הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מווסתי שעתוק של כל גן מעניין באמצעות פרוטוקול טרנספקציה פשוט בתפוקה גבוהה ובדיקת לוציפראז זוהר כפול תוצרת בית. זה מושג על ידי תכנון ושיבוט ראשון של קבוצה ייחודית של פלסמידים מדווחים כפולים של לוציפראז. פלסמידים אלה מועברים ל-2 9 3 תאי T במיקרו-פלייט עם פלסמידים מספריית ביטוי DNA, כך שכל באר מועברת עם פלסמיד ספרייה יחיד.

לאחר 48 שעות, נבדקת פעילות לוציפראז גחלילית, ואחריה נבדקת פעילות לוציפראז וניל. השלב האחרון הוא חישוב יחסי הפעילות של גחלילית ללוציפראז וניל. בסופו של דבר, האינדוקציה היחסית של הגן המעניין בתגובה לכל ספרייה.

הגן מוסק על ידי היחס בין פעילות הגחלילית לפעילות לוציפראז וניל בכל באר לאחר נורמליזציה מבוססת צלחת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולי בדיקת מדווח קיימים הוא יכולתה לייצר במהירות נתונים פונקציונליים עבור מספר רב של גנים עם כוח אדם ועלות מינימליים. יום אחד לפני הטרנספקציה שנקבעה כיום הראשון של המסך, 2 9 3 תאי T יושבים לתוך 96.

תאי לוחות באר גודל, נספרים ומושעיים מחדש לריכוז של 1.5 כפול 10 עד התאים החמישיים למיליליטר. ב-DMEM המכיל 14% FBS שופכים את התאים למאגר סטרילי. הנח את המאגר עם שש צלחות עם תחתית שקופה, 96 בארות וקופסה של קצות פיפטות מסנן על סיפון הרובוט של מטפל הנוזלים האוטומטי.

יש להושיב שתי צלחות של תאים עבור כל לוחית ספרייה להקרנה. הוצא 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של כל צלחת לצפיפות של 1.5 כפול 10 לתאים הרביעיים לבאר. שלוש צלחות ספרייה יוקרנו בהדגמה זו.

מכאן שמכינים שש צלחות תאים צנטריפוגה את לוחות התאים ב 50 פעמים G למשך שתי דקות תוך שימוש במהירויות רמפה נמוכות כדי להבטיח צפיפות תאים שווה בכל באר. תמונה זו ממחישה כיצד התאים המצופים צריכים להיראות לאחר הצנטריפוגה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו חמצני למשך הלילה.

כדי להכין את הפלסמידים של הגחלילית והוניל, יש לדלל כל אחד לחמישה ננוגרם למיקרוליטר במים נטולי אנדוטוקסין בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. שלב את הדילולים ביחס של חמישה עד שלושה גחליליות לפלסמיד וניל לפי נפח. פיפטה הפלסמידים המשולבים לכל באר של צלחת 96 בארות המחלקת 17 מיקרוליטר לכל צלחת ספרייה, בתוספת שניים עד 10 מיקרוליטר עודפים לכל תאי באר מועברים ביום השני של המסך.

כדי להתחיל בהליך זה עבור כל צלחת ספרייה מערבבים 107.5 מיקרוליטר של פגם בטמפרטורת החדר עם 4.3 מיליליטר של מדיה נטולת סרום, דילול של 1 עד 40 בצינור פוליסטירן מודגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מחלק 44 מיקרוליטר לכל צלחת ספרייה לכל באר של צלחת פוליסטירן V 96 באר. הנח את לוחית ה-DNA של הספרייה, לוחית אפקט הבחירה המדוללת, לוחית הפלסמיד של הכתב וקופסת קצות פיפטה על סיפון הרובוט שואבים. 17 מיקרוליטר של פלסמידים מדווחים, 43 מיקרוליטר של אפקט אופציה מדולל ו-26 מיקרוליטר של DNA ספרייתי, תוך הכנסת מרווח אוויר של חמישה מיקרוליטר בין כל שאיפה.

יש לשאוב את ה-DNA של הספרייה אחרון כדי למנוע זיהום צולב. מחלקים את תכולת הקצוות לכיסוי תערובת צלחת פוליסטירן V תחתית חדשה ומניחים בצד למשך 20 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של DNA שומנים. אם מעבירים מספר לוחות ספרייה, החלף את קצות הפיפטה ואת לוחית הספרייה וחזור על הפעולה לאחר 20 דקות, חשוף את לוחית תערובת ה-DNA של אפקט הבחירה והנח אותה על סיפון הרובוט עם שתי צלחות של 2 9 3 תאי T באמצעות קופסה אחת של קצות פיפטה.

שאפו 80 מיקרוליטר מתערובת ה-DNA של אפקט הבחירה והוציאו לאט 40 מיקרוליטר לבאר לכל צלחת תאים. מכסים את התאים לאחר הוספת תערובת ה-DNA של אפקט ה-opt לתאים בכל הצלחות. צנטריפוגה את הצלחות ב -1, 200 פעמים G למשך 30 דקות.

מחזירים את הצלחות לחממה ומדגרים תאים למשך ארבע עד שש שעות. במהלך דגירה זו, הכינו מדיה טרייה על ידי ערבוב של 12 מיליליטר DMEM המכילים 10% FBS ו-10 מיקרוגרם למיליליטר ציפרופלוקסין. עבור כל צלחת ספרייה שהועברה, שפכו מדיה טרייה למאגר סטרילי.

לאחר מכן הניחו על סיפון הרובוט שתי קופסאות של טיפים רובוטיים, צלחת תאים אחת, המאגר המכיל מדיה טרייה ומאגר פסולת. לאחר מכן שואבים 100 מיקרוליטר מדיה מהתאים ומחלקים למאגר הפסולת, מלא חלקית באתנול 70%. בעזרת טיפים טריים שואבים 100 מיקרוליטר של מדיה טרייה ומפזרים לאט לאט על התאים.

מחזירים את הצלחות לחממה למשך 48 שעות. מבחני הגחלילית והוניל לוציפראז מבוצעים. 48 שעות לאחר ההעברה ביום הרביעי של המסך עבור כל לוחית ספרייה, הכינו שמונה מיליליטר של שלושה x מאגר בדיקת גחליליות ו-12 מיליליטר של שלושה x מאגר בדיקת וניל מפתרונות המלאי שלהם מחלקים 82 מיקרוליטר של מאגר בדיקת גחליליות לכל באר של צלחת תחתית 96 באר V עבור כל לוחית ספרייה שתיבדק.

באופן דומה, חלקו 122 מיקרוליטר של מאגר בדיקת וניל לכל באר של צלחת תחתית אחרת של 96 באר V. כדי שכל צלחת תיבדק, הניחו בצד את שני מאגרי הבדיקה. הנח קופסת קצות פיפטה, מאגר פסולת ושתי צלחות תאים שהועברו מאותה לוחית ספרייה על סיפון הרובוט, שאב 60 מיקרוליטר מדיה מכל צלחת והשליך במאגר הפסולת המלא חלקית בלוחות כיסוי אתנול 70% והניח בצד.

לאחר מכן הניחו שתי קופסאות של קצות פיפטה. הצלחת של שלושה x מאגר בדיקת גחליליות וסט של לוחות תאים על סיפון הרובוט. שאפו 40 מיקרוליטר של שלושה x מאגר בדיקת גחליליות והוסיפו אותו לצלחת התאים הראשונה, תוך ערבוב יסודי.

מעבר לקצוות פיפטות חדשים. חזור על הפעולה עבור לוחית התא השנייה. הנח את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות להשלמת הליזה.

רשום זוהר מכל באר של כל לוחית תא ברישום הלומינומטר למשך שנייה אחת לכל באר. החזר את הצלחות לסיפון הרובוט. הנח שתי קופסאות של קצות פיפטה, צלחת של שלושה x מאגר בדיקה וסט של לוחות תאים על סיפון הרובוט.

שאפו 60 מיקרוליטר של שלושה x מאגר בדיקת וניל והוסיפו אותו לצלחת התאים הראשונה. ערבוב יסודי. עוברים לקופסה חדשה של קצות פיפטות.

חזור על הפעולה עבור לוחית התא השנייה. רשום זוהר מכל הלוחות על לומינומטר. הקלטת כל באר למשך שנייה אחת.

ערכי לוציפראז אופייניים לחצי צלחת בודדת מוצגים בטבלאות אלה. יחס הזוהר של הגחלילית לחידוש או יחס F שני R עבור כל באר מחושב על ידי חלוקת ספירת אות הגחלילית בספירת אות החידוש והתוצאות מוצגות בלוח C.לוח D מציג את ערך האינדוקציה עבור כל באר המחושב על ידי חלוקת יחס F שני R של הבאר ביחס F שני R הממוצע של הצלחת, למעט 25% הגבוהים והנמוכים ביותר של הבארות. יש לחשב את ממוצע ערכי האינדוקציה על פני שכפולים עבור לוח ספרייה יחיד שעבר טרנספטציה.

וגנים הגורמים או מדכאים אלפא סינוקלאין יותר מפי שלושה נחשבים ללהיטים. שימו לב למשרה 32 הקיפול בבאר H 2 בתוצאה מייצגת זו המוצגת כאן הוא ייצוג גרפי של ערכי אינדוקציה עבור הצלחת הבודדת עם באר H 2 מודגשת בכחול. Hi.H 2 הוא גורם שעתוק עצבי שלא היה קשור בעבר לביטוי אלפא סינוקלאין.

חשוב לוודא שהמסך מבוצע בטווח הליניארי של מבחני המדווח כך ששיבוטים הגורמים לביטוי מוגבר יימדדו כאשר פעילות לוציפראז מוגברת לתאי קצה זה הועברו עם כמויות הולכות וגדלות של פלסמידים של גחלילית ווניל לוציפראז תחת שליטת המקדם והבדיקה החזקה H-C-M-V-I-E. עם פרוטוקול זה, נצפה כי פעילות הגחליליות נשארת ליניארית בטווח רחב של ערכים. בעוד שהעקומה לפעילות וניל משתטחת מעל 15 ננוגרם לבאר.

כמו כן, חשוב לבצע את הבדיקות מיד לאחר שלב הדגירה כדי למנוע אי-ליניאריות עקב דלדול המצע. מהלך זמן של אות דעיכה לבדיקת לוציפראז גחלילית חשף פעילות משמעותית של לוציפראז גחליליות עד שעה לאחר הוספת ריאגנטים באמצעות פרוטוקול זה, 7,670 גנים אנושיים נבדקו ו-68 מווסתים חדשים של אלפא סינוקלאין זוהו בסופו של דבר בתוצאות המייצגות המוצגות כאן. כל קו אופקי מייצג יחס אינדוקציה של פגיעה בגן בודד בהשוואה למשרה ניטרלי GFP מבוקר.

קווים כחולים מייצגים גורמים חיוביים בעוד שהקו האדום היחיד מייצג מדכא ערכי אינדוקציה מחושבים כיחס בין מקדם אלפא סינוקלאין המניע את פעילות לוציפראז הגחלילית למקדם ה-CMV המניע פעילות לוציפראז של כל פגיעה, מנורמל לאותה בדיקת מבנים של לוציפראז באמצעות משרה GFP בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי בשילוב עם ביטוי יתר נוסף ומבחני נוקדאון על מנת להבטיח שפגיעות שזוהו מווסתות את המטרה האנדוגנית.