הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין את האינטראקציה האופיינית בין טסיות דם ונויטרופילים על האנדותל המופעל במהלך מחלת כלי דם. זה מושג על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך-חיוני בזמן אמת בעכברים חיים כדי לדמיין את המיקרו-כלי דם בתוך שריר הקרמאסטר. כצעד שני, מוזרקים נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית ומופעלת דלקת או פציעה כדי להקל על הדמיה ישירה של אינטראקציות הנויטרופילים האופייניות לטסיות הדם המתקבלות.

לאחר מכן, הנתונים השמורים מנותחים על מנת לכמת את מספר התאים ואת הדינמיקה שלהם. בסופו של דבר, ניתן להעריך אינטראקציות טיפוסיות ישירות בין טסיות דם ונויטרופילים על האנדותל המופעל על סמך האות הפלואורסצנטי של הנוגדנים המוחדרים במיקרוסקופיה תוך-חיונית בזמן אמת. הטכניקה המיקרוסקופית התוך-חיונית שלנו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות בזמן אמת בין טסיות דם ונויטרופילים באנדותל מופעל במהלך דלקת בכלי הדם והיווצרות פקקת.

ניתן ליישם טכנולוגיה זו גם במערכות אחרות כגון הערכת האינטראקציות בין תאים סרטניים ותאי דם. לפני תחילת הניסוי, הפעל את מערכת המיקרוסקופ למודל דלקת כלי הדם. הזרקה תוך גדלה משקפת TNF אלפא שלוש שעות לפני הזרקת IP של חומרי הרדמה.

לאחר אישור ההרגעה על ידי צביטת הבוהן, צבט צינור PE 90 לקנה הנשימה של העכבר כדי למנוע קשיי נשימה. לאחר מכן, יש לזרוק צינור PE 10 לווריד הצוואר השמאלי לעירוי נוגדנים המסומנים פלואורסצנטי וחומרי הרדמה נוספים. לאחר מכן משוך בעדינות החוצה וחתוך אופקית את עור שק האשכים והשתמש במאגר החם מראש מעל שדה הניתוח.

כעת לוחצים על הבטן התחתונה עם מלקחיים אחד, שולפים בזהירות אשך עם המלקחיים השני בגודל, שריר המכונית שולט אנכית ומשטחים את השריר מעל החלקת כיסוי זכוכית על מגש מיקרוסקופ תוך-בקבוקוני על ידי הצמדת הרקמה ההיקפית למגש. התחל שלב זה על ידי החדרת DITE 4 88 חולדה מצומדת, אנטי עכבר CD 42 C ו-Alexa floor 6 47 נוגדנים מצומדים נגד עכבר GR אחד דרך צינורית הצוואר שהוגדרה קודם לכן. לאחר מכן, בערכת המסננים של המיקרוסקופ, סמן את תיבת הסימון עבור הערוצים שייחשפו והגדר את זמן החשיפה עבור כל לכידת זמן-lapse בחירה.

כדי להגדיר את מספר נקודות הזמן ל- 1000 עד 1500 עם מרווח של 200 אלפיות השנייה למשך הזמן הכולל שחלף חמש דקות. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו בלכידת התמונה, בחר התחל כדי להתחיל את לכידת הלכידה בהגדלה של פי 60 עם חלון של 157 מיקרומטר על 118 מיקרומטר. עקוב אחר הטסיות השולטות והדבקות לנויטרופילים במשך חמש דקות בחצי העליון של מקום מודלק.

כדי לנתח את היווצרות פקקת הטסיות, עבור אל מסכה ובחר צור. לאחר מכן, תחת כלי סימון הבחירה בתצוגה הראשית, לחץ על סמל העיפרון הגדול. השתמש בעיפרון כדי לצבוע אזור מחוץ לכלי השיט בתצוגה הראשית.

לקביעת מסיכת רקע, עברו אל 'מסיכה', לחצו על 'העתק מישור זה', לחצו על 'העתק מסיכה'. בנקודת הזמן הנוכחית, בחר את כל נקודות הזמן ולחץ על אישור. כדי לחשב את אות הרקע, עבור לסטטיסטיקה ולחץ על סטטיסטיקת מסכה.

לאחר מכן, בהיקף התמונה, לחצו על קיטועי זמן דו-ממדיים נוכחיים, או על ארבע תמונות דו-ממדיות בהיקף מסיכה, ובחרו מסיכה שלמה בתכונות. תחת תאריך הצילום, בחר זמן שחלף. תחת גיאומטריית שינוי צורה, בחר אזור בפיקסלים ותחת עוצמה בחר עוצמה מרבית.

כעת לחץ על ייצוא. פתח את קובץ הטקסט בתוכנית גיליון אלקטרוני וחשב את הערך הממוצע של אות הרקע לאורך כל תקופת ההקלטה. כדי לקבוע את עוצמת הקרינה ברקע.

לאחר חישוב עוצמת הקרינה ברקע במהלך פקקת הטסיות כפי שהודגם זה עתה במודל הדלקת האולרי, עבור למסכה, לחץ על קטע, בחר התאם e וערוץ, והכנס את הערך הממוצע של אות הרקע בלחיצה נמוכה החל ובסדר. לאחר מכן עבור לסטטיסטיקה ולחץ על סטטיסטיקה של מסכה. כעת בהיקף התמונה, לחץ על קיטועי זמן דו-ממדיים נוכחיים או על ארבע תמונות מימד בהיקף מסיכה, בחר מסיכה שלמה בתכונות תחת תאריך הצילום בחר את הזמן שחלף תחת גיאומטריית שינוי צורה, בחר אזור בפיקסלים ותחת עוצמה, בחר עוצמה מסוימת.

לאחר מכן לחץ על ייצוא. פתח את קובץ הטקסט בתוכנית הגיליון האלקטרוני וחשב את עוצמת הקרינה של פקקת טסיות הדם. לניתוח פקקת עורקים התחל על ידי החדרת DITE 4 88 מצומד נגד עכבר CD 42 C ANDOR 6 47 נוגדנים מצומדים נגד עכבר GR אחד כפי שהודגם זה עתה.

לאחר לחיצה על התחל כדי להתחיל את תהליך לכידת התמונה, לחץ פעמיים על נקודה שניים עד שלושה מיקרומטר פנימית מדופן הכלי כדי לירות את הלייזר. הפגיעה בתאי האנדותל העורקי גורמת לשינוי צורה חזותי שאמור להיות ניכר בתמונת השדה הבהיר ואחריו הצטברות טסיות דם. חמש דקות לאחר פגיעת הלייזר, השהה ובטל את הצילום.

לאחר מכן התחל לכידה עם 2,400 נקודות זמן במרווח של 500 אלפיות השנייה כדי לתעד את טסיות הדם הדבקות והנויטרופילים המתגלגלים והנצמדים למשך 20 דקות. לאחר חישוב עוצמת הקרינה ברקע במהלך פקקת הטסיות באופן דומה למודל הדלקת האולרי, עבור למסכה, לחץ על קטע, בחר fite וערוץ והכנס את הערך הממוצע של אות הרקע בלחיצה נמוכה החל ובסדר. כעת בהיקף התמונה, לחץ על תמונות דו-ממדיות נוכחיות או תמונות 40 D בהיקף המסיכה, בחר את כל המסיכה בתכונות תחת תאריך הצילום בחר את הזמן שחלף תחת מורפו בחר אזור בפיקסלים ותחת עוצמה, בחר עוצמה מסוימת.

לאחר מכן לחץ על ייצוא. פתח את קובץ הטקסט בתוכנית הגיליון האלקטרוני וחשב את עוצמת הקרינה של פקקת טסיות הדם. כדי לכמת את הנויטרופילים המתגלגלים והנצמדים, הפעל את הזמן lapse וספור את מספר התאים שמתהפכים באופן גלוי.

פקקת הטסיות במשך 20 דקות גלגול מוגדרת כירידה במהירות הנויטרופילים תוך אינטראקציה עם פקקת הטסיות למשך שתי שניות לפחות. נויטרופילים דבקים מוגדרים ככל נויטרופילים שנשארים מחוברים לפקקת הטסיות למשך שתי דקות לפחות. כאן, תמונות מייצגות של הופעת אותות פלואורסצנטיים הקשורים לנויטרופילים באדום וטסיות דם בירוק.

במהלך הדלקת האולרית מוצגת, החץ מראה את כיוון זרימת הדם בכלי. מספר הנויטרופילים המתגלגלים והדבקים בתאי אנדותל מודלקים נקבע כ-0.25 תאים לדקה ו-18.5 תאים לחמש דקות בהתאמה. הנתונים מייצגים את הממוצע פלוס מינוס שגיאת התקן של הממוצע של 30 Es שונים בארבעה עכברים מסוג בר.

כאן משורטט האות הפלואורסצנטי המשולב החציוני של טסיות הדם כפונקציה של זמן. נמצא כי רוב הטסיות באדום נצמדות לנויטרופילים הדבקים והזוחלים בירוק ולא לדופן הכלי המודלק. כעת עוברים לאינטראקציות טסיות נויטרופילים בעקבות פגיעה עורקית הנגרמת בלייזר.

תמונות אלה ממחישות נויטרופיל בודד באדום ומסומנות עם החץ הצהוב המתגלגל על פקקת הטסיות בירוק עם נויטרופיל שני באדום ומסומן על ידי החץ הלבן המתגלגל במהירות על תאי האנדותל העורקי, שניהם על פני מרווח לכידה של חמש שניות כאן, נויטרופיל בודד שוב באדום מוצג מתגלגל ונצמד לפקקת טסיות דם בירוק במרווח של 15 שניות. ראש החץ מזהה את הנויטרופילים המתגלגלים והדבקים והחץ האפור העבה מציין את כיוון זרימת הדם. כאן, האות הפלואורסצנטי המשולב החציוני של טסיות הדם משורטט כפונקציה של זמן.

מספר הנויטרופילים המתגלגלים והנצמדים נקבע כ-21.5 ו-1.6 תאים במשך 20 דקות בהתאמה. גלגול מהיר ראשוני של הנויטרופילים התרחש על תאי האנדותל. ברגע שהנויטרופילים יצרו קשר עם פקקת הטסיות, מהירות הגלגול של הנויטרופילים על פקקת הטסיות השתנתה בטווח של 8.2 מיקרומטר לשנייה ומתווכת על ידי האינטראקציה של פקטין ו-psgl L one.

הנתונים מייצגים את הממוצע פלוס או מינוס, שגיאת התקן של הממוצע של 14 פקקים שונים בשבעה עכברים מסוג בר חמש דקות לאחר פגיעת הלייזר. גודל פקקת הטסיות נשאר קבוע יחסית במהלך ההדמיה, והנויטרופילים מתגלגלים על הפקקת ונצמדים אליה. האות הפלואורסצנטי מהטסיות המסתובבות הוא זניח.

בהשוואה לזה מפקקת טסיות הדם, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר את מערכת המיקרוסקופ התוך-חיוני עם עכברים חיים, מה שמאפשר לך לדמיין בזמן אמת את האינטראקציות ההטרוסקופיות בין טסיות דם לנויטרופילים על אנדותל מופעל בתוך המיקרו-כלי דם.