זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקצור ולכמת חיידקים הניתנים למעקב פלואורסצנטי ממארח מתווך לזיהום עוקב של תאי מארח יונקים. כאן משתמשים בלגיונלה מאלה המבטאת GFP כדי להדביק את המארח הטבעי פרוטוזואן אקאן אמבה, חד-שכבות קסטלני. לאחר מכן נקצרים האל מאלה על ידי ליזה סלקטיבית ולאחר מכן מחושב ריכוז החיידקים באמצעות נוסחה המבוססת על דילול פליטת פלואורסצנטי של פרוטוזואן.

לאחר מכן משתמשים בחיידקים דרוכים כדי להדביק חד-שכבות של תאי יונקים. לבסוף, מספר החיידקים הזיהומיים בתאי היונקים נקבע באמצעות שילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ציטומטריית זרימה וליזאטים לציפוי כדי לשחזר יחידות יוצרות מושבה. הנתונים שהתקבלו מדגימים יתרון פתוגני שהושג עבור החיידקים שגודלו בתאי פרוטוזואן בשלב ההתחלה בהשוואה לאותו זן שתורבת במדיום מלאכותי.

פיתחנו טכניקה זו על ידי התבוננות בכך שלא ניתן לגרום לביטוי של גורמי אלימות מסוימים בחיידקים באמצעות גידול חוץ גופי בלבד. מודלים זיהומיים אופייניים של חד-שכבות של תאים מתורבתים משתמשים בחיידקים מתורבתים במבחנה עבור לגיונלה ומספר חיידקים אחרים. פרוטאזומים מספקים מאגר טבעי להתפשטות שבו החיידקים משיגים יתרון פתוגני.

הטכניקה שנתאר מאפשרת כימות של חיידקי פרוטאזום ראשוניים על מנת למדוד במדויק את תרומתו של גורם אלימות המיוצר רק בהקשר של צמיחה תוך תאית. הדגמת ההליך תהיה בנדון. עוזר מחקר סם רנן, גם הוא עוזר מחקר ואמרי לאמה, עמית פוסט-דוקטורט, התחילו הליך זה על ידי שימוש באלקטרופורציה כדי להפוך את כל זני הפנאומופילה, המשמשים בבדיקה עם הפלסמיד PAM 2 39, המקודד GFP המושרה IPTG דוגרים על החיידקים במשך שלוש שעות על שייקר ב-37 מעלות, באמצעות פס מפזר חיידקים מכל טרנספורמציה על צלחת אחת ודוגרים במשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר שלושה ימים, העבירו מושבה אחת של זן החיידקים לשלושה מיליליטר של מדיום המכיל IPTG מילי-מולרי אחד, וטפחו בן לילה לשלב נייח על שייקר אורביטלי ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו 10 מיקרוליטר מהתרבית למגלשת זכוכית ומרחו פתק כיסוי. לאחר מכן צפה בשקופית תחת מיקרוסקופ כדי לאשר ביטוי GFP.

באמצעות מטרה של פי 60 תחת מסנני העירור והפליטה המתאימים, יש לראות מוטות חיידקים רבים שירוק פלואורסצנטי טהור כאשר מסתכלים באמצעות ערוץ ה-GFP של המיקרוסקופ, אם כל החיידקים פלואורסצנטיים, מתכוננים להדביק את האמובי על ידי דילול של 100 מיקרוליטר מכל תרבית במבחנה ל-1 עד 10 ב-H2O סטרילי. צור ריק באמצעות 100 מיקרוליטר מדיום YE המכיל מילי-מולרי IPTG 6.25 מיקרוגרם למיליליטר בכלורמפניקול ו-900 מיקרוליטר מים. לאחר מכן, בצע מדידות OD 600 של הדילול באמצעות ספקטרופוטומטר, באמצעות הנוסחה המופיעה במסמך הנלווה.

חשב את הנפח הדרוש כדי להדביק באר בריבוי זיהום או MOI של 20 עבור כל תרבית במבחנה. 24 שעות לפני תחילת תרביות הנוזל החיידקי מחליפות את המדיום בתרביות ABI של acan MEbA castellani. למחרת אוספים וסופרים את התאים באמצעות ציטומטר המו.

לשם כך, עקור את התאים על ידי הקשה על הבקבוק והעביר דגימה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, ערבבו אליקוט עם הצבע הכחול טריאן וטענו אותו על שקופית הציטומטר ההמו. לאחר ספירת התאים במיקרוסקופ אור, יש לדלל את האמובי במדיום טרי לריכוז סופי של אחד כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר באמצעות זרע פיפטר חוזר.

12 ובכן צלחות תרבית נשמה עם מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר מודגרת למשך הלילה. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הזיהום החזק במהלך שלב ההתחלה. כדי לעזור להשיג זאת, אנו משתמשים בצנרת ידנית בעת שטיפת האמבה כדי למנוע אובדן.

אמבה אינה דבוקה במיוחד וניתן לאבד או להסיר אותה בקלות במהלך שלבי כביסה או החלפת מדיה. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר ובעזר פיפטה ידני כדי לשטוף את הבארות של צלחות תרבית תאי 12 הבארות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי. לאחר שאיבת ה-PBS הוסף מיליליטר אחד של מדיום זיהום לכל אחד.

ובכן, אז דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, הדביקו כל אחת מהבארות ב-MOI של 20 על ידי הוספת התרחיף החיידקי למדיום הזיהום בכל באר צנטריפוגה את הצלחת ב-400 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב, יש לצוף את הצלחת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

העבירו את הצלחת לחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך 18 שעות. לאחר הדגירה נמצא מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאישור זיהום לאחר שלב התחלה מוצלח. 90% מהתאים המארחים צריכים להכיל VAEs גדולים המאוכלסים בחיידקים המבטאים GFP המופיעים כסהר ירוק כפי שמוצג בתמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות ממוזגות אלה.

בשלב זה, רוב תאי העין הקסטין השיגו עומסי חיידקים מקסימליים, אך הליזה של האוכלוסייה היא מינימלית. במיקרוסקופ אור, האמובי צריך להיראות מעוגל ומנותק. הנקודה, זן מוטנטי שאינו יכול לתמוך בטרנסלוקציה מתווכת ICM של אפקטורים, לא אמור לצמוח בעין יצוקה.

לכן, יש לזהות פלואורסצנטיות מינימלית. האמובי ייראה שטוח והחד-שכבתי צריכה להיות שלמה. לוקמיה מונוציטית חריפה אנושית או תאי THP one, המשמשים כתאי המטרה, היו צריכים להיות מוכנים על צלחת של 12 בארות כמתואר במסמך הנלווה.

שטפו את התא האחד של THP שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של RPMI 1640 טרי עם 10% FBS לכל תא דגירה TP אחד למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. להכנת הליזאט החיידקי, שאפו את המדיום מהראשוני לטובי.

לאחר מכן כדי להדביק אותם, הוסיפו 500 מיקרוליטר קרח, מים קרים, סטריליים, מסוננים במיוחד והניחו על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, משוך את הליזטים לפי המתח. הקלד צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר כדי לקבוע את הקרינה הכוללת.

מדוד פליטה ב-512 ננומטר עבור כל אחד מהליזטים המאוגדים. בעזרת צלחת 96 בארות בקורא לוחות פלואורסצנטיים, חשב מדידת OD 600 עבור הליזטים המאוגדים לפי הנוסחה. במסמך הנלווה, השתמש בליזאטים של אמובי לא נגוע הנתון לאותם תנאי ניסוי כמו האמבה הנגועה כדי לקבוע רקע ליזאט.

לאחר מכן עבור כל מאגר ליזאט, חשב את הנפח הדרוש כדי להדביק באר של תאי מטרה ב-MOI של 20. שמור את הליזטים על קרח כדי להגביל כל שינוי בביטוי הגנים של החיידקים. לפני ההדבקה, תוך 30 דקות מרגע הליזיס, יש להדביק שלוש בארות של תאי TP אחד לכל מצב ב-MOI המחושב.

שימוש בליזטים המאגרים מאפשר לקבוצת בארות להישאר לא נגועות, ומשמשות כבקרה שלילית. לניתוח זרימה ציטומטרית. צנטריפוגה את הצלחת ב -400 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר הסיבוב, יש לצוף את הצלחת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העבירו את הצלחת לאינקובטור פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% למשך שעה, שעה לאחר ההדבקה. שואבים את המדיום ושוטפים את הבארות שלוש פעמים.

עם PBS, הוסף מיליליטר אחד של RPMI 1640 טרי המכיל 10% FBS לבארות והחזיר את הצלחת לחממה. דגרו על תאי ה-TP 1 למשך 14 עד 16 שעות כדי לקבוע את רמות הזיהום הן בשלב ההתחלה והן בשלב תאי המטרה. צלם את הבארות הנגועות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 10 או פי 20.

לאחר מכן כדי לכמת זיהום תאי מטרה על ידי זרימה ציטומטרית עיני טריפסין, ה-THP הנגוע תא אחד ושוטף אותם בעדינות מהבארות על ידי ערבוב PBS. בעזרת פיפטה משוך את התאים בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב -1, 800 פעמים G למשך שתי דקות. לאחר הסיבוב השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של PBS סיבוב שוב ב -1, 800 פעמים G.אם לאחר החייאת הכדורים ב- PBS, המתלים המתקבלים עכורים מאוד.

יש לדלל אותם אחד עד שלושה ב-PBS נוסף כדי למנוע סתימת הקווים בציטומטר הזרימה באמצעות תאי מטרה לא נגועים, לשרטט את פיזור הצד הקדמי על ציטומטר זרימה לאחר שנקבע, לאסוף 20,000 אירועים בסך הכל עבור כל דגימת זיהום בתא מטרה באמצעות עירור לייזר של 488 ננומטר וערוץ FL אחד. לאחר העברת הנתונים למחשב נפרד לניתוח הליכה, אוכלוסיות תאים לאחר לכידה כדי לא לכלול תאים לא נגועים ולשרטט את עוצמת הקרינה בהיסטוגרמה כפי שמוצג כאן, לבחון את יעילות הזיהום על ידי ציפוי CFU של התאים שנקטפו לציטומטריית זרימה. הכן דילול סדרתי של הדגימות במים מסוננים במיוחד ב-10 למינוס אחד, 10 למינוס שתיים ו-10 לצלחת מינוס שלוש, 20 מיקרוליטר מכל דילול על שליש צלחת A-C-Y-E-A עם 6.25 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות לאחר הדגירה. ספרו את המושבות באמצעות קיסם ומונה תאים כדי להשיג אוכלוסייה של חיידקים מוכנים פרוטוזואים. זני פיס פראיים מסוג L המושרים לבטא GFP.

שימשו להדבקת חד-שכבות קסטלני במשך 18 שעות ב-MOI של 20. לאחר מכן נעשה שימוש בחיידקים המבטאים GFP כדי להדביק מחדש אמובי בזיהום בשלב תא המטרה כדי להשוות חיידקים מוכנים עם חיידקים מתורבתים במבחנה. הודגרו חד-שכבות קסטלה.

18 שעות ב-MOI של 10, כפי שניתן לראות במיקרוגרפים אלה, לחיידקים מוכנים של פרוטוזואים יש יתרון פתוגני משמעותי על פני חיידקים מתורבתים במבחנה באותו MOI כדי לכמת את הזיהום של מקרופאגים של תאי מטרה באמצעות פרוטוזומים וחיידקים מוכנים. PMA הבדיל בין THP מקרופאגים אחד נדבקו בפנאומופיליה מסוג L פראית שנקטפה מזיהום בשלב הפרוטאזום וההתחלה למשך 14 שעות. לאחר מכן בוצעה ציטומטריית זרימה כדי לכמת זיהום כפי שניתן לראות כאן.

השינוי הנכון בקרינה הוא מדד לסך התאים הנגועים באוכלוסייה. ניתן לתאם את הגדלת העוצמה של האות הפלואורסצנטי עם מספר החיידקים לכל פלואורסצנטיות של מקרופאגים לא נגועים, מקרופאגים אחד מוצגים באדום והפלואורסצנציה של תאים נגועים מוצגת בירוק. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשבועיים בסך הכל אם הכל מבוצע בצורה מדויקת.

זכרו, בזמן ביצוע הליך זה חשוב לא להפריע לפרוטאזום ולחד-שכבה. שימוש בפיפטה ידנית במהלך שלבי הכביסה שלך יעזור להגדיל את התפוקה לזיהומים הראשונים שלך. אל תשכח שעבודה עם לגיונלה יכולה להיות מסוכנת.

אז נקוט באמצעי זהירות כגון מניעת ייצור אירוסולים בזמן ביצוע הליך זה.