Name: דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למדו שיטת ChIP-seq איכותית לזיהוי אזורי קישור חלבונים ל-DNA בגנום. הפרוטוקול כולל קישור צולב, שסע DNA, ניצוץ immunoprecipitation ובידוד DNA לריצוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכת על ידי פרס מכון לפיתוח מבית החולים לילדים של פילדלפיה.

1. הכרומטין חוצה קישור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בתרבית תאי 100x20mm מנות. כמות התאים יכולה לנוע בין 1 ל -10 מיליון תאים לכל מנה בהתאם לסוג התא. כ -2 מיליון תאים מספיקים לimmunoprecipitation אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צולבות קישור בפורמלין 1% למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר עם נדנדה מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הצלב מקשר על ידי הוספת ריכוז סופי של 125 מ&quot;מ גליצין ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם פוספט 1X שנאגרו מלוח (PBS) פעמיים, למזוג PBS, ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים עם מגרד תא פלסטיק לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ב 2000 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר תמוגה SDS (1% SDS, EDTA 10mm, 50mm טריס-HCl pH 8.1) לכל תא lysate או לשמור אותם כגלולה להפקת נשק גרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לשמור תאים ב -80 ° C, או אחד יכול להמשיך immediatאיליי עם sonication. </li></ol> 2. הכן את הגרעינים (המשך שלב 3.5 לlysate תא השלם) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים את מאגר תמוגה סלולרי (5 מ&quot;מ pH 8.0 צינורות, 85 מ&quot;מ KCl, 0.5% NP-40) עם 1X אינהיביטור proteinase כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מופשר תא גלולה בכ 10 פעמים בנפח גלולה עם הצפת תמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce-Homogenize 10 פעמים עם העלי אז לדגור על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב -4,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant, ולשמור גלולה גרעינית. </li></ol> 3. Sonication * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את מאגר תמוגה SDS וסכום תוספת של חיץ לשימוש עם מעכבי proteinase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גרעינית גלולה בSDS תמוגה המאגר (כ 0.5 מ&quot;ל של חיץ ל1-10,000,000 תאים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל aliquots של דגימות לצינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate על קרח רטוב באמצעות sonicator Misonix עם 30 שניות על 45 שניות וליד הגדרת משרעת של 2. מספר המחזורים לגודל שבר אידיאלי ניתן לקבוע על ידי ראשון שניסה את מספרים שונים (מחזור 2 שמ &#39;, 4, 8, 12, 16, 20 או יותר ומחזורים). מותג של sonicator שונה עשוי לשמש, לעומת זאת, התנאים ישתנו. ניסויים עם מספר המחזורים ואת כמות זמן וכיבוי חייבים להתבצע על מנת לקבוע את התנאים אידיאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 20 μl של כל דגימה כדי לבדוק את תוצאות sonication ולעשות כימות,. שאר המדגם ניתן לאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 20 μl של מדגם על ידי הוספת 30 μl של הצפת TE 0.1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את המדגם עם μl 1 של RNase על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן להוסיף μl 1 של proteinase K ו לדגור על 62 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ 20 μl של המדגם על 2% ג&#39;ל agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הסכום הנותר של מדגם עם ערכת טיהור PCR QIAquick אז לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. </li></ol> * לצ&#39;י המקוריP, עיכול nuclease microccocal ניתן להשתמש לחלופין גזירת ה-DNA. 4. חרוזים agarose לחסום * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חרוזים כבר חסומים, המשך לשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלבון או חלבון G agarose. במשך 5 immunoprecipitations (IPS), השתמש ב600 μl של 50% חרוז תרחיף (300 μl חרוז גלולה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את החרוזים, לסובב אותם ב 800 סל&quot;ד דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס וזורקים supernatant. הוסף מעט יותר מ -2 חיץ דילול שבב מ&quot;ל (0.01% SDS, EDTA 1.2 מ&quot;מ, 167 מ&quot;מ NaCl, 1.1% טריטון X-100, 16.7 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.1) ומערבב על ידי לאט צינור היפוך 10X. ספין למטה שוב ב800 סל&quot;ד דקות 1 על 4 מעלות צלזיוס וזורקים supernatant. חזור על לשטוף פי 2 יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את חרוזים על ידי סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחסימת פתרון. עיין בטבלה 1 למתכון של פתרון החסימה. </li></ol> 5. הכרומטין מראש ברור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו sonicated הכרומטין על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה בסל&quot;ד ו 12,000או 10 דקות ב 4 ° C ואז לשים על קרח מייד כדי להסיר SDS (לבן גלולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant, להשליך גלולה, ולשלב דוגמאות במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הסכומים דרושים לצורך הניסוי המבוסס על חישובים (1-10 UG של הכרומטין ל-IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל הכרומטין 10X בחיץ דילול שבב בתוספת מעכב proteinase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של חרוזים חסומים ל-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li></ol> 6. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה דגימות ב 800 סל&quot;ד דקות 1 ולהעביר את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה supernatant ב 800 סל&quot;ד דקות 1 והעברה לצינור נקי אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 20 μl של supernatant, לשמש כשליטת קלט, ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הכרומטין למספר כתובות IP שצריך לעשות בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 UG של נוגדן לUG 1-10 של הכרומטין לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה 4 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של חרוזים חסומים לכל דגימת ה-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה החרוזים על ידי שצנח ב 800 סל&quot;ד דקות 1 ולבטל כמה שיותר את supernatant ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם עם חיץ לשטוף קומפלקס חיסוני דל מלח. הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ לכל צינור, לסובב בטמפרטורת חדר למשך 5-8 דקות, ספין למטה בסל&quot;ד 800 דקות 1, ולאחר מכן להשליך supernatant. חזור על לשטוף פעם עם חיץ גבוה מלח חיסוני קומפלקס לשטוף ולשטוף חיץ קומפלקס חיסוני LiCl ופעמים עם חיץ TE עבור סכום כולל של 5 כביסות (טבלה 2). </li></ol> 7. Elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קלט להפשיר מהיום קודם לכן כדי להיות מעובד עם eluants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Elution הצפת טרי (טבלה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תערובת הורים של ההצפה elution מספיק נחוצה לשב&quot;ס ודגימות בקרת קלט בתוספת 1-2 דוגמאות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 ההצפה elution μl לכל דגימת ה-IP ולדגור על טמפ &#39;החדר למשך 15 מ&#39;בעם סיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה בסל&quot;ד 800 דקות 1 ולהוסיף supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl נוסף של הצפת elution על צינור אחד של חרוזים ולדגור על טמפ &#39;החדר במשך 15 דקות עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במשך 15 שניות לאחר דגירה; ספין למטה ב 5000 סל&quot;ד דקות 1, ולאחר מכן לשלב את supernatant עם supernatant מelution הראשון. (ודא שאין חרוזים שנשארו בsupernatants. אם אינך בטוח, ספין למטה supernatant שוב ב 5000 סל&quot;ד דקות 1 ולאסוף את supernatant בצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 180 μl של ההצפה elution ל20 μl של דגימות בקרת קלט. </li></ol> 8. היפוך חוצה קישור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לμl 200 של eluants ובקרות קלט, להוסיף 8 μl של 5 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חותם עם parafilm ודגירה באמבט מים ב 65 ° C במשך הלילה. </li></ol> 9. טיהור ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בכל דגימה עם μl 1 של RNase עבור שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של 0.5 M EDTA, 8 1M μl טריס-HCl, לערבב, ואז להוסיף μl 1 של proteinase K לכל דגימה ולדגור על 45 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הדגימות באמצעות ערכת טיהור PCR QIAquick. ניתן לשמור את הדגימות ב -20 ° C ו-PCR בדיקה יכולה להיעשות במועד מאוחר יותר. </li></ol> * לחלופין, חרוזים מגנטיים שבב כיתה ניתן להשתמש במקום של agarose עבור חלק immunoprecipitation. 10. סימון ה-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת PCR, השתמש פריימרים לאזורים ידועים להיות מחויבים לחלבון של עניין. כמו כן, השתמש פריימרים לאזורים בלתי מחייבים כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את חומרים כימיים לתגובה. לדלל מדגם קלט ב1:100 (טבלה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובה. תכנית ה-PCR: </li></ol> שלב 1: 94 ° C 3 דקות שלב 2: 94 מעלות צלזיוס 20 שניות 59 ° C 30 שניות 72 ° C 30 שניות (חזור על שלב 2 עבור לפחות 30 cycles) שלב 3: 72 מעלות צלזיוס 2 דקות <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דוגמאות על 1% agarose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העשרה גם ניתן לקבוע כמותית עם PCR בזמן אמת. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
<li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stats%3A+multifaceted+regulators+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+re-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).</li>
<li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li>
<li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14%2C000+cases+of+seven+common+diseases+and+3%2C000+shared+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li>
<li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li>
<li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li>
<li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li>
<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עכשיו זה אפשרי לבצע את פרופיל הגנום של עמותת אינטראקציות חלבון דנ&quot;א באמצעות שבב ואילך, כפי שהודגם לאחרונה עם גורמי שעתוק אחרים 2,3. המפתח לתוצאה מוצלחת הוא רצף של דור תבנית immunoprecipitation הכרומטין באיכות גבוהה ה-DNA. ברגע שתבנית ה-DNA כבר נוצר והוברר להיות מועשרים במידה מספקת, ואז אחד יכול לקחת את זה בספריית הכנה עבור סידור שלאחר מכן. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול ספריית הרצף מסופק על ידי הספ...

במשך שנים רבות יש כבר צורך מסופק לזהות הסט של גנים כפותים ומוסדרים על ידי חלבון נתון הגנום רחב, במיוחד אלה בכיתה גורם שעתוק. אודום et al. 1 משמש הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בשילוב עם microarrays האמרגן לזהות באופן שיטתי את הגנים שנכבשו על ידי רגולטורים תעתיק שהוגדרו מראש בכבד האנושי ואיי לבלב. כתוצאה מכך, ג&#39;ונסון ואח&#39;. 2 פיתחה assay immunoprecipitation הכרומטין בקנה מידה גדולה המבוסס על רצף ישיר אולטרה תפוקה גבוהה DNA (שבב ואילך) על מנת למפות באופן מקיף אינטראקציות-DNA חלבון על פני הגנום כולו יונקים. כמקרה מבחן, הם מיפו in vivo המחייב של הגורם מגביל משתיק נוירון (NRSF) עד 1946 מקומות בגנום האנושי. הנתונים מוצגים ברזולוציה חדה של עמדה מחייבת (+ 50 זוגות בסיסים), שאפשרה גם ליsolation של מוטיבים וזיהוי של מוטיבים NRSF מחייבים. גם היו נתונים שבב seq אלה רגישות גבוהה וספציפיות וביטחון סטטיסטי (p -4 &lt;10), תכונות שחשובות להסקת מסקנות אינטראקציות מועמד חדשה. רוברטסון et al. 3 משמשים גם שבב ואילך על מנת למפות STAT1 מטרות באינטרפרון-γ (IFN-γ) מגורה וunstimulated תאי S3 הלה אדם in vivo. על ידי שבב ואילך, באמצעות 15.1 ו12.9 מיליון רצף ממופה ייחודי קורא, ושיעור גילוי שקר משוער של פחות מ 0.001, הם זיהו 41,582 11,004 ואזורים STAT1 מחייבים משוערת בתאי מגורה וunstimulated, בהתאמה. מ -34 הלוקוסים ידועים STAT1 4-8 אתרי קישור אינטרפרון מגיבים, שבב אילך מצא 24 (71%). מטרות שבב seq היו מועשרים ברצפים דומים לSTAT1 מוטיבים מחייבים ידועים. השוואות עם שני נתונים שבב ה-PCR קיימים מגדירה הציעושרגישות שבב אילך הייתה בין 70% ו 92% וסגוליות היה 95% לפחות. בנוסף, היה ברור שהשבב ואילך מציע גם מורכבות אנליטית נמוכות ורגישות שעולות עם רצף עומק. כמו טכנולוגיות רצף הגנום כגון, &quot;הדור הבא&quot; לספק 1-2 סדרי גודל גידול בסך של רצף שיכול להיות זולה ויעיל שנוצר על פני טכנולוגיות ישנות 9. שיטות שבב seq לכן ישירות לספק כיסוי הגנום כולו לאפיון יעיל של אינטראקציות-DNA חלבון 3 יונקים. בשנת 2006, קשר חזק של גרסאות בגורם השעתוק דמוי 7 2 (TCF7L2) גן עם סוכרת מהסוג 2 התגלה 10. חוקרים אחרים כבר משוכפלים באופן עצמאי את הממצא הזה בקבוצות אתניות שונות ומעניין, מן הגנום מחקרי העמותה הרחב הראשונים של סוכרת מהסוג 2 שפורסמו בכתב עת Nature 11,12 </sעד&gt;, מדע 13-15 ובמקומות אחרים 16,17, הקשר החזק ביותר אכן היה עם TCF7L2, זה נחשב כיום הממצא הגנטי המשמעותי ביותר בסוכרת מהסוג 2 עד כה 18-20. בנוסף, TCF7L2 נקשר לסיכון לסרטן 21,22, ואכן, הקשר הזה היה ברור יותר, כאשר מוקד 8q24 מתגלה על ידי מחקרי עמותה רחבות הגנום של מספר סוגי הסרטן, כולל קרצינומה של מעי גס, הוצג להיות בשל הזרם קיצוני אלמנט TCF7L2 מחייב נהיגה השעתוק של MYC 23,24. ככזה, יש עניין רב בקביעת גנים במורד הזרם מוסדרים על ידי גורם שעתוק זה מפתח. בהתבסס על ניסיון של עם TCF7L2 כדוגמה למתודולוגיה, מאמר זה מתאר כיצד ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה. צ&#39;יפ היה מתבצע בשורת תאי סרטן המעי הגס, HCT116, עבור סידור שלאחר מכן על מנת לבנות גבוה Resolמפת ution מהגנים מאוגדים על ידי TCF7L2 25 במאמץ להניב תובנה נוספת לתפקיד המרכזי שלה בפתוגנזה של תכונות מורכבות.

<table><tbody><tr><td>QIAquick PCR טיהור ערכת</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ChIP ערכת </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq התחלה חמה פולימראז </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר </td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><רצפי פריימר בקרה חיוביים >TCF7L2-1)</חזק> קדימה- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' הפוך- 5'-GCTCACCCTCTGTATCTTCG-3' <רצפי פריימר בקרה שליליים > (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGTGATGGGAAC-3' הפוך- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-dna רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

שבב רצף (Chip-אילך) שיטות להציע ישירות כיסוי הגנום כולו, שבו שילוב של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) ויכול להיות מנוצל רצף מקביל מסיבי כדי לזהות את הרפרטואר של רצפי DNA יונקים מאוגדים על ידי גורמי שעתוק in vivo. &quot;דור הבא&quot; טכנולוגיות רצף הגנום לספק 1-2 סדרי גודל גידול בסך של רצף שיכול להיות זול ויעיל שנוצר על פני טכנולוגיות ישנות יותר ובכך מאפשר לשיטות שבב seq כדי לספק כיסוי הגנום כולו ישירות לפרופיל יעיל של יונקים אינטראקציות חלבון ה-DNA. למוצלחים שבב seq גישות, צריך ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר רצף. התיאור מבוסס סביב ניסיון עם מוצר החלבון של הגן הכי חזק מעורבים בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, כלומר גורם שעתוק גורם השעתוק דמוי 7 2 (TCF7L2). גורם זה גם היה מעורב בסוגים שונים של סרטן. התווה הוא איך ליצור תבנית ה-DNA שבב באיכות גבוהה הנגזרת משורת תאי קרצינומה של המעי הגס, HCT116, על מנת לבנות את המפה ברזולוציה גבוהה באמצעות רצף כדי לקבוע את הגנים מאוגדים על ידי TCF7L2, נותן תובנה נוספת לתפקיד המרכזי שלה בפתוגנזה של תכונות מורכבות.

ברגע שהכרומטין כבר sonicated וטופל עם RNase וproteinase, הדגימות לרוץ על 2% ג&#39;ל agarose צריכה להציג למרוח עם חלק הארי של ה-DNA בגודל הרצוי. אם מספר מחזורים שונים נבדקים, ירידה הדרגתית בגודלו יש לראות במספר מחזורי הגידול (איור 2). לאחר שסיים את חלק immunoprecipitation של הפרוטוקול או ניתן לבדוק את ההעשרה על ידי PCR או PCR בזמן אמת. לקבלת דוגמיות PCR לרוץ על ג&#39;ל agarose צריכה להיות בלהקות ה...

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות אזורי קישור של חלבונים באמצעות כרומטין. דבר זה מושג תחילה על ידי קישור צולב (cross-linking) של החלבון ל-DNA. השלב השני הוא גזירה (shearing) של ה-DNA.בשלב הבא, החלבון מטרה הקשור ל-DNA עובר שיקוצון חיסוני ולאחר מכן שטיפה. השלב הסופי הוא ביטול הקשירה הצולבת ובידוד ה-DNA. בסופו של דבר, שימוש בשיקוצון חיסוני של כרומטין מאפשר להראות את מיקומי קישור החלבון לאורך הגנום.שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה הפונקציונלית, כגון זיהוי ומיפוי של אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA ברקמה או בקו תאים נתון. התאים להליך זה גודלים בצלחות תרבית תאים במידות של 100 על 20 מילימטר. כמות התאים יכולה להשתנות בין מיליון אחד ל-10 מיליון תאים לצלחת, בהתאם לסוג התאים. כ-2 מיליון תאים מספיקים לביצוע אימונופרסיפיטציה אחת כדי ליצור קשרים חוזרים (cross-link) בין החלבון לכרומטין בתאים.הוסיפו פורמאלדהיד לריכוז של 1% והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור מדי פעם. בטלו את הצלוב (quench cross-linking) על ידי הוספת גליצין לריכוז סופי של 125 millimolar והדגרה למשך חמש דקות. שטפו את התאים פעמיים ב-one x phosphate buffered saline בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה השנייה, שפכו את ה-PBS והוסיפו 0.2 milliliters של PBS טרי. אספו את התאים באמצעות מגרדת תאים פלסטית לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. סובבו את התאים ב-2000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שאבו את הנוזל העליון (supernatant) לצורך מיצוי גרעיני. שמרו את התאים כמשקע להכנת ליזאט של תא שלם, אשר יודגם במקטע הבא. השביהו מחדש את התאים בבופר ליזיס SDS; ליזאטים של תאים שלמים מוכנים מהתאים הקשורים בצלב (cross-linked) באמצעות סוניקציה על קרח רטוב.על מנת להשיג את גודל מקטע ה-DNA האידיאלי, יש לאפתים את הפרוצדורה על ידי התנסות בתנאי סוניקציה שונים. יש להשאיר את הדגימות על קרח לאורך כל התהליך. בצעו סוניקציה לכל דגימה בהגדרות הבאות: 30 שניות פעילות ו-45 שניות מנוחה, בהגדרת אמפליטודה 2.בדוגמה זו, נדרשים 12 מחזורים כדי להשיג את גודל הפרגמנט האידיאלי. אספו 20 µL מכל דגימה כדי לבדוק את תוצאות הסוניקציה ולצורך כימות. את שאר הדגימה ניתן לאחסן במינוס 80 °C.דללו את הדגימה בנפח של 20 µL על ידי הוספת 30 µL של בופר 0.1 XTE. לאחר מכן, טפלו בדגימה באמצעות 1 µL של RNAs A בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של proteinase K והדגרימו בטמפרטורה של 62 °C למשך שעתיים.לאחר הטיפול ב-proteinase K, יש להריץ 20 µL מהדגימה על ג'ל agarose בריכוז 2%. הדגימות צריכות להציג מריחה (smear), כאשר מרבית ה-DNA נמצא בגודל הרצוי. במידה ונבדקו מספר מחזורים שונים, צריכה להיראות ירידה הדרגתית בגודל.ככל שמספר המחזורים עולה, את הכמות הנותרת של הדגימה יטהרו באמצעות ערכת kaya quick PCR purification ויכמתו באמצעות NanoDrop spectra של TER לפני תחילת הליך זה. דגימות כרומטין שעברו סוניקציה של Fava על קרח ייסובו בצנטריפוגה במהירות של 12,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש להניח על קרח באופן מיידי.להסרת ה-SDS, המופיע כמשקע לבן. אספו את העילוי והשליכו את המשקע מכל דגימה. שלבו דגימות במידת הצורך, והפרישו את הכמויות הדרושות לניסוי על בסיס חישובים קודמים.דרושים 1 עד 10 מיקרוגרם של כרומטין לכל אימנונופרסיפיטציה. דללו את הכרומטין ביחס של 1 ל-10 בבופר דילול בתוספת מעכב פרוטאינאז. הוסיפו 100 מיקרוליטר של חרוזים חסומים לכל אימנונופרסיפיטציה והסובבו בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת.התחילו את הפרוצדורה להשקיע immunoprecipitation של כרומטין על ידי סבב של הדגימות ב-800 RPM למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 °C, והעברה של כל עליל (supernatant) לפ menutup פלסטיק נקי. סבבו את העליל ב-800 RPM למשך דקה אחת והעבירו לשפופרת נקייה נוספת. שמרו 20 µL מהעליל בטמפרטורה של 20- °C כדי שישמשו כבקרת input.בהמשך, חלק את שאר הכרומטין למספר השקיעות החיסוניות הנדרשות בניסוי. לכל דגימה, הוסף שני מיקרוגרם של נוגדן עבור כל 1 עד 10 מיקרוגרם של כרומטין, והדגרה למשך לילה בטמפרטורה של 4°C תוך כדי סיבוב. למחרת בבוקר, הוסף 100 µL של חרוזי Protein A/G חסומים לכל דגימה של שקיעה חיסונית. הדגרה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C תוך כדי סיבוב; לאחר שעה אחת.שקעו את החרוזיים על ידי סבוב של 800 RPM למשך דקה אחת. השליכו כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant). שטפו את החרוזיים.לאחר שטיפה אחת עם באפר שטיפה של קומפלקס חיסוני עם ריכוז מלח נמוך, הוסיפו מיליליטר אחד של הבאפר לכל מבחנה. סובבו בטמפרטורת החדר למשך חמש עד שמונה דקות ולאחר מכן סובבו בצנטריפוגה ב-800 RPM למשך דקה אחת לאחר השלכת הנוזל העליון. שטפו את חרוזי השטיפה פעם אחת עם באפר שטיפה של קומפלקס חיסוני עם ריכוז מלח גבוה, פעם אחת עם באפר שטיפה של קומפלקס חיסוני עם ליתיום כלוריד, ופעמיים עם באפר TE, לסך הכל חמישה שטיפות. לאחר מכן, בצעו אלוציה של DNA מכל דגימת immunoprecipitation וכן מדגימות ה-input.כדי לבטל את הקשירה הצולבת (cross link), הוסיפו 8 µL של NaCl בריכוז 5 M ל-200 µL מכל תמיסת אלוציה (elu) ומבקרת הקלט. אטמו את המבחנות באמצעות Parafilm והדגרימו במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה. למחרת, טיפלו בכל דגימה באמצעות 1 µL של RNase A למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C.לאחר שעה, הוסיפו ארבעה µL של EDTA בריכוז 0.5 M ושמונה µL של tris HCL בריכוז 1 M לכל דגימה וערבבו. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של proteinase K והד기로 ב-45 °C למשך שעתיים. טהרו את הדגימות באמצעות ערכת kaya quick PCR purification kit.ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לבדיקתן באמצעות PCR. ניתן לבדוק את ההעשרה על ידי שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) באמצעות PCR או real-time PCR. עבור דגימות PCR, בהרצה על ג'ל אגרוז, צריכות להופיע פסים בנתיבי ה-input ודגימת ה-chip בעזרת נוגדן לחלבון המדובר, שבמקרה זה הוא גורם השעתוק TCF7L2. לעומת זאת, בנתיב בקרה שלילית של IgG עבור אזור קישור חיובי, לא אמורה להופיע תוצאה או לכל היותר פס חלש מאוד.עבור אזור הכשירה השלילית. אמורה להופיע פסה חלשה מאוד או ללא פסה כלל עבור נתיבי הביקורת של ה-IgG והשבב. אמורה להופיע פסה בנתיב הקלט (input).איור זה מציג תוצאות מאותן דגימות שנבחנו באמצעות real-time PCR. בדומה לתוצאה הקודמת, צפויה הגברה משמעותית (fold enrichment) של אזור הקישור החיובי עבור דגימת ה-chip בהשוואה לבקרת ה-IgG.בנוסף, צריכה להיות העשרה מועטה מאוד, אם בכלל, באזור הקשירה השלילי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובהB של אופן קישור החלבון הקושר לכרומטין ברקמה או בקו תאים, ובכך להשקיע את החלבון המטרה שלכם, ולאחר מכן לבודד את ה-DNA לצורך ניתוחים נוספים.

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטת Hi-C מאפשר זיהוי משוחדת, גנום רחב של אינטראקציות הכרומטין (1). Hi-C זוגות קשירת סמיכות וסדר מקבילי מאסיבי. הנתונים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד אדריכלות גנומית בקני מידה מרובות: התוצאות הראשוניות זיהו תכונות כגון בשטחים כרומוזום, הפרדה של הכרומטין פתוח, סגור, מבנה הכרומטין בקנה מידה megabase.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת המשקעים החיסוניים של הכרומטין כדי לזהות אתרי קישור חלבונים באזורים ספציפיים של הדנ"א הגנומי של תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים באמצעות משקעים חיסוניים סלקטיביים של מקטעי כרומטין הקשורים לחלבון. שיטה זו מסייעת לחקור את האינטראקציה של מספר חלבונים רגולטוריים, כולל גורמי שעתוק המעורבים בבקרת גנים.

משקעים חיסוניים של כרומטין לזיהוי אתרי קישור חלבוני מטרה בדנ"א גנומי

שיטות למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo הופכות חיוניות לכל היבט של מחקר גנומי, אך הן מייגעות, יקרות וגוזלות זמן. כאן מוצגת מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים זמינה מסחרית המבצעת אוטומציה של משקעים חיסוניים של כרומטין למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo עם כמויות מוגבלות של תאים.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

אנו מציגים immunoprecipitation ששונה כרומטין יליד רצף (צ'יפ-seq) מתודולוגיה לדור של רצף datasets מתאים נוקלאוזום צפיפות שבב-seq מסגרת אנליטית שילוב נגישות נוקלאז micrococcal (MNase) עם מדידות שינוי היסטון.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

כאן, אנו מתארים, אופטימיזציה תפוקה גבוהה שבב-רצף פרוטוקול ו ניתוחים חישובית צינור מצפני הגנום כולו כרומטין דפוסי המדינה בין קפוא גידול רקמות שורות תאים.

פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

כאן אנו מציגים פרוטוקול אשר נועד לנתח את הגנום כולו הכריכה של הגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2) בתאי המוח בחריפות מטוהרים אוליגודנדרוציטים קודמן (OPCs) על-ידי ביצוע כרומטין נמוך-תא immunoprecipitation (ChIP) , ספריית הכנה, תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים bioinformatic.

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

מאמר זה מתאר פרוטוקול ChIP-Seq בעל קנה מידה זעיר של אזורי DNA הקשורים לשינוי histone ספציפי (H3K27ac) באמצעות פלטפורמת מטפל בנוזל ChIP, ואחריו הכנת ספריה באמצעות tagmentation. ההליך כולל הערכת בקרה למטרות איכות וכמות וניתן לאמץ אותו לשינויי histone אחרים או גורמי תמלול.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

למדו שיטת ChIP-seq איכותית לזיהוי אזורי קישור חלבונים ל-DNA בגנום. הפרוטוקול כולל קישור צולב, שסע DNA, ניצוץ immunoprecipitation ובידוד DNA לריצוף.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

גלה סרטונים נוספים