2) תמונות מראים דפוס ניאון תיוג צפוי מmyofibers immunostained לאחר בידוד וציפוי מוצלחים. Myofibers סומן בתווית עם או קולט אנטי ryanodine (1:100) (איור 2 א) או אנטי-α-actinin (1:100) (איור 2) נוגדנים, ולחשוף immunostaining של השלישייה וZ-להקת בהתאמה. נוגדנים משני השתמשו היו אלקסה פלואוריד 555 (1:500). תמונות שנתפסו ...

דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcellular חלבון, ופיזיולוגיה של שרירים.

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ביעילות סיבי שריר שלד מדגימי דג זברה בשלבי העובר והזחל. הדבר מתבצע תחילה על ידי הכנת לוחות כיסוי מצופים ב-poly L lysine, ולאחר מכן, בין יום אחד לארבעה ימים לאחר ההפריה, מבוצע פירוק (dissociation) של עוברי דג הזברה. לאחר מכן, סיבי שריר (myo fibers) שבודדו מהעוברים המפורקים נזרעים על לוחות הכיסוי המצופים ב-polylysine.לבסוף, סיבי השריר (myo fibers) מקובעים, נצבעים ומצולמים לצורך ניתוח של חלבוני שריר. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות לוקליזציה סוב-סלולרית של חלבוני שריר באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח של עובר שלם, הוא שהיא מאפשרת לחקור את המורפולוגיה והפיזיולוגיה של סיב שריר בודד בפירוט רב יותר.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השרירים, כגון שאלות הנוגעות למיקום תת-תאי של חלבונים, וניתן לשלב אותה עם דימות סידן בתאי חיים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על תיקוף של מודלים של דגי זברה למחלות שרירים, מכיוון שניתן להשתמש בה להדמיה של חריגות מבניות פתוגנומוניות הקשורות למחלות בבני אדם. כמו כן, ניתן להשתמש בה כדי לסייע בזיהוי היבטים חדשים של מחלות שרירים.פתוגנזה באמצעות שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מבנה השריר ותפקודו. ניתן ליישמה גם במחקרים אחרים, כגון מחלות שריר השלד בבני אדם. כדי להכין את העוברים של דג הזברה לדיסוציאציה, הכינו כיסית זכוכית על ידי חיתוך והנחה בבסיסו של כלי פטרי בנפח 60 מילימטר.לאחר מכן, הניחו כיסויי זכוכית על נייר סופג וטפטפו 50 עד 200 µL של תמיסת poly lysine על כל כיסוי. דגרו את כיסויי הזכוכית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לפחות, לפני הסרת תמיסת ה-polylysine ושטיפתם פעמיים עם 100 µL של PBS. הניחו לכיסויי הזכוכית להתייבש, ואז אחסנו אותם בכלי סגור.עבור דיסוציאציה של עוברים. העבירו עוברי דג זברה בבני 10 עד 23 ימים לאחר ההפריה למבחנה סטנדרטית של 1.5 milliliters לצנטריפוגה והסירו כמה שיותר מימי דגים עודפים. העבירו בפיפטה 900 µL של מצע עצמאי פחמן דו-חמצני לתוך המבחנה.לאחר מכן, הוסף 100 µL של collagenase, two or four בריכוז של 3.125 mg/mL כדי להתחיל את הדיסוציאציה. סובב את העוברים במנער אורביטלי בטמפרטורת החדר, ובכל 30 דקות השתמש בפיפט P1000 כדי לבצע טריטורציה לדגימה למניעת עיכול יתר, עד שלא נראים עוד עוברים שלמים אך עדיין קיימים חלקים מוצקים. עצור את התגובה על ידי השקעת הדגימות ב-0.8 עד 2.3 ×g למשך שלוש עד חמש דקות.הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף פעמיים עם מצע גידול שאינו תלוי בדו-תחמוצת הפחמן. העבר את התרחיף דרך מסנן של 70 µm כדי להסיר שאריות, והעבר כ-50 עד 100 µL של תרחיף סיבי שריר לכל לבישת זכוכית (cover slip) מצופה ב-poly L lysine. אפשר לסיבי השריר לשקוע במשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר קיבוע וסימון אימונולוגי של סיבי השריר בהתאם לפרוטוקול המופיע בטקסט, בצע הרכבה (mount).סגרו את התכניות על ידי טפטוף של טיפה אחת עד שתיים של ריאגנט Antifa על סלייד. השתמשו בפינצטה כדי להרים בזהירות תכנית, הפכו אותה והניחו אותה על טיפות ריאגנט ה-anti fade על סלייד המיקרוסקופ. לאחר מכן, הניחו נייר סופג אחד עד שניים על משטח קשיח ומוצק והפכו במהירות את הסלייד על גבי הנייר.הפעל לחץ קל על פינות הזכוכית כדי להסיר עודפי ריאגנט Antifa וליצור איטום הדוק בין הזכוכית לכיסוי. הנח לזכוכיות להתייבש במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה, או אחסן אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כפי שמוצג כאן, סיבי שריר המסומנים פלואורסצנטית באמצעות אימונו-צביעה נגד ה-anodyne receptor ונגד alpha actinin חושפים את ה-triad ואת ה-zand בהתאמה.במחקרים קודמים השתמשנו בסיבי שריר מבודדים (myop fibers) כדי לקבוע את הלוקליזציה התת-תאית של חלבוני שריר. זאת כדי לחקור את הלוקליזציה של טרנסגנים כימריים מבוטאים ולהגדיר פרמטרים ספציפיים של סיבי שריר, כולל גודל. איור זה מדגים שחרור סידן תקין המושרה על ידי קפאין בסיבי myop המבטאים את מבנה ה-PSKM GCaMP three.ניתן להשתמש בטכניקה כפי שפורטה בפרוטוקול הכתוב כדי לבחון את מנגנון הצימוד בין העירור לכיווץ באמצעות דימוי חי לאחר ביצוע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימוי סידן חי, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם קיימים פגמים בצימוד בין העירור לכיווץ לאחר התפתחותו? טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות השרירים לבצע מחקרי תיקוף של גנים שזוהו לאחרונה כגורמים למחלות שרירים, ולקבוע היבטים חדשים של הפתוגנזה של מחלות שרירים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים mild FBS בודד מעוברים של zebrafish.

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מדידות כוח ניתן להשתמש כדי להדגים שינויים בתפקוד שרירים עקב פיתוח, פציעה, מחלה, טיפול או רעילות כימית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטה למדידת כוח בכיווץ מקסימאלי של שריר תא מטען הזחל דג הזברה.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

דג הזברה הוא כיום כלי מבוסס ורב עוצמה למידול ניוון שרירים, מיופתיות מולדות ומחלות נוירומוסקולריות קשורות. שבירה כפולה והתנהגות בריחה מעוררת מגע הן שתי בדיקות לא פולשניות נפוצות המשמשות לקביעת מידת חוסר הארגון השרירי והפגיעה הקטרתית של עוברי דג הזברה במהלך ההתפתחות המוקדמת.

ניתוח פגמים בשרירי השלד בדג זברה זחל על ידי מבחני שבירה כפולה ותגובת בריחה מעוררת מגע

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

דג הזברה הם מודל מצוין לחקר תפקוד שרירים ומחלות. במהלך העובר המוקדם דג הזברה מתחיל התכווצויות שרירים קבועות המייצרות התנהגות שחייה קצבית, המשתנה כאשר השריר מופרע. כאן אנו מתארים תגובה מעוררת מגע ובדיקת תנועה לבחינת ביצועי שחייה כמדד לתפקוד השרירים.

באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה

ניתוח אלמנטים סופיים הוא כלי בשימוש תכוף לחקירת הביצועים המכניים של מבנים תחת עומס. כאן אנו מיישמים את השימוש בו למידול הביומכניקה של לסת דג הזברה.

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

למד שיטה לבידוד סיבי שריר שלד מעוברים וזחלים של דג הזברה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מורפולוגיה של סיבי שריר בודדים ולוקליזציה של חלבונים תוך-תאיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

גלה סרטונים נוספים