לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין הסבר שלם של חצי המוח לחקר התפתחות קליפת המוח המוקדמת. זה מושג על ידי קצירת עוברי עכברים ביום העוברי ה-13. לאחר מכן, הזרקו את תערובת ה-DNA של הפלסמיד לחדר המוח ובצעו אלקטרופורציה מחוץ לרחם.

לאחר מכן הכינו הסבר חצי כדור שלם מהעובר האלקטרופוט. השלב האחרון הוא לתקן ולחלק את כל ההסבר של חצי הכדור לניתוחים היסטולוגיים. בסופו של דבר, ניתן להעריך את התוצאה של מוטציה או חשיפה לרעלנים על התפתחות נוירונים בקליפת המוח על ידי ניתוחים היסטולוגיים חיסוניים של נוירונים המבטאים GFP.

שמי אריק אולסון. אני במחלקה למדעי המוח והפיזיולוגיה כאן באוניברסיטה הרפואית SUNY Upstate בסירקיוז, והיום אנחנו הולכים להראות לכם שיטה שפיתחנו שנקראת כל חצי הכדור X. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הרחבת פרוסות, הוא שחצי כדור X שלם הוא פשוט להכנה ומספק יומיים של צמיחה אורגנוטיפית.

השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות הנוירולוגית, כגון כיצד מוטציה או רעלן מסוים משבשים את ההתפתחות המוקדמת של קליפת המוח. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת כל ההמיספרה מבלי לפגוע בקרום המוח, יכולה לדרוש תרגול מסוים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הדיסקציה והעברת ההרחבה בשל רגישות הרקמה לשיבוש מכני.

שתדגים את ההליך תהיה ד"ר תרזה אוצי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. עבור פרוטוקול זה, השתמש בערכה זמינה מסחרית כדי לטהר את הפלסמידים. הכן את ה-DNA של הפלסמיד ב-0.33 מיליגרם למיליליטר במים והוסף צבע ירוק מהיר כעוקב אחר הזרקה בכ-0.02%משקל לפי נפח תמיד לחטא את כלי הניתוח, סביבת העבודה והמיקרוסקופ.

עם 70% אתנול מקריב את המספר הדרוש של סכרי וובסטר שוויצריים ב-E 13 על ידי שאיפת פחמן דו חמצני. כאשר העוברים מוסרים, מניחים אותם בצלחת של 10 סנטימטרים עם HBSS קר כקרח בצלחת שנשמרת קרה כקרח. נתח בזהירות כל עובר מהממברנות העובריות הנוספות שמסביב.

כעת העבירו כל עובר בנפרד לכלי נקי עם HBSS קר כקרח. בעזרת מזרק המילטון, הזרקו שניים עד שלושה מיקרוליטרים של ה-DNA המוכן לחדר של חצי המוח השמאלי. אין להזריק לאזור קליפת המוח או בקרבתו המיועד לניתוח עתידי.

כדי לאלקטרופוטציה של ה-DNA, החזק את העובר בעדינות בעזרת מלקחיים והנח קלות את ההנעה החיובית של אלקטרודת הפינצטה על קו האמצע הגבי של הראש. הנח קלות את ההנעה השלילית מתחת לסנטר העובר. הפעל תוכנית של חמישה פולסים של 30 וולט, 50 מילישניות כל אחד במרווחים של שנייה אחת באמצעות דגם BTX 830 וניתן להגדיר מערכות אחרות בהתאם להוראות היצרן.

החזירו כל עובר ל-HBSS הקר כקרח והמשיכו עם כל הכנת ההמיספרה תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות שני מלקחיים של תכשיטנים מספר חמש. הסר את העור והגולגולת הסחוסית מראש העובר. ההחלקה הבאה של מלקחיים מתחת למוח.

כדי להסיר את המוח השלם מהגולגולת, נתחו את ההמיספרה האלקטרופוטית, כולל רקמת המוח התיכון המחוברת. היזהר לא לפגוע בקרום המוח המכסה את חצי הכדור הקורטיקלי המנותח. מצאנו שהצעד הקשה ביותר לשליטה הוא דיסקציה והסרה של חצי הכדור של המצעד החשמלי מבלי לפגוע בקרום המוח.

לאחר הניתוח, העבירו כל חצי כדור לחמישה מיליליטר של HBSS קר כקרח באמצעות קצה פיפטה מורחב של מיליליטר אחד. במידת הצורך, ניתן לשמור את העוברים בבארות נפרדות של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות. לאחר מכן, העבירו בעדינות עד שש המיספרות לתרבית מצופה קולגן בגודל 24 מילימטר.

הכנס וסדר את הצד המדיאלי כלפי מטה. כעת מלאו באר של 35 מילימטר של צלחת שש בארות עם 2.7 מיליליטר של מדיה משלימה. הסר את כל עודפי ה-HBSS מהתוסף והנח את התוסף לתוך הבאר עם פיפטת המדיה כמה טיפות של המדיה מהבאר על החלק העליון של כל אקספלור.

אל תגדיל את נפח המדיה. מצאנו שזה קריטי להניח כמה טיפות של מצע תרבית על גבי אקספלור X, כך שצמחי ה-X לא מכוסים לגמרי במדיה. משמעות הדבר יכולה להיות הוספה של עד 400 מיקרוליטר ל-2.7 מיל של מדיה על גבי ה-x explan.

העבירו את הצלחת לתא רוטנברג של בילאפס המכיל צלחת מים מעניקה לחות והוחדרה ל-95% חמצן למשך דקה לפחות. אטום את החדר סגור ונתק את צינור אספקת הגז. הנח את החדר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים ועד אז יתבצע פיצול מוכן.

בהכנה. הכינו רפידות להטמעת האקספלור. הכינו תמיסת ג'לטין של 10% עור עגל בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.

לאחר המסה, שפכו כ-10 מיליליטר מהתמיסה לכלי של 10 סנטימטרים. שמור את התמיסה הנותרת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. אפשר לרפידות חצי שעה להתמצק במידת הצורך.

ניתן לאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים, אך יש לחמם אותם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. ביום הקיבוע במכסה אדים, הכינו את תמיסת פגאנו, קיבוע ופגאנו ללא קיבוע. מחממים את תמיסת הקיבוע ל -37 מעלות צלזיוס.

אחזר את הצמחים מהחממה מבלי להפריע לרקמות בזהירות ובמהירות. הסר את רוב המדיה והחלף אותה בחמישה מיליליטר של קיבוע מחומם. ודא שכל צמח שקוע לחלוטין.

תקן את הרקמות למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את הקיבוע והחלף אותו בתמיסת פגאנו. ללא קיבוע.

הוסף כמה טיפות של 10% נתרן אזיד לכל באר. כעת ניתן לאחסן את הרקמות בארבע מעלות צלזיוס עד שהן מוטמעות על משטח הטבעה. צייר רשת בתחתית המנה בעזרת סרגל.

יוצרים ריבועים של שניים עד שלושה סנטימטרים. העבירו את הצמחים הבודדים אל כרית ההטבעה. יש להסיר כל תמיסה שנותרה ולכסות כל תמיסת ג'לטין חמה של 10%.

הניחו לו להתמצק. לאחר שהתמצק לאט, הוסף עוד תמיסת ג'לטין עד שכל צמח מוקף לחלוטין. הימנע מהמסת הכרית, שעלולה להתרחש אם מוסיפים יותר מדי ג'לטין בבת אחת.

כעת, הניחו לג'לטין להתקשות כשעה. לאחר ההתקשות, ניתן לחתוך את האקספלן האישי לגושים קטנים של ג'לטין לפני החיתוך. חשוב לפרסם לתקן את הבלוקים ב-Pagano fixative ליום או יומיים.

בעת חתך. מקם את האקספלנטים עם נורת הריח כלפי מעלה וחתך במישור העטרה בעובי של 100 מיקרומטר. אוספים את החלקים ב-PBS צונן עם 0.1% נתרן אזיד.

אחסן את החלקים בארבע מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה להכתים אותם בטכניקה המתוארת. צמחים שלמים בחצי הכדור הוכנו ב-E 13 לפני הפיצול הקדם-לייט. בניאו-קורטקס הגבי.

הרקמה הכילה טרנסגן המדווח על נוירונים לא בשלים של שושלת קליפת המוח המעוררת. צמחים קליפת המוח מאותה המלטה הוטלו ברצף במשך תקופה של יומיים במבחנה ועובדו לניתוח היסטולוגי לאחר מכן. בנקודת הזמן הראשונית של הניתוח DIV עדיין לא התרחש פיצול אפס prepl בשדה אחד אחד.DIV.

ה-CP התברר והוא המשיך לגדול עד ל-2D IV.כך כל חצי הכדור שתרבית בתחילה ב-E 13, תמך יומיים בהתבגרות קליפת המוח ולכד פיצול פרלאט בניאו-קורטקס הגבי כדי לאשר התפתחות היסטולוגית תקינה בניאו-קורטקס הגבי. explan 2D IV היו כתם חיסוני לכונדרויטין סולפט, גליקנים של פרוטאג, ורכיב מטריצה חוץ-תאית. שתי רצועות של תגובתיות חיסונית בקליפת המוח הגבית הצביעו על פיצול מתאים של ה-PPP ל-MZ ו-SP במהלך תקופת התרבית במבחנה.

ה-PP פוצל על ידי L שישה נוירונים בקליפת המוח המבטאים CTIP שניים ו-TBR R אחד. דפוס הצביעה החיסונית של סמנים אלה מאשר את הביטוי המתאים של גורמי שעתוק אלה ב-cp החדש שנוצר. יחד ניתוחים אלה מאשרים התפתחות מוקדמת של קליפת המוח האורגנוטיפית בכל ההמיספרה באמצעות כל הפרוטוקול המתואר, החדר השמאלי של עוברי E 13 שלמים הוזרקו.

ניתן היה לצפות בביטוי GFP אלקטרופורטי ומעובד מקודמים עצביים ב-vz. בעוד שתאים המבטאים GFP אינטנסיביים נצפו ב-IZ וב-cp, חשוב לציין נוירונים חיוביים רבים של GFP המסומנים בראשי חץ בחלק העליון של ה-CP היוצר עם דנדריטים ואקסונים מתעוררים. השכבה הבדידה בממשק בין ה-CP ל-MZ מצביעה על הגירה, מעצר ולמינציה מתאימים.

הדנדריטים התפשטו לתוך ה-MZ ואילו האקסונים של קורטיקו אוגל השתרעו מתחת ל-CP ולתוך ה-iz. מתחת. התאים הממיינים היו תאים חיוביים ל-GFP במצבי בגרות משתנים, כולל נוירונים עם מורפולוגיה דו-קוטבית לצד סיבי רדיו גליה ומתחתיהם נוירונים רב-קוטביים ב-iz. הדנדריטים התפשטו גם לתוך ה-MZ שבו חלבון ה-ECM רידין ממוקם כראוי במערכת החיסון.

לפיכך, תנאי האלקטרופורציה והאקספלנט מאפשרים התפתחות תקינה של נוירונים בקליפת המוח. כצפוי, נוירונים חיוביים של GFP פוסט-מיטוטי אכלסו את ה-cp הנוצר. לפיכך, הפרוטוקול יכול למקד באופן אמין שישה נוירונים בקליפת המוח למחקר על נדידתם והתבגרותם.

שימוש נרחב בהליך זה הביא לשיעור הצלחה של 79%. 195 מתוך 248 ניסיונות התאימו להדמיה וניתוח. מחצית מהכישלונות נבעו מכישלון לבטא GFP או החמצת GFP ממוקד לאחר שליטה.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 90 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתרגל את הנתיחות כך שניתן יהיה לתרבית את ההמיספרות האלקטרופוטריות עם קרומי מוח שלמים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ זמן-lapse על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד מוטציות מעניינות משבשות את נדידת העצבים או אגנזה של דנדרי.