שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות לחוקרים אחרים כיצד לקבוע את תפקוד הכליות בעכברים ערים. זה מושג על ידי דיאליזה ראשונה, פלואורסצאין איזותיוציאנט או אינולין FSE למשך 24 שעות וקביעת ריכוזו להזרקה. השלב השני הוא שקילת העכבר, הכנת כמויות מדויקות של אינולין פיצי להזרקת רטרובולבר והרדמת העכבר.

לאחר מכן, מבוצעת הזרקת אינולין Retrobulbar Fitzy ונלקחות שמונה דגימות דם במשך תקופה של 75 דקות. השלב האחרון הוא למדוד את פיץ נולין באמצעות ספקטרומטר פלואורו בנפח מיקרו ולחשב את תפקוד הכליות על ידי שימוש במודל דעיכה אקספוננציאלי דו-פאזי. בסופו של דבר, שילוב הרגישות של שיטת הזרקת הבולוס היחיד של פיטי נולין עם יכולת נפח המיקרו של ספקטרומטר הפלואורו מאפשר לזהות הבדלים בתפקוד הכליות הנגרמים על ידי שינויים גנטיים בעכברים, שינויים תזונתיים או יישומי תרופות.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו עירוי רציף ותנאי הרדמה, השתלת משאבות מיני אוסמוטיות משתמשות באינולין רדיואקטיבי הם שאין צורך בניתוח. זה לא ניסוי סופני. אין צורך לאסוף שתן, וניתן למדוד עד 24 מ' ליום.

אני אדגים את ההליך הזה יחד עם מריה אזימו, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי להכנת תמיסת ההזרקה של Fitzy Nulin. שקלו מספיק אינולין ZI לשני מיליליטר של תמיסה של 5%, ממיסים את האינולין המסומן בתמיסת נתרן כלורי של 0.85% על ידי חימום ל-90 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. מניחים חתיכה של קרום דיאליזה בגודל 20 ס"מ במים מזוקקים כפולים למשך 30 דקות כדי להסיר שאריות חומצת נתרן מהממברנה, לשטוף את הממברנה כמה פעמים לאחר מכן, למלא את קרום הדיאליזה בחותם אינולין פיצי מומס כראוי עם סגירות, ולאחר מכן לשקול את כל הממברנה.

אפשר לאינולין הפיצי המומס לדיאליזה בליטר אחד של תמיסת נתרן כלורי 0.85% ולערבב לאט מוגן מאור במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר לאחר הדיאליזה, לשקול שוב את כל קרום הדיאליזה ולחשב את הריכוז החדש. מים יעברו באופן אוסמוטי לתוך הממברנה ו-FSI לא קשור יזוז החוצה מהממברנה. לפיכך, ריכוז האינולין FSI יקטן באופן משמעותי.

חשב את ריכוז האינולין החדש fit e באמצעות נוסחה זו כאשר C הוא הריכוז החדש. N הוא כמות האינולין ההתחלתית E המותאמת, ו-V הוא הנפח החדש, שהוא ההבדל במשקל צינורות הדיאליזה לפני ואחרי הדיאליזה, בתוספת נפח תמיסת האינולין הראשונית של פיצי אינולין. לאחר מכן, יש לעקר את תמיסת הדיאליזה על ידי סינון דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרון.

זכור תמיד לשמור על אינולין פיצי מוגן מפני אור כדי למנוע פוטוהלבנה לפני הניסוי. קח את משקל הגוף של העכברים לאחר הרדמת העכברים לזמן קצר עם 4 עד 5% ISO פלואור. בדוק את עומק ההרדמה על ידי רפלקס טואין שאב שני מיקרוליטר לגרם משקל גוף של נולין פיצי דיאליזה באמצעות מזרק המילטון בנפח 100 מיקרוליטר עם מחט באורך חצי סנטימטר 26 להסרת בועות אוויר, ולאחר מכן עבור למחט באורך חצי סנטימטר ו-30 מד להזרקה.

המשך להזריק את אינולין פיצי בדיאליזה למקלעת הרטרואורביטלית. אפשרו לעכברים להתאושש באופן ספונטני בכלוב הביתי שלהם. מילימטר אחד של זנב עכבר במספריים פעם אחת ואסוף דם במספר נקודות זמן לאחר הזרקה בנימי מיני נתרן הפרין.

אטמו נימים קטנים לאחר איסוף הדם עם חותם צ'ה ושמרו על הדגימות מוגנות מפני אור. הכניסו את הנימים הקטנים האטומים לתוך נימים המטוקריטים וצנטריפוגה למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה. שברו מיני נימים באמצעות חותך יהלום והעבירו פלזמה שלמה על ידי פיפטינג לתוך צינור של 0.2 מיליליטר.

בצע דילול של 1 עד 10 על ידי שימוש בשני מיקרוליטר פלזמה ו -18 מיקרוליטר של 0.5 שומות לליטר ערימות בצינור חדש של 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, מדוד שני מיקרוליטר מהדגימה המדוללת עם NanoDrop 3, 300 בכפילויות לתפוקה גבוהה של שישה עכברים. אנא עקוב אחר פרוטוקול תרשים הזרימה המופיע בפרוטוקול הטקסט כדי למדוד GFR של כליה שלמה בשיטת הזרקת בולוס בודדת, יש לאסוף שמונה דגימות דם ב-3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 ו-75 דקות לאחר הזרקת נולין FSE.

בתרשים זרימה זה, המספרים מציינים נקודות זמן איסוף ואילו המספרים בסוגריים מציינים נקודות זמן של מספר דגימה משמאל לקו האדום האנכי מציינות נקודות זמן הזרקה. כל עכבר מסומן בצבע אחר. כדי לקבל איסוף דם רציף עקוב אחר החצים.

קופסאות אפורות מציינות מתי יש להכין את העכבר הבא להרדמת איזוף פלואור לפני ההזרקה באמצעות פרוטוקול זה. הזמן המינימלי בין שני אוספי דם מעכברים שונים הוא תמיסת הזרקת פיצי נולין מדוללת בדקה אחת עם פלזמת עכבר מדוללת כדי לקבל את הדילולים הסטנדרטיים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. ריכוז התקנים יהיה תלוי בדיאליזה ותמיד יהיה שונה עבור כל תכשיר של נולין FSI.

לכן, יש צורך להזין את הריכוז לעקומה הסטנדרטית בכל פעם. נתח נתונים כדי לחשב את קצב הסינון הגלומרולרי או GFR עם תוכנה מתאימה על ידי שימוש בפונקציית דעיכה מעריכית דו-פאזית כמתואר בפירוט בפרוטוקול הטקסט למדידת GFR בעכברים מודעים. קינטיקה בפלזמה של אינולין ZI לאחר הזרקה תוך ורידית במינון יחיד משמשת לחישוב מודל GFRA שני תאים משמש במודל שני התאים.

שלב הדעיכה המהיר הראשוני מייצג חלוקה מחדש של אינולין פיצי מהתא התוך-וסקולרי לנוזל החוץ-תאי. השלב המאוחר יותר עם דעיכה איטית יותר בריכוז האינולין הפיצי משקף בעיקר פינוי מערכתי מהפלזמה. סוכרת מסוג 1 נגרמה על ידי מריחה תוך-צפקית של סטרפטוזוטוצין.

GFR נקבע לפני וחמישה שבועות לאחר השראת סוכרת מסוג 1 בעלי חיים סוכרתיים מראים בבירור סינון יתר גלומרולרי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד GFR בעכברים גדולים על ידי שימוש בטכניקת הזרקת בולוס בודדת ושימוש במודל DK אקספוננציאלי דו-פאזי.