השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את ההשפעות של השתקה (knockdown) ארוכת טווח של ביטוי Intersectin 1 S על מבנה הריאות של עכברים ותפקודן. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת קומפלקסים ספציפיים של דופלקס INA וליפוזומים כדי להתמקד בכלי הדם של ריאות העכבר כשלב שני. קומפלקסי הליפוזום של INA מועברים באמצעות הזרקה רטרו-אורביטלית, ופעולה זו חוזרת על עצמה מדי 72 שעות למשך 24 ימים רצופים כדי להשיג עיכוב יעיל של ביטוי Intersectin 1 S.

בשלב הבא, דוגמאות מרקמת ריאה של העכברים המוזרקים נלקחות לצורך אנליזות ביוכימיות וסקרי EM, כדי להעריך את רמות ה-protein וה-mRNA של intersect in one ולבצע אנליזות מורפולוגיות נרחבות של הריאות. התוצאות שהתקבלו ב-western blot של ליזאטים מריאה עם נוגדנים ספציפיים ל-intersect in one ובאנליזות Q-R-T-P-C-R מראות knockdown ספציפי ויעיל של intersect in one למשך 24 ימים רצופים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מתודולוגיות קיימות, כגון rymers או לנטיוירוסים, הוא שמתן ליפוזומים אוניים לריאות הוא הדיר, בטוח, לא רעיל ויעיל מאוד באנדותל הריאה.

הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר החלטנו להעריך את ההשפעות של השהיית N in vivo, כאשר שיטות אחרות להחדרת SRNA לא הועילו. להכנת ליפוזומים אוניים, הוסיפו 315 µL של תמיסת מלאי של dimethyl diod desal ammonium bromide, או DOAB, לבקבוק תחתית עגולה, ולאחר מכן 200 µL של תמיסת מלאי של כולסטרול ו-9.5 mL של כלורופורם, וערבבו באמצעות סיבוב. חברו את הבקבוק למאדה סיבובי (roto vapor) המכוון ל-37 °C ול-100 סל"ד ומעלה.

פתחו לחלוטין את השסתום הראשון לארגון על ידי סיבובו עם כיוון השעון. פתחו וסגרו תמיד שסתום זה תחילה. השסתום השני שולט על לחץ הארגון הננשף אל תוך הבקבוק.

פתחו אותו חלקית כדי להבטיח לחץ עדין. ברגע שקרח יבש מתחיל לטפטף על הצינור המחבר בין מיכל הגז של Argonne לבין ה-roto vapor, הנמיכו את ה-roto vapor לתוך מקלח המים עד שהבקבוק נוגע במים מבלי להיות שקוע לחלוטין. העלו את חיוג המהירות ל-100 עד 120 RPM. כאשר כל הכלורופורם בבקבוק התאדה, הפסיקו את פעולת המכשיר.

סובב את חוגת המהירות של ה-roto vapor לאפס וסגור את שסתומי מיכל הארגון. הוצא את הבקבוק. הוסף שני מיליליטר של תמיסת glucose בריכוז 5% לבקבוק כדי לתלות מחדש את הליפידים.

בעזרת טיפ של פיפט של 1 mL, גרדו את תחתית הבקבוק ביסודיות כדי להמיס את כל הליפידים. דגרו את התמיסה שהתקבלה באמבט מים בטמפרטורה של 42 °C למשך שעה אחת, תוך כדי ערבוב איטי של הבקבוק במכשיר וורטקס. בצעו סוניקציה לתמיסה למשך 20 עד 30 דקות לפחות, כאשר הבקבוק מוחזק למעלה ותחתיתו נוגעת קלות במים הקרים בתוך מכשיר הסוניקציה.

בשלב הבא, חממו את הבקבוק באמבט המים של האידור הסיבובי למשך 20 דקות בטמפרטורה של 42 °C במהירות אפס, כאשר התחתית העגולה טבולה במים. סננו את הליפוזומים דרך מסנן מזרק של 0.47 micron, ולאחר מכן דרך מסנן מזרק של 0.22 micron. באמצעות אקסטרודר קטן, סננו את הליפוזומים דרך ממברנה של 50 nanometer כדי ליצור אוכלוסייה הומוגנית של וסיקולות ליפוזומליות חד-שכבתיות.

העבירו את הליפוזומים לפטפט (einor tube) והניחו על קרח. הכינו קומפלקסים של ליפוזומים ו-irna ITSN ביחס של שמונה מולים של ליפוזומים לשני מיקרוגרם RNA. בדוגמה זו, 50 microliters של I-A-I-T-S-N.

מתמיס מלאי בריכוז 50 micromolar מוסיפים ל-100 microliters של ליפוזומים שהוכנו טריים, תוך שימוש בשפופרת EOR נקייה מ-A-R-N-A-D-N-A. יש לשמור את התערובת על קרח עד להזרקה לעכברים. העכברים ששימשו במחקר זה הם בני כארבעה עד ששה שבועות ושוקלים כ-25 grams.

יש לוודא באמצעות לחיצה על בהונות הרגליים שהבעל חיים תחת הרדמה מלאה לפני ההזרקה. המזרקים המשמשים הם מזרקי טוברקולין של מיליליטר אחד עם מחט מחוברת ביד אחת. החזיקו את אוזני העכבר והפכו אותו על צדו כדי לחשוף את הזווית הפנימית של העין.

כוון למסלול המדיאלי ביחס לחלקי הירח של ה-PIKA והימנע מנגיעה בגלגל העין. התקרב לקרנית הדמעית של העין עם המזרק הטעון בזווית של 45 מעלות בכל שלושת הצירים. הזרק את התערובת באיטיות, החזר את העכבר לכלובו ואפשר לו להתאושש עם הצד המוזרק.

מעלה. העכבר מטופל ב-siRNA המכוון לגן ITSN1 כל 72 שעות למשך 24 ימים. כדי להתחיל בהליך זה, ודאו שהעכבר מורדם באופן מלא על ידי בדיקת היעדר רפלקס נסיגה. התחילו בלפרוטומיה והוציאו את הסרעפת.

לאחר מכן בצע תורקוטומיה (פתיחת בית החזה) לחשיפת הריאות והלב. הסר את התימוס באמצעות מיקרוסקופ StereoZoom לדיוק רב יותר. בצע קטטרז של העורק הריאתי.

בשלב הבא, בצעו טרכיאוסטומיה והחדירו טיוב לעכבר דרך הפתח בטרכאה. כווננו את מכשיר ההנשמה לקצב של 150 פעימות לדקה ונפח פעימה של 150 µL. כפתח יציאה, פתחו את ה-trium השמאלי באמצעות משאבה פריסטלטית המכוונת ל-1.5 mL לדקה ושתספק תמיסת Hank's המחוממת ל-37 °C.

יש לבצע פרפוזיה למערכת כלי הדם של ריאות העכבר ללא דם למשך חמש דקות, ולאחר מכן לבצע פרפוזיה עם החומר המסימן (tracer) למשך 10 דקות. לאחר שטיפת החומר המסימן שאינו קשור, בצע קיבוע in situ של הריאות באמצעות פרפוזיה של 10 דקות של 4%formaldehyde, 2.5%gluar aldehyde ו-1%tannic acid. אסוף את הריאות והסר רקמות עודפות.

חתכו את הריאות לבלוקים קטנים והעבירו אותם למבחורת סינCילציה מסומנת המכילה שני מיליליטרים של תערובת קיבוע. כדי להתחיל בעיבוד רקמת הריאה עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית, שטפו תחילה את בלוקי הריאות בבופר סודיום ציטראט 0.1 molar בקצר שלוש פעמים.

בשלב הבא, קבעו את הדגימות ב-4%aldehyde 2.5%glutaraldehyde ב-0.1 Pipee buffer למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; בצעו קיבוע משני עם 1%Pilate Osmium למשך שעה אחת במנדף על קרח בחושך, לאחר שטיפה אחת ב-Callen burger buffer. הדגימו את הדגימות ב-Callen burger buffer למשך שעתיים ועד ללילה בטמפרטורת החדר. שטפו פעם אחת ב-50%ethanol ולאחר מכן בצעו דהידרציה באמצעות סדרה מדורגת של ethanol.

70% ethanol למשך חמש דקות, 95% ethanol למשך חמש דקות ולאחר מכן פעמיים ב-100% Ethanol למשך 15 דקות בכל פעם. לאחר מכן, העברה ל-100% propylene oxide לשתי דגירה של 15 דקות כל אחת.

הסר את ה-propylene oxide והוסף תערובת של 50% propylene oxide ו-50% epon. הדגר למשך לילה בסיבוב על גלגל בטמפרטורת החדר; למחרת בבוקר, הסר את התערובת והוסף epon טרי. הדגר למשך ארבע עד חמש שעות לפחות על הגלגל.

העבירו דגימות נבחרות לתבניות עם היצרויות כפולות הממולאות עד מחציתן ב-100%Epon eight טרי. מקמו אותן בשולי התבנית, העבירו את התבניות לאינקובטור בטמפרטורה של 60 degree Celsius והניחו להן להתקשח במשך 48 עד 72 שעות. עיכוב כרוני של ביטוי ITSN one s למשך 21 ימים רצופים, באמצעות מתן חוזר של קומפלקסים של ליפוזומי siRNA של I TSN one s, מוביל לרמות נמוכות משמעותית של חלבון I TSN one בריאות עכברים כפי שמוצג בתוצאות מייצגות אלו; כאן, ליזאטים של ריאות מעכברי ביקורת שלא טופלו ומעכברים שטופלו עברו בלוט עם נוגדנים נגד I TSN one ואקטין בנקודות זמן שונות לאחר מתן ה-irna, כפי שצוין.

ניתוח דמטרי של דגימות מייצגות של סרטי Western blot ו-R-T-P-C-R כמותי של mRNA של I TSN one s מאששים עוד כי טיפול בקומפלקסים של ליפוזומים עם I TSN one s siRNA מדכא ביעילות את ביטוי החלבון I TSN one s בריאות עכברים. הירידה ברמות של intersect in one מובילה לאנדוציטוזיס לקוי ולשיבוש בתעבורה האנדותליילית של המחסום הבין-אנדותליילי ובבצקת ריאות. מיקרוגרפים אלקטרוניים מייצגים אלו של רקמת ריאה מראים צמתי בין-אנדותלייליים פתוחים או IJs המסומנים לאורך כל אורכם על ידי חלקיקי זהב-אלבומין של 8 nanometer.

פאנל A1 הוא הגדלה של פאנל A, ראשי החצים מצביעים על שלושה עד ארבעה חלקיקי אלבומין מוזהבים הממוקמים קרוב זה לזה באותו מישור. הדבר מעיד על הפתיחה הרחבה של ה-IEJ. חלקיקי הזהב קשורים גם ליציאה האבלומינלית של ה-IJs, כפי שמוצג על ידי החצים בפאנלים A1 ו-B. שימו לב גם למספר המוגבל של CVE A ולהרחבה של המרווח הפרי-קפילרי המסומן בכוכבית בפאנל a; דה-רגולציה חריפה של ביטוי intersectin 1, שהובילה לעלייה במסלולי הובלה חלופיים כדי לפצות על אנדוציטוזה לקויה.

תמונות EM אלו מראות טבעות ממברנתיות בלוחות A ו-A, צינורות פליאומורפיים בלוח B, ואנדוזומים מוגדלים המהוזים עם cve LA טיפוסי בלוח C, המעורבים באופן פעיל בספיגה ובהובלה של אלבומין זהב. נצפתה גם התרחבות חמורה של המרווח הפרי-vaskulari ובצקת חלבונית. עיכוב ממושך של intersect בביטוי אחד למשך 24 ימים מפחית את הבצקת הריאתית בעכברים על ידי שיקום חלקי של שלמות מחסום האנדותל.

בדיקות מורפולוגיות ב-EM הראו כי סמן אלבומין-זהב בגודל שמונה ננומטר לא הצליח לחדור את ה-IEJ בנקודת זמן זו, ובמקום זאת יצר שאריות סינון בפתח הלומן של הצומת המסומן על ידי ראש החץ. עם זאת, החללים הפרי-וסקולריים או ה-PVS הראו התרחבות מסוימת ובצקת קלה, מה שמרמז כי הצמתים אינם חדירים לחלקיקים בגודל זה, אך גופי רב-שלפוחית (multivesicular bodies או MVB) דליפים הנמצאים בסמיכות לממברנה הפלזמה הראו סימון של חלק מהשלפוחית הפנימיות הקטנות שלהם על ידי חלקיקי אלבומין-זהב בגודל שמונה ננומטר. טבלה זו מציגה את מספר מבני ה-trans cyto האנדוציטוטים באנדותל של ריאות עכברים בביקורת ובמצב של חסר.

ממצא משמעותי הוא הירידה במספר ה-caveolae באנדותל של ריאות עכברים חסרים ב-ITSN1. עיכוב כרוני בביטוי של ITSN1 גרם להפעלה של מסלולי אנדוציטוזה חלופיים ולהפחתה חלקית במספר ה-caveolae, שהם טבעות או צינורות ממברנתיים המסומנים על ידי חלקיקי אלבומין מצופים בזהב. באנדותל של ריאות עכברים עם חסר כרוני ב-ITSN1 נרשמה גם עלייה של 14 מפעמים בהשוואה לקבוצות הביקורת.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Eliza המיושמת על ליזאטים של ריאות עכבר, על מנת להעריך באופן כמותי את התובלה הטרנס-אנדותלייאלית של סממנים שונים של hnic. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להוביל באופן ספציפי קומפלקסים של ליפוזומי onic ו-SRNA לאנדותל ריאות העכבר, במטרה לבצע knockdown לחלבון הנחקר ולהעריך את תפקודו.