לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין דגימה של המיספירה המוחיות (cerebral hemisphere) כולה לצורך חקר ההתפתחות הקורטיקלית המוקדמת. דבר זה מושג תחילה על ידי קצירת עוברים של עכברים ביום העוברי 13. לאחר מכן, מזריקים את תערובת ה-DNA הפלסמי לתוך הפקעת המוחיות ומבצעים אלקטרופורציה מחוץ לרחם (ex utero electroporation).

לאחר מכן, הכינו חלק חצוי (explan) של המיספירה מהעובר שעבר אלקטורופורציה. השלב הסופי הוא קיבוע וחיתוך של החלק החצוי של המיספירה לצורך אנליזות היסטולוגיות. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעת המוטציה או החשיפה לרעלן על התפתחות נוירונים קורטיקליים באמצעות אנליזות אימונוהיסטולוגיות של נוירונים המבטאים GFP.

שמי אריק אולסון. אני מהמחלקה למדעי העצבים ופיזיולוגיה כאן באוניברסיטה הרפואית SUNY Upstate בסירקיוס, והיום נראה לכם שיטה שפיתחנו הנקראת whole Hemisphere X explan. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון slice explan, הוא ש-whole hemisphere X explan פשוטים להכנה ומספקים יומיים של צמיחה אורגנוטיפית.

השיטה יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-התפתחות, כגון כיצד מוטציה מסוימת או רעל משבשים את ההתפתחות המוקדמת של קליפת המוח. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, שכן הכנת חצי סהר שלם (explan) ללא פגיעה בקרומי המוח דורשת תרגול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי הניתוח והעברת ה-explan קשים ללמידה בשל הרגישות של הרקמה לנזק מכני.

ד"ר תרזה אוזי, פוסט-דוקטורנטית במעבדתי, תדגים את הפרוצדורה. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בערכה זמינה מסחרית לניקוי הפלסמידים. הכינו את ה-DNA הפלסמידי בריכוז של 0.33 milligrams per milliliter במים והוסיפו צבע fast green כסמן הזרקה בריכוז של כ-0.02%Weight by volume. חטאו תמיד את כלי הניתוח, את מרחב העבודה ואת המיקרוסקופ.

חטאו ב-70% ethanol ולאחר מכן הקריבו מספר נדרש של נקבות Swiss Webster ביום העוברים E 13 באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני. בעת הוצאת העוברים, הניחו אותם בצלחת של 10 סנטימטרים המכילה HBSS קר מאוד, כאשר הצלחת נשמרת קרה על קרח. בצעו דיסקציה זהירה של כל עובר מהקרומים חוץ-עובריים שסביבו.

כעת העבירו כל עובר בנפרד לצלוחית נקייה עם HBSS קר מאוד. באמצעות מזרק Hamilton, מזריקו שני עד שלושה מיקרוליטרים של ה-DNA שהוכן לתוך החדר של ההמיספרה המוחית השמאלית. אין להזריק לתוך או ליד האזור הקורטיקלי המיועד לניתוח עתידי.

כדי לבצע אלקטרופורציה ל-DNA, החזיקו את העובר בעדינות בעזרת פינצטה והניחו קלות את המגב (paddle) החיובי של אלקטרודת המלקחיים על קו האמצע הגבי של הראש. הניחו בעדינות את המגב השלילי מתחת לסנטרו של העובר. הפעילו תוכנית של חמישה פולסים של 30 volt, שכל אחד מהם נמשך 50 milliseconds במרווחים של second 1, באמצעות דגם BTX 830; ניתן להגדיר מערכות אחרות בהתאם להוראות היצרן.

החזירו כל עובר ל-HBSS קר בקרח והמשיכו בהכנת דגימה של חצי המוח (hemisphere Explan) תחת מיקרוסקופ דיסקסיה (מיקרוסקופ פסקציה) באמצעות שתי פינצטות תכשיטים מספר 5. הסירו את העור ואת הגולגולת הסחוסית מראשו של העובר. לאחר מכן, החליקו פינצטה אחת מתחת למוח.

כדי להוציא את המוח השלם מהגולגולת, בצעו דיסקציה של ההמיספרה שעברה אלקטרופורציה, כולל רקמת המוח האמצעי הצמודה אליה. היזהרו לא לפגוע בקרומי המוח (meninges) המכסים את ההמיספרה הקורטיקלית שהוסרה. מצאנו כי השלב המאתגר ביותר לשליטה הוא הדיסקציה וההוצאה של ההמיספרה שעברה אלקטרופורציה מבלי לפגוע בקרומי המוח.

לאחר הניתוח, העבירו כל המיספירה לחמישה מיליליטר של HBSS קר בקרח, באמצעות טיפ של פיפט של מיליליטר אחד שהורחב. במידת הצורך, ניתן לשמור את העוברים בבארות נפרדות של צלח לתרבית רקמה בעל 12 בארות. לאחר מכן, העבירו בעדינות עד שישה המיספירות אל תרבית בקוטר 24 מילימטר מצופה קולגן.

הכנסו וסדרו את התא (insert) כך שהצד המדיאלי פונה כלפי מטה. כעת מלאו באר (well) של 35 מילימטר בתוך צלח של שישה בארות ב-2.7 מיליליטר של מצע גידול (media) מועשר. הסירו כל שארית HBSS מהתא והניחו את התא לתוך הבאר עם המצע; בעזרת פיפטה, טפטפו מספר טיפות מהמצע שבבאר אל החלק העליון של כל רסס (explant).

אין להגדיל את נפח המצע. מצאנו כי קריטי להניח מספר טיפות של מצע תרבית על גבי ה-X explan, כך שה-X explants אינם מכוסים במצע באופן מלא. הדבר עשוי להוסיף עד 400 microliters ל-2.7 mils של מצע על גבי ה-x explan.

העבירו את הצלחת לתא בילאפס-רוטנברג (billups rothenberg chamber) המכיל צלחת מים להלחות אשר הוכשר באמצעות 95% oxygen למשך דקה אחת לפחות. אטמו את התא ונתקו את צינור אספקת הגז. הכניסו את התא לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים, זמן שבו יתרחש פיצול של ה-prepl.

בשלב ההכנה. הכינו רפידות להטמעה של ההסבר. הכינו תמיסת ג'לטין מעור עגל בריכוז 10% בטמפרטורה של 60 °C.

לאחר ההמסה, מזגו כ-10 milliliters של התמיסה לתוך צלחת בקוטר 10 centimeter. שמרו את שאר התמיסה בטמפרטורה של 60 °C לשימוש מאוחר יותר. אם יש בכך צורך, המתינו חצי שעה עד שהרפידות יתמצקו.

ניתן לאחסנם בטמפרטורה של 4 °C למשך מספר ימים, אך יש לחממם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. ביום הקיבוע, בתוך מapay מתג, הכין את ה-Pagano, את המקבע ואת תמיסת ה-Pagano ללא מקבע. חמם את תמיסת הקיבוע ל-37 °C.

הוציאו את האקספלאנטים מהאינקובטור בזהירות ובמהירות, כדי לא להפריע לרקמות. הסירו את רוב המצע והחליפו אותו بخמישה מיליליטרים של מקבע מחומם. ודאו שכל אקספלאנט טבול לחלוטין.

קבעו את הרקמות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את חומר הקיבוע והחליפו אותו בתמיסת Pagano. ללא חומר קיבוע.

הוסיפו מספר טיפות של sodium azide בריכוז 10% לכל באר. כעת ניתן לאחסן את הרקמות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד להטמעתן על משטח הטמעה. שרטטו רשת בתחתית הצלחת בעזרת סרגל.

הכינו ריבועים בגודל של שני עד שלושה סנטימטרים. העבירו את האקספלאנטים הבודדים אל פד ההטמעה. שאבו בעזרת פיפטה שאריות של תמיסה וכסו כל אקספלאנט בתמיסת ג'לטין 10% חמימה.

השאירו את התערובת להתקשות. לאחר שהתקשתה, הוסיפו באיטיות תמיסת ג'לטין נוספת עד שכל אקספלנט יהיה מוקף לחלוטין. הימנעו מהמסת הפד, דבר שעלול להתרחש אם תתווסף כמות גדולה מדי של ג'לטין בבת אחת.

כעת, המתינו להקשחת הג'לטין למשך כשעה. לאחר ההקשחה, ניתן לחתוך את כל ה-explan למקטעים קטנים של ג'לטין לפני ביצוע החיתוכים. חשוב לבצע קיבוע לאחר מכן (post fix) של המקטעים במקבע Pagano למשך יום או יומיים.

בעת החיתוך, מקמו את התרביות כך שהפקעת הריח (olfactory bulb) פונה כלפי מעלה, ובצעו חיתוך במישור הקורונלי בעובי של 100 micrometer. אספו את החתכים לתוך PBS מקורר עם 0.1% sodium azide.

יש לאחסן את החתכים בטמפרטורה של 4 °C עד לביצוע הצביעה באמצעות הטכניקה המתוארת. השתלים של חצאי המוח השלמים הוכנו ב-E 13 לפני פיצול המבנה. בנאוקורטקס הדורסלי.

הרקמה הכילה טרנסגן המדווח על נוירונים לא בשלים משושלת קורטקלית מעוררת. כירית קורטקלית מאותו שגר היו בקיבוע טיפה (drop fixed) באופן רצפי על פני תקופה של יומיים in vitro, ועובדו לצורך ניתוח היסטולוגי עוקב. בנקודת הזמן של הניתוח הראשוני, DIV 0, פיצול ה-prepl טרם התרחש ב-field one by one.DIV.

ה-CP הפך גלוי והמשיך לגדול עד לשלב 2D IV. לפיכך, תרביות של נתחים של המיספרה שהוצמחו בתחילה ב-E 13, תמכו במשך יומיים בהבשלת קליפת המוח ותפסו את הפיצול המוקדם בנאו-קורטקס הדורסלי כדי לאשר התפתחות היסטולוגית תקינה בנאו-קורטקס הדורסלי. נתחי 2D IV נצבעו אימונו-היסטוכימית עבור chondroitin sulfate, פרוטאוגליקנים ורכיבי מטריקס חוץ-תאי. שני פסי תגובה אימונו-ריאקטיבית בקורטקס הדורסלי העידו על פיצול תקין של ה-PPP ל-MZ ו-SP במהלך תקופת התרבית in vitro.

ה-PP פולח על ידי L שש נוירונים קורטיקליים המבטאים CTIP two ו-TBR R one. תבנית הצביעה האימונוכימית של סמנים אלו מאשרת את הביטוי המתאים של גורמי שעתוק אלו ב-cp שנוצר. יחד, ניתוחים אלו מאשרים התפתחות קורטיקלית מוקדמת ORGANOTYPIC בכל חציו של המוח (hemisphere explan); תוך שימוש בפרוטוקול המלא המתואר, הוזרקו חללי השמאל של עוברים שלמים ביום E 13.

ניתן היה להבחין בביטוי GFP של תאי קדמונים עצביים שעברו אלקטרופורציה ועיבוד ב-vz. בעוד שתאים המבטאים GFP בעוצמה נצפו ב-IZ וב-cp, חשוב לציין כי נצפו נוירונים רבים חיוביים ל-GFP, המסומנים בחצי-חצים, בחלק העליון של ה-CP ההתגבש, עם דנדריטים ואקסונים בראשיתם. השכבה המובחנת בממשק שבין ה-CP ל-MZ מעידה על נדידה, עצירה ולמינציה תקינות.

הדנדריטים התפשטו אל ה-MZ, בעוד שאקסונים קורטיקו-גנגליאריים התפשטו מתחת ל-CP ואל ה-iz שמתחתיו. התאים המבדילים היו תאים חיוביים ל-GFP במצבי בשלות משתנים, כולל נוירונים בעלי מורפולוגיה ביפולרית שסמוכים לסיבים רדיוגליאליים, ומתחתיהם נוירונים מולטיפולריים ב-iz. הדנדריטים התפשטו גם אל ה-MZ, שבו חלבון ה-ECM שנקרא reelin ממוקם באופן אימונו-לוקליזציוני מתאים.

לפיכך, תנאי האלקטרופורציה וההשתלה מאפשרים התפתחות נורמלית של נוירונים קורטיקליים. כצפוי, נוירונים פוסט-מיטוטיים חיוביים ל-GFP התיישבו ב-cp שנוצר. לפיכך, הפרוטוקול יכול לסמן באופן מהימן נוירונים קורטיקליים של L six למחקרי נדידה והבשלה שלהם.

שימוש נרחב בפרוצדורה זו הניב שיעור הצלחה של 79%. 195 מתוך 248 ניסיונות היו מתאימים לדימוי ולניתוח. מחצית מהכישלונות נבעו מכישלונו של ביטוי GFP או מפספוס של GFP ממוקד, ברגע שהשיטה נשלטה.

ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 90 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור לתרגל את הדיסקציה כדי שניתן יהיה לתרבל את חצאי המוח שעברו אלקטרופורציה עם קרומי העטיפה (meninges) שלמים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה של השהיית זמן (time lapse microscopy), כדי לענות על שאלות נוספות, למשל כיצד מוטציות רלוונטיות משבשות את נדידת הנוירונים או את הדנדריגנזה.