Name: לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: למדו הכנת אקספלנטים שלמים של חצי כדור מוח עוברי עכברים באמצעות אלקטרופורציה ex utero לחקר התפתחות קליפת המוח הקדומה. שיטה זו מאפשרת מחקרים פרמקולוגיים והערכת השפעת מוטציות על נוירונים קורטיקליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על מענקים מNINDS (NS066071) וNIAAA. (P50AA017823) לECO. המחברים מודים לד&quot;ר רוברט קווין וצוות במחלקת המשאבים חיו מעבדה לטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ג&#39;דסון למונט לתמיכה טכנית, ניקול Belletier לסיוע כעמיתת מחקר לתואר ראשון קיץ (SURF). אנו מודים גם לד&quot;ר דיוויד קמרון להערות ועריכות בגרסה קודמת של כתב היד.

1. Electroporations רחם אקס עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרוני הזרקת DNA פלסמיד שהוכנו CAG-27-DNA eGFP המדולל לריכוז העבודה הסופי של 0.33 מ&quot;ג / מ&quot;ל בDDH 2 O. -Preps מקסי Endo-חינם Qiagen משמש כדי לטהר פלסמיד מחיידקים מותמרים. צבע ירוק מהיר ב~ 0.02% (w / v סופי) הוא הוסיף לתמיסת ה-DNA כנותב הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את אזור הניתוח, התיז על גבי ספסל ובמת מיקרוסקופ לנתח עם 70% אתנול ופתרון נגב יבש. רסס מספריים ומלקחיים כירורגית עם אתנול 70% לפני הנתיחה ולנגב יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכרי מתוזמן הריון שויצרי / ובסטר מוקרבים על E13 על ידי העביר לחדר מלא בCO 2 מצילינדר לחץ והסכר הוא פיקוח עד שכל התנועה שעצרה לדקות לפחות 1. לאחר קורבן על ידי 2 משאיפת CO העוברים יוסרו מן הרחם והניחו ב10 פתרון סנטימטר צלחת הפטר שהכיל קרח קר הנקס מאוזן מלוח (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח כל עובר מהקרומים המקיפים extraembryonic ולשמור בHBSS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל עובר באופן פרטני למנה שנייה 10 סנטימטרי פטרי המכילה HBSS הקר. השתמש במזרק המילטון להזריק 2-3 μl של התערובת הירוקה DNA המהירה לתוך את החדר של האונה השמאלית של המוח, טיפול להזריק באזור מרחב נפרד מאזור קליפת המוח לקליפת מוח ניתוח בעתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לelectroporate, להחזיק את העובר בעדינות בעזרת מלקחיים וקלים למקם את ההנעה החיובית של האלקטרודה פינצטה על קו האמצע הגבה של הראש וקל למקם את ההנעה השלילית מתחת לסנטר העובר. Electroporations מושגות עם BTX830 electroporator המתוכנת לספק 5 30 פולסים V של 50 אלפיות משך, מופרדים על ידי מרווחי 950 msec. הגדרות אלה הן לBTX830 המודל. מערכות אחרות ניתן להשתמש על פי instructio של היצרןns. </li></ol> 2. הכנת Explant חצי כדור שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation העוברים מוצבים בחזרה לHBSS קר כקרח. המוח מוסר באמצעות שני # 5 מלקחי תכשיטים להסיר את העור וגולגולת סחוסים מראש העובר. מלקחיים אז הוא החליק מתחת למוח כדי להסיר את המוח ללא פגע מהגולגולת. אונת electroporated (משמאל) לאחר מכן גזורה מרקמת המוח ובמצורפת אמצע המוח הוסרה. במהלך טיפול הליך הנתיחה נלקח לא לפגוע בקרומי המוח מונחים על האונה השמאלית של קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנתח את כל עובר מועבר בHBSS באמצעות pipettor עם קצה חיתוך 1 מיליליטר פיפטה. האונה מסולקת בעדינות על גבי עלון תרבות קולגן מצופה. עד שישה explants אונה מסודרים צד המדיאלי על כל עלון מ&quot;מ 24. HBSS לאחר ארגון העודף יוסר מלהוסיף ולאחר מכן להוסיף ממוקם לתוך 1 35 מ&quot;מ גם של מנה גם 6. גם מכיל Exactly 2.7 מ&quot;ל של תקשורת: תקשורת DMEM-F12 המכיל Glutamax והשלים עם 2% B-27, 1% G5 ו 1% פניצילין-דלקת. כמה טיפין של תקשורת מהיטב ניתן pipetted על גבי זה explant, אבל לא להוסיף מדיה בעודף של 2.7 מ&quot;ל המקורי לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר explants הוצב על גבי מסנני קולגן המנה גם 6 המכילה את explants ממוקמת לתוך Billups רוטנברג (BR) קאמרי (שמכיל גם מנת humidifying של מים). תערובת של 95% חמצן / 5% / CO 2 גז הוא החדיר לתוך התא לדקות לפחות 1 לפני האיטום סוגר הקאמרי וניתוק צינור אספקת הגז 2 95% החמצן / 5% / CO. BR הקאמרי הועבר אז ל37 מעלות צלזיוס רקמות תרבות חממה ליתרת תקופת התרבות, 1-2 DIV. </li></ol> 3. קיבוע של רקמות Explant ליסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף להכין פתרון קיבעון פגאנו ידי g 8 solubilizing הראשון של paraformaldehyde ב100 מ&quot;ל של שחוממה מראש (~ 80 &amp; דהז; C) DDH 2 O. הוסף 1-3 טיפין המרוכזות NaOH לקדם solubilization ועדינות מערבבת. ברגע solubilized לערבב 8% פתרון paraformaldehyde 01:01 עם פתרון זה הוא סוכרוז 500 מ&quot;מ, 100 המ&quot;מ Hepes, 7.4 pH, 50 המ&quot;מ MgCl 2, KCl mM 5 לריכוז סופי של paraformaldehyde 4% ב -250 50 המ&quot;מ Hepes סוכרוז המ&quot;מ , 25 המ&quot;מ MgCl 2, 2.5 mM KCl, 7.4 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את explants לחמם את פתרון תיקון פגאנו עד 37 ° C. סר במהירות מרבית DMEM/F12 מדיה מכל תרבות היטב ומוסיף 5 מ&quot;ל של תקן פגאנו לכל באר של explants. הקפד לכסות את כל explant לחלוטין בתיקון. תקן עבור שעה 1 בRT. אל תסיר explants ממסנן לפני 1 השעה של קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקיבוע להסיר את פתרון תיקון פגאנו ולהחליף עם פתרון פגאנו בלי מנה (250 מ&quot;מ 50 Hepes סוכרוז מ&quot;מ, 25 המ&quot;מ MgCl 2, 2.5 המ&quot;מ KCl, 7.4 pH). הוסף כמה טיפין של 10% יזידו הנתרן וחנות ב 4 ° C עד הטבעה. </li></ol> 4. הטבעה וSectioning ליסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% פתרון ג&#39;לטין עור עגל בsolubilizing 10 גרם ג&#39;לטין בעור העגל 100 מיליליטר מים חמימים (55-60 מעלות צלזיוס). הנח פתרון ג&#39;לטין על פלטה להגדיר עד 60 ° C ומערבולת מעת לעת עד solubilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק כ 10 מ&quot;ל של תמיסת הג&#39;לטין 10% לתחתית צלחת פטרי 10 סנטימטרים ומאפשרים 30 דקות כדי לחזק. זה יהיה בצורה &quot;כרית&quot; להטבעה את explants. רפידות אלו יכולות להיות ימים שהוכנו מראש ומאוחסנות ב 4 ° C. השתמש בסרגל כדי לצייר רשת בתחתית צלחת הפטר ולהעביר explants הבודד לתוך כל תיבה של הרשת. הסר פתרון פגאנו שיורים והשימוש pipettor, לכסות כל explant עם פתרון ג&#39;לטין חם 10% ולאפשר לביסוס. בנוסף לחדש איטי של פתרון ג&#39;לטין עד שכל explant מוקף לחלוטין על ידי ג&#39;לטין, נזהר שלא להמס את המשטח על ידי התוספת של מדי לחמם ג&#39;לטין מדי בבת אחת. לאפשר לג&#39;לטין להקשיח ל~ 1 שעה. ברגע שהקשיח individexplants רע&quot;מ אפשר לחתוך בלוקים קטנים של ג&#39;לטין. את הלוקים לפרסם-קבועים אז בפגאנו לתקן עבור 24-48 שעות לפני החתך עם vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants בלוקי ג&#39;לטין מוצב נורת חוש ריח ונותח במטוס העטרה בעובי מיקרומטר 100. הסעיפים נאספים ונשמרים בPBS + 0.1% יזידו הנתרן ב 4 ° C עד עיבוד immunohistochemical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור immunohistochemical מתבצע על ידי העברת חלקים לצלחת גם 24 (2-3 חלקים לטובים). נוגדן הבלוק הראשון הלא ספציפי מחייב על ידי הוספת 0.5 המ&quot;ל PBST + B (PBS 0.5% + טריטון X 100 ו 2% BSA) לכל באר, שעות לדגור 1 עם טלטול עדין. אז הנוגדן הראשוני המתאים דילול בPBST + B ו -0.4 מ&quot;ל לגם הוא הוסיף לדגירת הלילה בRT. העיקרי הוא שטף החוצה עם 3X PBS שוטף לפחות 10 דקות כל אחד. הנוגדן המשני ו2 מיקרוגרם / המ&quot;ל Hoechst 33342 גרעיניים כתם לאחר מכן, בדילול PBST + B והדגימות מודגרת עבור 2 שעות בRTעם טלטול עדין. שלוש כביסות PBS (10 דקות כל אחד) ולאחר מכן מבוצעות הסעיפים הם רכובים על שקופיות באמצעות 90% גליצרול 50 mM טריס, pH7.4, תקשורת גוברת. </li></ol>

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. , (2004).</li>
<li>Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neuronal+positioning+and+dendritogenesis+in+the+neocortex+after+cell-autonomous+Dab1+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression.</a> J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+neuron+origin+and+neocortical+laminar+fate%3A+relation+to+cell+cycle+of+origin+in+the+developing+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall.</a> J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+prenatal+ontogenesis+of+the+cerebral+cortex+%28neocortex%29+of+the+cat+%28Felis+domestica%29.+A+Golgi+study.+I.+The+primordial+neocortical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Anat.+Entwicklungsgesch%22%5BJournal%5D)">Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization.</a> Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).</li>
<li>Nichols, A. J., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+promotes+neuronal+orientation+and+dendritogenesis+during+preplate+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting.</a> Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).</li>
<li>Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+reorganization+of+preplate+neurons+and+their+associated+extracellular+matrix%3A+an+early+manifestation+of+altered+neocortical+development+in+the+reeler+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse.</a> J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).</li>
<li>Manzini, M. C., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+disorders+of+cortical+development+tell+us+about+the+cortex%3A+one+plus+one+does+not+always+make+two%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).</li>
<li>Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+alteration+of+dendritic+development+in+the+cerebral+cortex+following+prenatal+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure.</a> Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).</li>
<li>Olney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Addict.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome at the cellular level.</a> Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).</li>
<li>Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+impact+of+early+cellular+environment+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.+Med%22%5BJournal%5D)">The critical impact of early cellular environment on neuronal development.</a> Prev. Med. 27, 180-183 (1998).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+migratory+pathways+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex.</a> Science. 258, 299-302 (1992).</li>
<li>Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+adhesion+is+necessary+for+radial+migration+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex.</a> Nature. 448, 901-907 (2007).</li>
<li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+regulates+cadherin+function+via+Dab1%2FRap1+to+control+neuronal+migration+and+lamination+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li>
<li>Gotz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Cameron, R. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+membrane+proteins+that+comprise+the+plasmalemmal+junction+between+migrating+neurons+and+radial+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells.</a> J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).</li>
<li>Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Study+of+Neuronal+Morphogenesis%3A+Ex+vivo+RNAi+Electroporation+in+Embryonic+Murine+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex.</a> J. Vis. Exp. (63), e3621(2012).</li>
<li>Jossin, Y., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signals+through+phosphatidylinositol+3-kinase+and+Akt+to+control+cortical+development+and+through+mTor+to+regulate+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth.</a> Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).</li>
<li>Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SRC+family+kinases+and+non-classical+protein+kinases+C+induce+a+reeler-like+malformation+of+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development.</a> J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).</li>
<li>Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-proliferative+effects+of+lysophosphatidic+acid+enhance+cortical+growth+and+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding.</a> Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).</li>
<li>Rehen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+embryonic+culture+for+assessing+global+changes+in+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).</li>
<li>Jossin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+fragment+of+Reelin%2C+generated+by+proteolytic+processing+in+vivo%2C+is+critical+to+its+function+during+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development.</a> J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).</li>
<li>O'Dell, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortical+neurons+require+Reelin-Dab1+signaling+for+cellular+orientation%2C+Golgi+deployment%2C+and+directed+neurite+growth+into+the+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone.</a> Neural. Dev. 7, 25(2012).</li>
<li>Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+disruption+of+Golgi+apparatus+morphology%2C+primary+neurite+number+and+cellular+orientation+in+developing+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons.</a> Alcohol. , (2012).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+neocortical+neurogenesis+and+neuronal+specification%3A+a+positional+information+system+encoded+by+neurogenetic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+The+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45, 208-217 (2007).</li>
<li>Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+in+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix in early cortical development.</a> Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).</li>
<li>Milev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+expression+of+hyaluronan-binding+proteoglycans+in+developing+brain%3A+aggrecan%2C+versican%2C+neurocan%2C+and+brevican%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).</li>
<li>McKenna, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr1+and+Fezf2+regulate+alternate+corticofugal+neuronal+identities+during+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).</li>
<li>Powrozek, T. A., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+on+the+development+of+the+vibrissal+somatosensory+cortical+barrel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).</li>
<li>O'Dell, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Dell%2C+R+%22Society+for+Neuroscience%22">Society for Neuroscience</a>. , Washington D.C. (2011).</li>
<li>Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Golgi+picture+of+the+layer+VI+cortic-geniculate+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research.+Experimentelle+Hirnforschung.+Experimentation+Cerebrale%22%5BJournal%5D)">Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons.</a> Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).</li>
<li>Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+characterization+of+layer+VI+corticofugal+neurons+of+mouse+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).</li>
<li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+in+the+interconnected+circuitry+of+the+thalamus+and+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).</li>
<li>Kowalczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Neuronal+Progenitors+%28Basal+Progenitors%29+Produce+Pyramidal-Projection+Neurons+for+All+Layers+of+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. , (2009).</li>
<li>Konig, N., Roch, G., Marty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+synaptogenesis+in+rat+temporal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex.</a> Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו שיפור ומוערך מודל ניסויי - explants אונה השלמה - למחקר על התפתחות קליפת מוח המוקדמת (E13-E15). המודל הוכיח שימושי לניתוח של הגירה ובידול של שושלת נוירון המעוררת שמהווה שכבה 6 של קליפת מוח 25,37. יתרונותיה העיקריים של המערכת הם: 1) צמיחת organotypic ל2 DIV, 2) פשטות של הכנה, ו3) גישה ניסויית לתאי העצב לelectroporation מניפולציה, תרופתיות והדמיה במהלך תחילת תקופה זו קריטית של התפתחות מוח. יש לנו להשתמש במערכת כדי לתעד הבדלים עדינים במורפולוגיה, הכיוון וצמיחת הדנדרי...

צורות יונקי קליפת המוח באמצעות התפשטות, ההגירה ובידול המרוכז של נוירונים שנוצרו ברציפות. כל נוירון הוא נולד באזור חדרית (VZ) ונודד מVZ לאיזור ביניים (א.ת.), ויצר את צלחת קליפת המוח (CP) 1. כשהם עוברים דרך תחומים שונים של קליפת מוח, תאי העצב הנודד יציג את המצבים מרובים של הגירת 2,3 התלויים בסביבה התאית ומרכיבים תאיים אחרים (למשל גליה רדיאלי) בתוך הרקמה המתפתחת. נוירונים בקליפת מוח ואז לעצור את ההגירה בראש צלחת קליפת המוח להרכיב בתהליכים החופפים מעצר הגירה ועצבי 4 dendritogenesis. התפתחות קליפת המוח היא שיזם בין ימים עובריים 11-13 (E11-13) 5 עד הקמתה של השכבה הקדמונית plexiform 6 או preplate (PP), שכבה של תאי עצב חלוץ שoverlies VZ. לעתידשכבת 6 נוירונים בקליפת מוח (כלומר נוירונים בקליפת המוח הראשונים שנולדו בVZ) ואז לכוון אותם בsomata דפוס סטריאוטיפי ולהתגבש לשכבה ברורה בתוך 7 PP. אירועים אלה לפצל preplate ל( שכבת עתיד קורטיקלי 1) שטחית שולית ואזור עמוק, שהאחרון המורכב של תאי קליפת המוח (שכבת subplate חולפת 7). תהליך זה, המכונה פיצול preplate, הוא אירוע מכונן בצמיחה העתידית של קליפת מוח 8. מוטציות גנטיות רבות זוהו לשבש היבטים שונים של התפתחות קליפת המוח 9. התפתחות קליפת המוח יכולה גם להיות מושפעת לרעה על ידי חשיפה לרעלי ingested כמו קוק 10 ו 11 באלכוהול. בגלל מומים בקליפת המוח שמתעוררים במהלך פיתוח הם תורמים צפויים הפרעות נוירולוגיות (למשל אוטיזם, סכיזופרניה), חקירות אמפיריות של הפרעות להתפתחות קליפת מוח טבועותly החשוב. לכן חשיבות רבה להקמת גישות ללמוד פיתוח קליפת המוח שייאפשרו מבחנים מהירים של השפעות גנטיות או רעל אבל זה גם לשמור על אינטראקציות האפשריות בין הנוירונים מבדילים, סוגי תאים אחרים ומטריקס (ECM) בתקופה המוקדמת של התפתחות המוח 12 . explants Slice 13 ספק מערכת כזו והיה בשימוש נרחב לפיתוח נוירון קורטיקלי assay 14-16. עם זאת, מבחנים פרוסים יכולים לסבול מהחסרון שההגירה ולמינציה עצבית יכולים להיות נורמלית 17 אולי בשל ניזק לתאי meningeal המקיפים את המוח ועוגן פיתוח רדיאלי גליה פיגום. כסיבי גליה רדיאליים הם מצע חשוב ל18 שיבוש הגירת נוירון קורטיקלי של lamina הבסיס של חיתוך עלול לשבש באופן מקומי ארכיטקטורת גלייה רדיאלי ולהוביל להגירת קליפת מוח שונה. בנוסף SLIמשטחי CED של explants מספקים אזור של תאים מתים שעשוי לשנות את ההרכב הרגיל של ECM באזורים אלה. גישות מאוחרות יותר התמקדו הניתוח שלהם בתאים הנמצאים עמוק בפרוסה שמוקפות בסוגים מתאימים בריאים סלולריים וECM. עם זאת, במקרים מסוימים גם גישות חדשות אלו יכולות לדרוש שהפרוסה העבה התרבותית המקורית להיות cryo-נותחה או פרפין נותח לאחר קיבוע כך שהחלק הפנימי הנורמלי יחסית של הפרוסה נעשתה זמין לניתוח 19-21. שניהם vibratome המקורי חתך להכין את הפרוסות החיות לתרבות כמו גם cryosectioning הבא של פרוסות קבועות לניתוח דורש טיפול ומאמץ למבחנים אלה לעבודה. כדי לספק גישה פשוטה, ללימודים משלימה של התפתחות קליפת מוח מוקדם, יש לנו גישות שונות an פרוס קיימות 13 כדי להקל על מחקרים של התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם. פתחנו WHמודל ole אונת explant דומה למודל קיים E14 כל אונה שמעורבות תרבויות רועדות ב 65 סיבובים לדקה וצמיחת organotypic מותר ל16-18 שעות 22,23. בגישה שלנו, explants אונה השלמה מונחים על קרום חדיר למחצה עם 13 באווירת תרבות חמצן גבוהה 21,24 להאריך צמיחת קליפת המוח organotypic עבור 48 שעות. גישה זו גם מאפשרת לelectroporation העקבי של פיתוח נוירונים בקליפת המוח. העוברים יוסרו מהרחם וelectroporated להציג את ה-DNA פלסמיד ולאחר מכן telencephalon מנותח. אונה כל מבודדת והניחה את הצד המדיאלי על מסנן קולגן מצופה. אז explant בתרבית לתקופה של 48 שעות, תקופה שכוללת פיצול preplate 8. בתקופת התרבות, L6 הנוירונים להתפתח ממבשרים 25 נוירון המובחן, ממוקם כראוי בתוך צלחת קליפת המוח. בכל תקופה זו מתפתחתנוירון מוקף ECM המתאים וסוגי תאים שיעמידו התא המתאים בגוף חי. שיטה זו כבר הוכיחה יקרה בפענוח האירועים התאיים העומדים בבסיס רעילות אתנול 26, 6 והיווצרות שכבת preplate פיצול 7,25.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + תוסף GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 ללא סרום Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>עט / נוזל סטרפטוקוקוס 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 מ"ל</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>תרבית הכנסת קולגן מצופה </td><td>קולגן Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין עור בקר </td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree פלסמיד מקסי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 אלקטרופורטור</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות פינצטה 10 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון (5uL)</td><td>המילטון</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק המילטון</td><td>המילטון</td><td>7803-04</td><td>ציין 1 אינץ' וסגנון 4</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים חתך קשיח 9 ס"מ</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

התפתחות קליפת מוח כרוך אינטראקציות מורכבות בין תאי עצב ואלמנטים שאינם עצביים בין תאים מבשרים, כלי דם, קרום מוח ומטריקס המשויך. משום שהם מספקים סביבה מתאימה organotypic, explants הפרוס קליפת המוח משמשים לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות אלה ששולטים בהתמיינות והתפתחות עצביות. אמנם מועיל, מודל explant פרוסה יכול לסבול מחסרונות כוללים למינציה סלולרית חריגות והגירה. כאן אנו מדווחים מערכת כל חץ כדור מוחית explant ללימודים של התפתחות קליפת המוח הקדומה שיותר קל להכין מפרוסות ומופעי קליפת מוח הגירת organotypic עקבית ולמינציה. במערכת מודל זה, למינציה המוקדמת ודפוסי נדידה להמשיך כרגיל לתקופה של ימים במבחנה, לרבות תקופת פיצול preplate, במהלך ששכבת קליפת מוח פוטנציאלית שש צורות. אז פתחנו electroporation הרחם לשעבר (EUEP)גישה שמשיגה הצלחה ~ 80% במיקוד הביטוי של GFP לנוירונים בקליפת המוח המתפתחים המדיאלי הגבה. כל מודל explant האונה עושה פיתוח נגיש עבור electroporation התערבות, תרופתית וגישות הדמיה חיות מוקדם קליפת המוח. שיטה זו מונעת ניתוח ההישרדות הנדרשת ברחם electroporation (IUEP) גישות תוך השיפור גם transfection ועקביות מיקוד Areal. שיטה זו תאפשר מחקרים ניסיוניים של שגשוג, נדידה והתמיינות של תאי עצב.

המכרסם העוברית הקליפה מציגה שיפוע neurogenetic רוחבי לאורך כל תקופת ההתפתחות, שהניאוקורטקס כגון רוחב הוא יום כ 1 בוגר יותר מ 28 הניאוקורטקס המדיאלי הגבה. חלק הארי של שכבה 6 הנוירונים נוצרים כך (כלומר, תציג S-השלב הסופי שלהם) על E12 בקליפת מוח לרוחב (המכונה גם שדה 40 5) ובE13 בקליפה המדיאלי הגב (המכונה גם שדה 1 5). פיצול Preplate מתחיל כ 1 יום אחרי דור נוירון שכבה 6 וכך הוא יזם בקליפה החיצונית על E13 וקליפת המוח הגבה על E14. ללמוד פיצול pre...

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר הכולל<em&gt; לשעבר רחם</em&gt; Electroporation, נתיחה והתרבות של אונות מוח שלמות מהעכבר העוברי. ההכנה מאפשרת לימודים ומבחנים פרמקולוגיים של תפקוד גן במהלך התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם.

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין דגימה של המיספירה המוחיות (cerebral hemisphere) כולה לצורך חקר ההתפתחות הקורטיקלית המוקדמת. דבר זה מושג תחילה על ידי קצירת עוברים של עכברים ביום העוברי 13. לאחר מכן, מזריקים את תערובת ה-DNA הפלסמי לתוך הפקעת המוחיות ומבצעים אלקטרופורציה מחוץ לרחם (ex utero electroporation).לאחר מכן, הכינו חלק חצוי (explan) של המיספירה מהעובר שעבר אלקטורופורציה. השלב הסופי הוא קיבוע וחיתוך של החלק החצוי של המיספירה לצורך אנליזות היסטולוגיות. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעת המוטציה או החשיפה לרעלן על התפתחות נוירונים קורטיקליים באמצעות אנליזות אימונוהיסטולוגיות של נוירונים המבטאים GFP.שמי אריק אולסון. אני מהמחלקה למדעי העצבים ופיזיולוגיה כאן באוניברסיטה הרפואית SUNY Upstate בסירקיוס, והיום נראה לכם שיטה שפיתחנו הנקראת whole Hemisphere X explan. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון slice explan, הוא ש-whole hemisphere X explan פשוטים להכנה ומספקים יומיים של צמיחה אורגנוטיפית.השיטה יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-התפתחות, כגון כיצד מוטציה מסוימת או רעל משבשים את ההתפתחות המוקדמת של קליפת המוח. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, שכן הכנת חצי סהר שלם (explan) ללא פגיעה בקרומי המוח דורשת תרגול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי הניתוח והעברת ה-explan קשים ללמידה בשל הרגישות של הרקמה לנזק מכני.ד"ר תרזה אוזי, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי, תדגים את הפרוצדורה. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בערכה זמינה מסחרית לניקוי הפלסמידים. הכינו את ה-DNA הפלסמידי בריכוז של 0.33 milligrams per milliliter במים והוסיפו צבע fast green כסמן הזרקה בריכוז של כ-0.02%Weight by volume. חטאו תמיד את כלי הניתוח, את מרחב העבודה ואת המיקרוסקופ.חטאו ב-70% ethanol ולאחר מכן הקריבו מספר נדרש של נקבות Swiss Webster ביום העוברים E 13 באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני. בעת הוצאת העוברים, הניחו אותם בצלחת של 10 סנטימטרים המכילה HBSS קר מאוד, כאשר הצלחת נשמרת קרה על קרח. בצעו דיסקציה זהירה של כל עובר מהקרומים חוץ-עובריים שסביבו.כעת העבירו כל עובר בנפרד לצלוחית נקייה עם HBSS קר מאוד. באמצעות מזרק Hamilton, מזריקו שני עד שלושה מיקרוליטרים של ה-DNA שהוכן לתוך החדר של ההמיספרה המוחית השמאלית. אין להזריק לתוך או ליד האזור הקורטיקלי המיועד לניתוח עתידי.כדי לבצע אלקטרופורציה ל-DNA, החזיקו את העובר בעדינות בעזרת פינצטה והניחו קלות את המגב (paddle) החיובי של אלקטרודת המלקחיים על קו האמצע הגבי של הראש. הניחו בעדינות את המגב השלילי מתחת לסנטרו של העובר. הפעילו תוכנית של חמישה פולסים של 30 volt, שכל אחד מהם נמשך 50 milliseconds במרווחים של second 1, באמצעות דגם BTX 830; ניתן להגדיר מערכות אחרות בהתאם להוראות היצרן.החזירו כל עובר ל-HBSS קר בקרח והמשיכו בהכנת דגימה של חצי המוח (hemisphere Explan) תחת מיקרוסקופ דיסקסיה (מיקרוסקופ פסקציה) באמצעות שתי פינצטות תכשיטים מספר 5. הסירו את העור ואת הגולגולת הסחוסית מראשו של העובר. לאחר מכן, החליקו פינצטה אחת מתחת למוח.כדי להוציא את המוח השלם מהגולגולת, בצעו דיסקציה של ההמיספרה שעברה אלקטרופורציה, כולל רקמת המוח האמצעי הצמודה אליה. היזהרו לא לפגוע בקרומי המוח (meninges) המכסים את ההמיספרה הקורטיקלית שהוסרה. מצאנו כי השלב המאתגר ביותר לשליטה הוא הדיסקציה וההוצאה של ההמיספרה שעברה אלקטרופורציה מבלי לפגוע בקרומי המוח.לאחר הניתוח, העבירו כל המיספירה לחמישה מיליליטר של HBSS קר בקרח, באמצעות טיפ של פיפט של מיליליטר אחד שהורחב. במידת הצורך, ניתן לשמור את העוברים בבארות נפרדות של צלח לתרבית רקמה בעל 12 בארות. לאחר מכן, העבירו בעדינות עד שישה המיספירות אל תרבית בקוטר 24 מילימטר מצופה קולגן.הכנסו וסדרו את התא (insert) כך שהצד המדיאלי פונה כלפי מטה. כעת מלאו באר (well) של 35 מילימטר בתוך צלח של שישה בארות ב-2.7 מיליליטר של מצע גידול (media) מועשר. הסירו כל שארית HBSS מהתא והניחו את התא לתוך הבאר עם המצע; בעזרת פיפטה, טפטפו מספר טיפות מהמצע שבבאר אל החלק העליון של כל רסס (explant).אין להגדיל את נפח המצע. מצאנו כי קריטי להניח מספר טיפות של מצע תרבית על גבי ה-X explan, כך שה-X explants אינם מכוסים במצע באופן מלא. הדבר עשוי להוסיף עד 400 microliters ל-2.7 mils של מצע על גבי ה-x explan.העבירו את הצלחת לתא בילאפס-רוטנברג (billups rothenberg chamber) המכיל צלחת מים להלחות אשר הוכשר באמצעות 95% oxygen למשך דקה אחת לפחות. אטמו את התא ונתקו את צינור אספקת הגז. הכניסו את התא לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים, זמן שבו יתרחש פיצול של ה-prepl.בשלב ההכנה. הכינו רפידות להטמעה של ההסבר. הכינו תמיסת ג'לטין מעור עגל בריכוז 10% בטמפרטורה של 60 °C.לאחר ההמסה, מזגו כ-10 milliliters של התמיסה לתוך צלחת בקוטר 10 centimeter. שמרו את שאר התמיסה בטמפרטורה של 60 °C לשימוש מאוחר יותר. אם יש בכך צורך, המתינו חצי שעה עד שהרפידות יתמצקו.ניתן לאחסנם בטמפרטורה של 4 °C למשך מספר ימים, אך יש לחממם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. ביום הקיבוע, בתוך מapay מתג, הכין את ה-Pagano, את המקבע ואת תמיסת ה-Pagano ללא מקבע. חמם את תמיסת הקיבוע ל-37 °C.הוציאו את האקספלאנטים מהאינקובטור בזהירות ובמהירות, כדי לא להפריע לרקמות. הסירו את רוב המצע והחליפו אותו بخמישה מיליליטרים של מקבע מחומם. ודאו שכל אקספלאנט טבול לחלוטין.קבעו את הרקמות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את חומר הקיבוע והחליפו אותו בתמיסת Pagano. ללא חומר קיבוע.הוסיפו מספר טיפות של sodium azide בריכוז 10% לכל באר. כעת ניתן לאחסן את הרקמות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד להטמעתן על משטח הטמעה. שרטטו רשת בתחתית הצלחת בעזרת סרגל.הכינו ריבועים בגודל של שני עד שלושה סנטימטרים. העבירו את האקספלאנטים הבודדים אל פד ההטמעה. שאבו בעזרת פיפטה שאריות של תמיסה וכסו כל אקספלאנט בתמיסת ג'לטין 10% חמימה.השאירו את התערובת להתקשות. לאחר שהתקשתה, הוסיפו באיטיות תמיסת ג'לטין נוספת עד שכל אקספלנט יהיה מוקף לחלוטין. הימנעו מהמסת הפד, דבר שעלול להתרחש אם תתווסף כמות גדולה מדי של ג'לטין בבת אחת.כעת, המתינו להקשחת הג'לטין למשך כשעה. לאחר ההקשחה, ניתן לחתוך את כל ה-explan למקטעים קטנים של ג'לטין לפני ביצוע החיתוכים. חשוב לבצע קיבוע לאחר מכן (post fix) של המקטעים במקבע Pagano למשך יום או יומיים.בעת החיתוך, מקמו את התרביות כך שהפקעת הריח (olfactory bulb) פונה כלפי מעלה, ובצעו חיתוך במישור הקורונלי בעובי של 100 micrometer. אספו את החתכים לתוך PBS מקורר עם 0.1% sodium azide.יש לאחסן את החתכים בטמפרטורה של 4 °C עד לביצוע הצביעה באמצעות הטכניקה המתוארת. השתלים של חצאי המוח השלמים הוכנו ב-E 13 לפני פיצול המבנה. בנאוקורטקס הדורסלי.הרקמה הכילה טרנסגן המדווח על נוירונים לא בשלים משושלת קורטקלית מעוררת. כירית קורטקלית מאותו שגר היו בקיבוע טיפה (drop fixed) באופן רצפי על פני תקופה של יומיים in vitro, ועובדו לצורך ניתוח היסטולוגי עוקב. בנקודת הזמן של הניתוח הראשוני, DIV 0, פיצול ה-prepl טרם התרחש ב-field one by one.DIV.ה-CP הפך גלוי והמשיך לגדול עד לשלב 2D IV. לפיכך, תרביות של נתחים של המיספרה שהוצמחו בתחילה ב-E 13, תמכו במשך יומיים בהבשלת קליפת המוח ותפסו את הפיצול המוקדם בנאו-קורטקס הדורסלי כדי לאשר התפתחות היסטולוגית תקינה בנאו-קורטקס הדורסלי. נתחי 2D IV נצבעו אימונו-היסטוכימית עבור chondroitin sulfate, פרוטאוגליקנים ורכיבי מטריקס חוץ-תאי. שני פסי תגובה אימונו-ריאקטיבית בקורטקס הדורסלי העידו על פיצול תקין של ה-PPP ל-MZ ו-SP במהלך תקופת התרבית in vitro.ה-PP פולח על ידי L שש נוירונים קורטיקליים המבטאים CTIP two ו-TBR R one. תבנית הצביעה האימונוכימית של סמנים אלו מאשרת את הביטוי המתאים של גורמי שעתוק אלו ב-cp שנוצר. יחד, ניתוחים אלו מאשרים התפתחות קורטיקלית מוקדמת ORGANOTYPIC בכל חציו של המוח (hemisphere explan); תוך שימוש בפרוטוקול המלא המתואר, הוזרקו חללי השמאל של עוברים שלמים ביום E 13.ניתן היה להבחין בביטוי GFP של תאי קדמונים עצביים שעברו אלקטרופורציה ועיבוד ב-vz. בעוד שתאים המבטאים GFP בעוצמה נצפו ב-IZ וב-cp, חשוב לציין כי נצפו נוירונים רבים חיוביים ל-GFP, המסומנים בחצי-חצים, בחלק העליון של ה-CP ההתגבש, עם דנדריטים ואקסונים בראשיתם. השכבה המובחנת בממשק שבין ה-CP ל-MZ מעידה על נדידה, עצירה ולמינציה תקינות.הדנדריטים התפשטו אל ה-MZ, בעוד שאקסונים קורטיקו-גנגליאריים התפשטו מתחת ל-CP ואל ה-iz שמתחתיו. התאים המבדילים היו תאים חיוביים ל-GFP במצבי בשלות משתנים, כולל נוירונים בעלי מורפולוגיה ביפולרית שסמוכים לסיבים רדיוגליאליים, ומתחתיהם נוירונים מולטיפולריים ב-iz. הדנדריטים התפשטו גם אל ה-MZ, שבו חלבון ה-ECM שנקרא reelin ממוקם באופן אימונו-לוקליזציוני מתאים.לפיכך, תנאי האלקטרופורציה וההשתלה מאפשרים התפתחות נורמלית של נוירונים קורטיקליים. כצפוי, נוירונים פוסט-מיטוטיים חיוביים ל-GFP התיישבו ב-cp שנוצר. לפיכך, הפרוטוקול יכול לסמן באופן מהימן נוירונים קורטיקליים של L six למחקרי נדידה והבשלה שלהם.שימוש נרחב בפרוצדורה זו הניב שיעור הצלחה של 79%. 195 מתוך 248 ניסיונות היו מתאימים לדימוי ולניתוח. מחצית מהכישלונות נבעו מכישלונו של ביטוי GFP או מפספוס של GFP ממוקד, ברגע שהשיטה נשלטה.ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 90 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור לתרגל את הדיסקציה כדי שניתן יהיה לתרבל את חצאי המוח שעברו אלקטרופורציה עם קרומי העטיפה (meninges) שלמים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה של השהיית זמן (time lapse microscopy), כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד מוטציות רלוונטיות משבשות את נדידת הנוירונים או את הדנדריגנזה.

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות...

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

כאן אנו מציגים פרוטוקול המספק כלי לבחינת מנגנוני ויסות של גנים ספציפיים במהלך התפתחות ההיפוקמפוס. שימוש באלקטרופורציה מחוץ לרחם ותרבית פרוסות אורגנוטיפית מאפשר ויסות למעלה ולמטה של ביטוי הגנים המעניינים בתאים בודדים ולעקוב אחר גורלם במהלך ההתפתחות.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

כתב יד זה מספק פרוטוקולים המשתמשים ב electroporation ברחם (IUE) כדי לתאר את הקישוריות המבנית של נוירונים ברמת התא בודד ועל הרגישויות של נוירונים שכותרתו fluorescently. היסטולוגיה משמש כדי לאפיין הדנדריטים ותחזיות axonal. הקלטה כל התא פרוס חריפה משמשת לחקור רגישות.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

למדו הכנת אקספלנטים שלמים של חצי כדור מוח עוברי עכברים באמצעות אלקטרופורציה ex utero לחקר התפתחות קליפת המוח הקדומה. שיטה זו מאפשרת מחקרים פרמקולוגיים והערכת השפעת מוטציות על נוירונים קורטיקליים.

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

גלה סרטונים נוספים