עיצוב רובוט ביו תגובה מ-DNA אוריגמי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתכנן התקן רובוטי מאוריגמי DNA באמצעות תוכנת CAD nano. דבר זה מושג תחילה על ידי התקנת CAD nano ושימוש בה כדי להתוות את הצורה הכללית של הרובוט. השלב השני הוא תכנון הנתיב של גדיל הפיגום (scaffold strand).

בשלב הבא, מוכנסים ה-staples ונערכים. השלב האחרון הוא הגדרת מאפייני הבקרה, כולל המטען (payload), אתרי ההצמדה והשערים (gates). בסופו של דבר, נוצרת רשימה של חלקי DNA להזמנה טרם ההרכבה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מפשטת ומנסטנדרטת את התכנון של אובייקטי DNA origami עבור יישומים מגוונים. את הפרוצדורה תדגים Alad Bei, פוסט-דוקטורנט החוקר את הדינמיקה של רובוטים מ-DNA origami במעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הורד והתקן את התוכנות CAD nano two ו-Autodesk Maya 2012.

בהתאם להוראות ב-http slash slash cad nano. org, ממשק התכנון של CAD nano בתוך Maya כולל שלושה פאנלים. הפאנל העליון הוא תצוגת הסריג (lattice view) שבה מוגדרת הצורה הראשונית.

לוח זה מאפשר ביצוע פעולות ברמת הסליל הכפול ומספק תצוגת חתך של הצורה. הלוח התחתון הוא לוח העריכה, המאפשר ביצוע פעולות ברמת הבסיס הבודד. הלוח הימני הוא מודל תלת-ממדי בזמן אמת של הצורה, שהופק באמצעות Maya.

לחצו על סמל חלת הדבש כדי לבצע זום פנימה והחוצה מהסריג. בלוח העליון ניתן לבצע זאת באמצעות העכבר, על ידי גלילה למעלה ולמטה בהתאמה.

כדי להתחיל, שרטטו את החלק בצורה הרצויה על הפאנל השמאלי. כל עיגול מייצג DN כפול; כדי לבחור את הסלילים המרכיבים את הצורה, פשוט לחצו לחיצה שמאלית על מרכזם. המשיכו סליל אחר סליל עד שכל הצורה תהיה מתוחמת.

לחילופין, ניתן לצייר את הצורה על ידי לחיצה על לחצן העכבר השמאלי וציור רציף של קווי המתאר של הצורה. שימו לב לפאנל התחתון. כל סליל (helix) מיוצג על ידי שתי שורות של ריבועים.

השורות הן שני הגדילים של הסליל הכפול. כאשר כל ריבוע מייצג בסיס, הפס האנכי הכתום קובע היכן מתבצעות פעולות העריכה לאורך הסליל. מיקום הבסיס לאורך הרשת מופיע כמספר מעל הפס הכתום.

אורך ברירת המחדל של תשתית הסליל הוא 42 בסיסים. ניתן להאריך את האורך על ידי לחיצה על אחד מאייקוני החצים האפורים בפינה הימנית העליונה של פאנל העריכה ובחירת אורך ההארכה. כדי לשרטט את נתיב גדיל הפיגום בפועל לאורך הצורה, לחץ על לחצון העכבר.

התחילו מהסליל הראשון והמשיכו ברציפות על פני כל הסלילים לפי אותו סדר שבו נבחרו בתחילה. שרטטו מלבן סביב כל הקצוות השמאליים ביותר של נתיב הפיגום. האריכו את נתיב הפיגום על ידי גרירת הקצוות שנבחרו כקבוצה לצד שמאל של הרשת.

לאחר חזרה על תהליך זה עד להארכת הנתיב כראוי וזיהוי סמלי הגשרים כפי שמתואר בטקסט הכתוב, התכוננו ליצירת הצטלביויות (crossovers). לחצו לחיצה שמאלית על סמל הגשר הנבחר. תיווצר הצטלביות של הפיגום (scaffold crossover), כלומר הפיגום חוצה בנקודה זו מסליל לסליל.

חזור על תהליך זה עד שהפיגום חוצה את כל הסלילים ויוצר לולאה סגורה המקיפה את הצורה כולה, כך שלא יישארו אזורים המבודדים משאר הצורה. הרובוט המתואר נפתח בתגובה לקלט ביולוגי מוגדר כדי לחשוף את המטען שלו. הפתיחה מתבצעת באופן הדומה לקליפה, כאשר שני חצאים מסתובבים סביב שני צירים.

הצירים נוצרים על ידי הצטלביות (crossovers) בין הסלילים 29 ו-30 ובין 61 ואפס, שהן ההצטלביות היחידות בין שני החצאים הללו וממוקמות רק בתוך או קרוב לקצה השמאלי של הרשת. הקצה הימני יכיל את גדילי ההליכה (gait strands). מחקו את ההצטלביות הקיימת בין הסלילים 29 ו-30.

כדי למחוק את ההצטלבות (crossover), לחצו על נקודת הברך (knee point) באחד משני הגדילים. פעולה זו תשאיר חריץ (nick) בשני הגדילים במקום שבו הייתה ההצטלבות. כדי לסגור את החריצים, לחצו על מקש shift והקליקו על כל חריץ, ואז צרו הצטלבות חדשה בין הסלילים (helices) 29 ו-30 קרוב ככל האפשר לקצה השמאלי של הרשת.

לאחר מכן, צרו נקודת הצטלבות (crossover) חדשה בין סליל 61 לסליל אפס קרוב ככל האפשר לקצה השמאלי של הרשת, והגדירו ארבעה אתרי טעינה הפונים כלפי הצד הפנימי של הרובוט. אתרי הטעינה יסתעפו מסלילים 3 27, 34 ו-58. עבור כל אתר בלוח העליון, לחצו על הסליל הגובל בסלילים אלו הפונה כלפי הצד הפנימי.

פעולה זו תוסיף את הסליליים לרשת בפאנל התחתון. אל תלחצו שוב על שכבות אלו בשלב זה כדי להוסיף ולערוך סיכות (staples). לחצו תחילה על "auto staple".

התוכנה תוסיף באופן אוטומטי רצפי staple בצבעים שונים. שימו לב כי staple נוספו לצורה התלת-ממדית בפאנל הימני. צבעי ה-staple עקביים עבור הפאנלים התחתון והימני.

בנוסף, קיים מחוון בפינה השמאלית התחתונה של הממשק, המציין כי סיכות אינן יכולות להיות ארוכות מדי, קצרות מדי או מעגליות לצורך עריכה אוטומטית של סיכות. כדי לעמוד בקריטריונים אלה, לחצו על auto break; תיבה תפתח ותבקש פרמטרים שיוגדרו על ידי המשתמש עבור פעולה זו, השתמשו בפרמטרים כברירת המחדל ולחצו על okay. התוכנה תבצע שבירה של הסיכות בהתאם לפרמטרים אלה במידה המרבית שניתן.

מחקו את כל נקודות ההצטלבות של ה-staples בין הסלילים 29 ו-30 ובין 61 ל-0, כדי לאפשר לסלילים אלו להיפרד ולאפשר לרובוט להיפתח. מחיקת נקודות הצטלבות של staples תדרוש עריכה ידנית מסוימת כדי לתקן staples שהופכים לקצרים מדי או לא הגיוניים כתוצאה מפעולה זו. כדי לבצע זאת כראוי, עקבו אחר ההוראות בפרוטוקול הטקסט: בחרו את שני ה-staples בסליל 29 על ידי לחיצה על shift ולחיצה על ה-nick שביניהם.

באופן דומה, נראה כי שלושת הסיכות ב-Strand 30 הן סיכה אחת; ניתן להאריך או לקצר סיכות באופן ידני על ידי לחיצה על קצה וגרירתו לפי הרצוי. הקפידו לא להפוך אף סיכה למעגלית. חזרו על תהליך זה עבור HELOCs 0 ו-61 וערוכו ידנית את כל הסיכות בכל הליקס.

אתרו סיכות המסומנות בקו עבה, שפירושו שהן דורשות עריכה נוספת. בחנו כל אחת מהן ותקנו במידת הצורך. לדוגמה, סיכות קצרות מדי ניתנות למחיקה או להארכה במידה והדבר אפשרי.

שנית, לחצו על סלילי אתר הטעינה (loading site helices) בלוח העליון והאריכו את מקטעי גדיל הפיגום (scaffold strand fragments) שנוצרו בלוח התחתון על ידי לחיצה על קצה וגרירה שלו לפי הרצון. הוסיפו ידנית סיכות (staples) למקטעי פיגום אלו על ידי מיקום הפס האנכי הכתום במיקום הרצוי לאורך הפיגום, מעבר לסלילי המדריך בלוח השמאלי תוך לחיצה על מקש shift. פעולה זו תוסיף קדם-סיכה (staple precursor) בכל סליל.

האריכו גם את רכיבי המקדם של הסיכות (staple precursors) לאורך מלא. באמצעות לחיצה וגרירה, אתרו את אייקוני הגשר האדומים המציינים נקודות הצלבה (crossover points) בין גדיל המדריך (guide strand) לבין השלדה (chassis). בחרו את המיקום הנוח ביותר להכנסת הצלבה והקליקו על אייקון הגשר. מיקום נוח הוא כזה הדורש עריכה מינימלית של הסיכות הקיימות בשלדה.

בסליל המנחה, יש למחוק את חלק ה-staple שאינו מהווה חלק מאתר הטעינה ולקצר את החלק המשתתף לאורך הרצוי. האורך הרצוי צריך לספק הן ספציפיות לטעינה של סוגים שונים של מטען והן חוזק קישור. בדרך כלל, זנב של 18 mer אמור להספיק.

וודאו שהסיכה נשארת משוכה בקו דק. אחרת, ערכו עד שהיא תהיה בתוך השלדה. ערכו את הסיכות ששונו בהתאם לצורך.

מחק את רצף המדריך (guide), והשאר רק את הרחבת הסיכה (staple extension). חזור על שלבים אלו עבור כל אתרי הטעינה כדי לתכנן את רצפי ה-gait. ראשית, אתר את המיקומים המתאימים עבור רצפי ה-gait.

אלו יהיו סיכות (staples) על הסלילים 29, 30, 61 ואפס. לדוגמה, בחנו את אזור השער שבין 29 ל-30. קיימים גדילי סיכה נוחים, המקיפים את הסלילים 29 ו-30 בצד ימין של הסריג, שניתן להשתמש בהם כגדילי שער.

שימו לב שהם פונים לכיוונים מנוגדים. לחצו על הקצה של אחד מחוטי השער הפוטנציאליים כדי להאריכו אותו אל מחוץ לצורה. אם הקצה נמצא מעל נקודת הצטלבות של פיגום (scaffold crossover), ניתן לפשט את הבחירה בו על ידי הגדרה שרק סיכות (staples) יהיו ניתנות לבחירה.

על ידי לחיצה על scaf בסרגל הכלים הניתן לבחירה בפינה הימנית העליונה של הממשק, האריכו את שני ה-staples כדי ליצור את גדילי השער (gate strands). ערכו את ה-staples. במידה והארכה זו דורשת זאת, חזרו על פעולה זו עבור גדילי השער של סלילים (helices) 0 ו-61.

כדי לבחור את רצף הפיגום (scaffold), לחצו על כלי החיפוש (seek tool). מקמו את הסמן בכל נקודה על גבי גדיל הפיגום ולחצו; תיפתח תיבת דו-שיח המבקשת לבחור את מקור ה-DNA של הפיגום. בתיבת הדו-שיח, לחצו על M 13 MP 18. שימו לב שרצף ה-DNA שנבחר נוסף לפיגום ולגדילי הסיכות (staple strands) בפאנל התחתון.

לבסוף, ייצאו את רצף ה-staple כגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על export בסרגל הכלים העליון ובחירת שם קובץ יעד עבור רשימת ה-staples. לחצו על save. סרטון זה הדגים תהליך שלב-אחר-שלב לתכנון של ננו-רובוט DNA origami.

ראשית סומן כאן קו המתאר של חתך הצורה. לאחר סיום סימון המתאר, בוצעו עריכה אוטומטית של מקטעי חוטי הפיגום והשלמה של נתיב הפיגום כולו. מוצגת כאן תצוגה כללית של הפאנלים התחתון והימני, המדגימה כיצד המודל התלת-ממדי משתנה בזמן אמת במקביל לפעולות העריכה.

גדילי הסיכה (Staple strands) נוספו באופן אוטומטי, כפי שניתן לראות בתוכנית לאחר פעולת ה-auto staple. בתמונה זו, צבעי הסיכה בפאנל התחתון ובפאנל הימני עקביים. לאחר מכן, גדילי הסיכה נשברו בהתאם לפרמטרים שהוגדרו על ידי המשתמש, כפי שמוצג כאן בתוכנית לאחר פעולת ה-auto brake.

בשלב הבא, גדישוני ה-staple נערכו ידנית כדי להתאים אותם לתפקוד הרצוי של ההתקן. המרווח המלא בין הסלילים 29 ו-30 מראה כי אין הצלבות המחברות ביניהם בתוכנית זו. לאחר העריכה הידנית מוצגת כאן תצוגה של גדישוני ה-staple של אתר הטעינה כפי שניתן לראות בפאנל התחתון.

לאחר הסרת ה-HELOCs המנחים, שאינם נחוצים יותר, תמונה זו מראה את ההארכה של שני סיכות (staples), אשר ישמשו כחוטי GA מה-HELOCs 29 ו-30. שימו לב ששני החוטים פונים לכיוונים מנוגדים, דבר הכרחי ליצירת ה-gait duplex. זוהי תמונת ה-TEM של המודל הסופי שתוכנן בהליך זה.

הדגימה נצבעה בפורמט שתן והודגמה במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) בדיוק כפי שתואר בדיווחים קודמים של המחברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לתכנן רובוט מ-DNA origami עבור כל יישום שתבחרו.