Name: בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו לבודד נוזל שדרתי עוברי ממכרסמים ולטפח explants מוח קליפתי על ממברנות פוליקרבונט. שיטה זו חושפת אותות הדרכה קריטיים לפיתוח הקורטקס ומאפשרת מחקר מתקדם במחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לתמיכה מ-NIH (מספרי הפרס R00 NS072192 לMKL, HD029178 לAS.L., ו 2 RO1 NS032457 לCAW). MKL הוא הנמען של מלגה בבית החולים לילדים בבוסטון פיתוח קריירת המלגה / הספר לרפואת הארוורד שור ועמית פ אלפרד סלואן הקרן. CAW הוא חוקר של הווארד יוז הרפואי במכון.

1. בידוד עובר / הכנה טכניקה זו יכולה לשמש לעכבר או חולדה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים את טכניקת אוסף CSF ונתיחת explant קורטיקלי מוחית במוח העוברי בעכבר. אנחנו נגיב על כל הבדלים חשובים לחולדות לעומת עכברים שקיימים בטכניקות הכלליות. למערכת staging הגיל העוברית, E1 מסווג כיום של התקע לחולדות, וE0.5 מסווג כיום של התקע לעכברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מייקר נתיחה עם סיליקון אלסטומר Sylgard. אלסטומר סיליקון Sylgard 184 מסופק כרכיב 2 חלק נוזלי, חלק החלק ב &#39;חלק א&#39; והחלק ב &#39;והם מעורבים ב10:01 יחס לפי משקל או נפח. לאחר המרכיבים נוזלים מעורבים, יוצק אלסטומר sylgard לצלחת פטרי כדי לכסות את כל פני השטח של המנה. כמה בועות אוויר יכולות להיות נוכחת שיתפוגגו במהלך תהליך הריפוי. הנח את המכסה בצלחת הפטר ולאפשר elastomאה לרפא. אלסטומר ניתן לרפא בטמפרטורת חדר למשך 24 שעות, או בטמפרטורות גבוהות יותר (למשל 37 מעלות צלזיוס) לריפוי מהיר יותר. ברגע שהרכיבים הנוזליים לחזק, מנת הנתיחה תהיה מוכנה לשימוש. המנה יכולה לשמש שוב ושוב לניסויים מרובים, בתנאי שהוא ניקה היטב לאחר ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פיפטה מייקר הנימים (מחט). pipettes מייקר נימים שהוכנו על ידי הפעלת חום ולמשוך באמצעות חולץ Narishige PC-10 אנכי micropipette עם ההגדרות הבאות: משיכת צעד אחד; 100 גרם במשקל משיכה; # 2 מוגדרים 58 מחמם. טיפ הקנס של micropipette הוא כיבה בזהירות באמצעות # 55 מלקחיים עדינים. הקוטר הפנימי הממוצע התוצאה של המחט הוא 85 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הרכבת aspirator לשאיפת CSF. הכנס מייקר בוכנה מסופקת עם pipettes מייקר נימים לתוך מחט הנימים. לחלופין, לצרף מסנן פלסטיק חד פעמי לסוף הרכבת צינור aspirator שקשורה to פיפטה מייקר הנימים. לדחוף את המחט דרך האטם למקומו בקצה השני של הרכבת aspirator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרת עוברים מבודדים מהמלטה לצלחת נתיחת מייקרו מוכן עם Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרומי חוץ עובריים ורקמות, כך שהעובר חשוף באופן ברור. כל רקמת שכבת 1 דופן רחם ולאחר מכן decidua-ניתן גזור באמצעות מספרי iridectomy עדינים (כלי מדע פיין כלומר # 15000-02). בכל אתר השתלה, תחילה על דופן הרחם, אז decidua ניתן חרותה מקבילה לציר הארוך של הרחם, ואז החתך ניתן לפתוח נוסף באמצעות מלקחיים עדינים. Decidua ניתן להסיר לאחר חתך דומה, חושף את הקרומים העובריים. הטיפול צריך להיות למימוש כך שקרום העובר אינו חרות או נקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם תמיסה סטרילית הנקס מאוזנת מלח (HBSS) ולהסיר עודפי נוזלים מהעובר מקיף באמצעות פיפטה כמו גם kimwipe או מסנןנייר חתוך למשולשים. </li></ol> 2. אוסף CSF חדרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו עובר מתחת למיקרוסקופ הנתיחה: לעכבר, העובר צריך להיות מונח בצד שלה, כך שכל אחת יש השקפת sagittal של העובר המתפתח. עם עוברי חולדות E16 ומעלה, תציב את העובר בעמוד השדרה הגבה שלה, לאורך הממד מישוריים הארוך ביותר שלה, מגולגולת לכיוון זנב, כאילו עובר שוכב על גבה. באופן זה ניתן לאסוף CSF מחדר לב לרוחב מימין ומשמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתמדה להכניס את פיפטה מייקר הנימים לתוך חדר הלב לרוחב, חדר לב mesencephalic, או Cisterna magna, מנסה לא ליצור קשר עם תאי neuroepithelial פעם פיפטה הוכנסה. לעוברי עכברים E14.5 או מבוגר יותר, CSF עלול להישאף מהחדר הימני ולאחר מכן הוציאה את המחט ונוספת לחדר השמאלי. בגלל patency של חדרים והצינור העצבי בעוברים הצעירים מן E14.5,נפח CSF כל לעתים קרובות עלול להישאף מחדרי הלב הרוחביים עם החדרת מחט אחת. עם זאת, זה לא תמיד המקרה כפעמים וpatency ההתפתחותיים של חדרי לב החיבור עשויות להשתנות מעט, ולכן, פיפטה מייקר הנימים יכולה גם להיות מוכנסת לתוך Cisterna magna לאסוף נפח CSF המקסימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פיפטה מייקר הנימים מוכנסת לתוך חדר הלב לרוחב, חדר לב mesencephalic, או Cisterna Magna, בזהירות ובעדינות להתחיל aspirating CSF לתוך פיפטה, תוך השימוש ב-בוכנת מייקרו כדי ליצור לחץ שלילי ולשאוב CSF, או על ידי מתן לחץ שלילי עדין שנוצר על ידי פה כזה שמתחיל בעדינות CSF לזרום לתוך פיפטה מייקר הנימים בצורה איטית ומבוקרת. אנו ממליצים שהצופה בודקת עם הפקידים המקומיים שלהם לגבי מדיניות מוסדית בגישות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להפעיל לחץ שלילי ולאסוף CSF לתוך פיפטה מייקר הנימים.בשני עוברי עכברים ועכברושים של E16.5/E17 או צעיר יותר, ניתן לצפות לקריסת חדר לב במקצת על ידי הופעתו של divot להרכיב על הצד של הראש שפיפטה מייקר הנימים היא פנימה בעוברים מבוגרים, בשל הגודל גדול יותר של המוח, זה לא יכול להיות אפשרי כדי להביט בראש מתמוטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק להפעיל לחץ ועדינות להסיר את פיפטה מייקר נימים מאת החדר הצדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות לגרש מדגם CSF לתוך צינור אפנדורף שכבר צנן על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך איסוף CSF מכל המלטה של ​​בעלי חיים וברכה את הדגימות לאותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב -10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר את כל תאים מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הדגימות לסימנים של זיהום תאי neuroepithelial או תאי דם אדומים. סימנים של זיהום המופיעים בדרך כלל על ידי הנוזל מופיע מעונן או אדום / ורוד, או הנוכחות של גלולה עם כתם דם נגוע. לאחר צנטריפוגה, CSF ניתן לנתח כל ראיה מיקרוסקופית של תאים או פסולת תאית. אם יש סימנים לזיהום הנוזל אמור להיות מושלך. כבקרה נוספת, תוכן הגלולה עשוי גם להיות מוכתם לתאים. מדגם CSF נקי יכול לשמש לתרבית תאים, תרבות קליפת המוח, ספקטרומטריית, כתם מערבי, ELISA, ומבחנים אחרים. CSF הברור צריך להיות מועבר לצינור אפנדורף סטרילית חדש. המדגם כעת יכול לשמש לניתוח, מסוכם עם דוגמאות אחרות, או צמד קפוא בחנקן נוזלי ואוחסן ב -80 ° C. ההקפאה והפשרה של דגימות קטנות של נוזלים עלולה לגרום לירידת נפח קטן ושינויים בריכוז חלבון. זה יכול להימנע על ידי הקפאת ייבוש הדגימות. </li></ol> 3. Dissection Explant קורטיקלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת E14.5 העובר המבודד מהאלונקה אל צלחת נתיחת מייקר מוכן עם Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עובר מקרומי חוץ עובריים ורקמות כפי שמתואר בשלב 1.5. </li> &lt;li&gt; לשטוף עם תמיסה סטרילית הנקס המאוזן מלח (HBSS) ולהסיר עודפי נוזלים מהעובר מקיף באמצעות פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דרך אזור צוואר רחם הפרדת הראש משאר העובר (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באזמל דק (סכין העינים), לצמצם את קו האמצע של הקרקפת. לתפוס כל צד של חתך זה עם מלקחיים עדינים ולהסיר את העור. בשלב הבא, להשתמש במספרי iridectomy לעשות חתך המפעיל את אורכו של קו אמצע של גולגולת הפיתוח. כתוצאה מכך, להפוך את שני חתכים נוספים, כ 1/3 מהמרחק מהקצוות הקדמיים ואחוריים של גולגולת הפיתוח. השתמש במלקחיים עדינים לתפוס את &quot;כנפיים&quot; של גולגולת שנגרם מחלק זה של הנתיחה, ולהסיר את רקמת גולגולת פיתוח, החושף את קליפת המוח (האיור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש לחצות אזמל המוח לאורך קו האמצע באמצע המטוס sagital, הפרדת ההמיספרות הימנית ושמאלית בקליפת המוח (תרשימים1B, C). פיא והארכניאיד נשארים צמודים לקליפה, והדורה היא הסיר יחד עם גולגולת הפיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אונה כל קליפת מוח בנפרד. הנח את הצד המדיאלי האונה, כך שאתה יכול לראות את רוממות ganglionic וקליפת המוח המתפתח (איורים 1 ג, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באזמל, עושה חתך בעטרת neuroepithelium הזנב לנורת חוש הריח מתפתח קליפת המוח. חתך זה צריך להתחיל בגבול הקדמי של יואיל הוד ganglionic הרוחבי והמדיאלי, ולהאריך דרך אזור cingulate הקדמי של קליפת מוח גמד פיתוח (האיור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות עוד חתך רק זנב לגבול האחורי של רוממות ganglionic הרוחבית (האיור 1F) עטרה. חתך זה צריך גם להרחיב מהגבול הלטרלי של רוממות ganglionic לקיר המדיאלי של גמד קליפת המוח המתפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בי Crea קליפת המוח &quot;הדש&quot;<html> טד על ידי שני החתכים שנעשו בשלבים 3.7 ו -3.8, באמצעות לחץ אזמל או עדין מזרם של HBSS נמסר עם pipettor μl 200, כדי למנוע ניזק מכאני לקליפת המוח. ואז עושה חתך רוחבי לאורך הגבול המפריד בין רוממות ganglionic רוחב מקליפת המוח המתפתחת (התרשימים 1G, ח). לאחר מכן, לנתח את ההתפתחות ההיפוקמפוס ושולי קליפת מוח של telencephalon המדיאלי, בקודקודו של הניאוקורטקס בי משטח קליפת המוח לרוחב פוגש את קיר interhemispheric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך רוחבי לאורך הגבול המפריד בין רוממות ganglionic רוחב מקליפת המוח המתפתחת (איור 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל רקמה גזורה נוספת שהיא על צלחת Sylgard מexplant קורטיקלי הגזור. אפשר להשתמש pipetting העדין עם חיץ HBSS טרי לפיפטה את כל רקמה גזורה נוספת. הקליפה הגזורה היא עכשיו עם צד meningeal פונה כלפי מטה (איור 1 ט). </li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. העברה של Explant קליפת המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לולאת חוט פלטינה מחוברת לכוס טפטפה. מחמם הכוס טפטפה עם חוט פלטינה מקופלת הוכנס בסוף הכוס טפטפה. על ידי סיבוב סוף לולאת חוט הפלטינה, בגודל של הלולאה ניתן להגדיל או להקטין, והלולאה יכולה להיות בצורה שתתאים לגודל של explant הרצוי. (זה יכול להיות מוכן מראש ושימוש חוזר.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את קצה חוט הפלטינה לעקר את הלולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד explant קורטיקלי הגזור ולהסיר את המדיה HBSS הנוספת על ידי pipetting העדין, משאיר כמות קטנה לשימוש עם לולאת התיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קרום פוליקרבונט 1 סנטימטר בקוטר 4 סנטימטר צלחת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצד של לולאת חוט הפלטינה, בעדינות להעיף את הקליפה, כך שצד meningeal פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם explant קליפת המוח את המנה לנתיחה, על ידי נחת explant באמצע הלולאה ושימוש בכוחות הפנימיים להידרוסטטילהרים explant על מישור שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את explant על קרום פוליקרבונט, ולהרים את לולאת חוט הפלטינה כזה שexplant נותר על הקרום במישור שטוח עם משטח חדרית יצירת קשר עם הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות את הקרום ופיפטה μl 50 של CSF או כל מדיה אחרת בקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את תבנית ההדמיה, למקם אותו במכל משני humidified, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 5% 2 עבור 24 שעות כדי לתמוך בהמשך שגשוג של תאים וצמיחת explant. איור 2 מתאר סכמטי של הכנת התבשיל הסופית קורטיקלי explant. </li></ol>

<ol><li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li>
<li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology.+Part+A%2C+Comparative+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li>
<li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record.+Part+A%2C+Discoveries+in+Molecular%2C+Cellular%2C+and+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li>
<li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li>
<li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li>
<li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li>
<li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li>
<li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li>
<li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li>
<li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid%3A+regulator+of+neurogenesis%2C+behavior%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה שתוארה לאוסף CSF חדרית הניבה דגימות יחסית טהורות של CSF העוברי עם הרכב יציב חלבונים ובפעילות עקבית במספר המבחנים סלולריים 9. עם טכניקה טובה וגודל אוסף המלטה של ​​10 E14.5 עכברים, ניתן לצפות לאיסוף 10-15 μl של CSF, ומהמלטה של ​​E16 חולדות, ניתן לצפות לאיסוף על 50-90 μl של CSF. טכניקה זו מקטינה אוסף זיהום מדם ורקמות, על ידי התבוננות זהירה, צנטריפוגה, והשלכה של דגימות עם כל ראיות של פסולת תאית או גוון דם. נתחנו את הנוזל מיקרוסקופי כדי להעריך למפולת סלולרית או תאים בת...

CSF הוא נוזל מורכב שרוחץ neuroepithelium פיתוח 1-6 ומספק 7 חיוניים לחץ וקידום צמיחת אותות למוח המתפתח 8-12. ללמוד CSF במהלך התפתחות מוח, פתחו טכניקות לבודד CSF חדרית מלפתח עוברי חולדה או עכבר במהלך שלבים שונים של פיתוח 6,9. שיטות קודמות של בידוד כללו שימוש בזכוכית מייקרו מחט ובידוד CSF באמצעות מייקרו הזרקת 1,2. השיטה שלנו מנצלת כוס טפטפה מייקר נימי טיפ שכבר משך ליצור נקודת ultrafine לחדירת רקמה משופרת. הכוס טפטפה מייקר הנימים מחובר לaspirator כך ניתן לשלוט שבאוסף CSF חדרית עם שינויים עדינים בלחץ. כדי לחקור את ההשפעות של תאי הגזע של אותות CSF, אנו מחלקים explants קליפת המוח, מניחים אותם על קרומי פוליקרבונט, ולהציף אותם במ&quot;ק המתאיםבינוני lture השלים עם דגימות CSF 9. בעזרת טכניקה זו, נפחים נמוכים של תקשורת מספיקים לתרבות הרקמה, המאפשרים ניצול יעיל של 9 CSF.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Wiretrop השני מחטי נימים </td><td> דראמונד מדעי </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> דבקי Ellsworth </td><td> # 184 SIL Elast ערכה </td><td></td></tr><tr><td> הרכבת צינור aspirator </td><td> סיגמא </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> מסנן פנוי </td><td> נטורי או בית מרקחת מקומי </td><td> לא זמין </td><td> מסנן סיגריה רגיל </td></tr><tr><td> סכין opthalmic Roundstock (15 סכין לדקור את התואר) </td><td> עולם מכשירי דיוק, Inc </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת תרבות 35mm זכוכית תחתית </td><td> מאטק קורפ </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> חוט הפלטינה אירידיום </td><td> Tritech מחקר </td><td> # PT-9010-010-3ft </td><td></td></tr><tr><td> ממברנה Nuclepore מסלול-Etch </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח מאוזנת הנקס </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> מספרי Iridectomy </td><td> כלי מדע פיין </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

CSF הוא נוזל מורכב עם Proteome דינמי משתנה לאורך התפתחות ובבגרות. במהלך התפתחות עוברית, CSF המתהווה מבדיל ממי השפיר על סגירתו של הצינור העצבי הקדמי. נפח CSF ואז מגביר את הימים הבאים כבתאים neuroepithelial מרפדים את החדרים ודמו עין המקלעת ליצור CSF. את מגעי CSF העובריים, משטח חדרית האפיקלי של תאי גזע העצביים של המוח המתפתח וחוט שדרה. CSF מספק לחץ נוזל חיוני להרחבת המוח המתפתח ומפיצת צמיחה חשובה לקידום גורמי בתאים עצביים באופן זמני ספציפי. כדי לחקור את תפקידו של CSF, חשוב לבודד דגימות טהורות של CSF העוברי ללא זיהום מדם או רקמות telencephalic פיתוח. כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד דגימות יחסית טהורות של חדרית העוברית CSF שיכולים לשמש עבורמגוון רחב של מבחנים ניסיוניים כולל ספקטרומטריית מסה, אלקטרופורזה חלבון, ותא ותרבות explant העיקרית. אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות explants קליפת המוח על קרומי פוליקרבונט נקבוביים במטרה לגדל רקמת קליפת המוח מתפתח עם נפחים מופחתים של תקשורת או CSF. בשיטה זו, ניסויים יכולים להתבצע באמצעות CSF מגילים או מצבים שונים כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של CSF Proteome על תאי המטרה.

אוסף CSF אמור להניב נוזל צלול, שקוף. לא צריך להיות שום עדות לזיהום מדם, כפי שהודגם על ידי נוזל אדמדם או צהוב בaspirate ובצינור אפנדורף. גם לא צריך להיות שום ראיות של רקמה בaspirate וצינור אפנדורף. כאשר CSF הוא centrifuged, אפשר גם להעריך את CSF מיקרוסקופי כדי להבטיח שאין זיהום. אם יש סימנים לזיהום, CSF אמור להיות מושלך. מהמלטת 1 E14.5 עכבר, ניתן לחזות איסוף CSF μl 10-15. טבלה 1 מתארת ​​כרכים ממוצעים של CSF שנאספו מגדלי חול ממוצעים בשני העכברים וחולדות בגילים שונים...

הנוזל השדרתי חדרית (CSF) רוחץ את בתאים קליפת מוח neuroepithelial ומוחות במהלך ההתפתחות המוקדמת של מוח בעובר. כאן אנו מתארים שיטה שפתחה לבודד CSF חדרית מעוברים מכרסמים בגילים שונים כדי לחקור הפונקציה הביולוגית שלה. בנוסף, אנו מדגימים נתיחתנו מוחות קליפת מוח explant וטכניקת התרבות שמאפשרת לצמיחת explant עם כמויות מינימאליות של תרבות בינונית או CSF.

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את תפקידם של אותות מופרשים בנוזל ה-CSF העוברי על התפתחות קליפת המוח. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד של CSF עוברי לשימוש כמצע תרבית. בשלבים הבאים, דופן קליפת המוח המתפתחת מבודדת, מונחת על ממברנת פוליקרבונט וצפה על ה-CSF.התוצאות מראות כי נוזל החוט השדרה (CSF) העוברי מספק אותות מנחים לקליפת המוח המתפתחת, בהתבסס על ניתוח של תרביות רקמה (explants) באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ה-CSF. לדוגמה, מהם מרכיבי ה-CSF, מהו תפקידו בנקודות זמן שונות של ההתפתחות, ובסופו של דבר לסייע בקביעה כיצד ניתן יהיה להשתמש בו בעתיד כנשאי טיפול למחלות ניווניות של מערכת העצבים.חשוב ביותר לאסוף CSF ללא זיהום ולמזער את הנזק לרקמה המפרידה של קליפת המוח (cortical explant). הליכים אלו עשויים לדרוש תרגול משמעותי, שכן הם כוללים מניפולציה של רקמות קטנות באמצעות כלי ניתוח עדינים מאוד. התחילו בהכנת מחטי המיקרו-פיפט.לדוגמה, במכשיר משיכה של פיפטות מיקרו אנכיות מסוג Orica PC 10, משכו פיפטות מיקרו-קפילריות של 10 עד 20 µL עם ההגדרות הבאות: משיכה בצעד אחד (one step pull), מחמם מספר 2, המוגדר ל-58, ומשקולת משיכה של 100 g. שברו את קצה הטיפ העדין של מיקרו-הפיפטה באמצעות פינצטה עדינה מספר 55. הקוטר הפנימי הממוצע של המחט שתתקבל יהיה 85 µm.בשלב הבא, הכינו את מכלול השואב. לשאיבת ה-CSF, הכניסו את המיקרו-בוכנה המסופקת עם פיפטות המיקרו-קפילריה לתוך מחט הקפילריה. לחלופין, חברו מסנן פלסטיק חד-פעמי לקצה מכלול צינור השואב המחובר לפיפטת המיקרו-קפילריה.בשלב הבא, בקצה הנגדי של מכלול השואב, דחפו את המחט דרך האטם אל תוך המיקום המיועד. כעת העבירו עובר מבודד של עכבר או חולדה לצלוחית למיקרו-דיסקציה שהוכנה עם syl guard. שטפו את העובר ב-HBSS סטרילי והסירו את הנוזל המקיף את העובר באמצעות שאיבה וייבוש עם נייר סופג.הצג את העובר תחת מיקרוסקופ דיסקציה. אם זהו עובר עכבר, עליו לשכב על צדו, באופן המספק מבט סגיטלי. כעת, הכנס ביציבות את פיפטת המיקרו-קפילריה אל תוך הפרונטריקל הלטרלי או הצפלי, הפרונטריקל המזוצפלי או ה-CI sternum.מגנה מנסה לא לבוא במגע עם התאים הנוירו-אפיתליאליים. לאחר הכנסת הפפטה, יש להכניס את המחט רק עד לנקודת פריצת הרקמה. כעת, התחילו לשאוב בזהירות וברוגע את ה-CSF אל תוך הפפטה, תוך שימוש בלחץ שלילי עדין שנוצר על ידי המיקרו-בוכנה או שאיבה באמצעות הפה.נוזל ה-CSF אמור להתחיל לזרום בעדינות אל תוך פיפטת המיקרו-קפילריה באופן איטי ומבוקר. המשיכו להפעיל לחץ שלילי עד להשלמת האיסוף. קריטי שהאיסוף יניב נוזל צלול ושקוף.אם קיימות ראיות לזיהום דם, כגון גוון אדום או צהוב בתמיסה, יש להשליך את הדגימה הן בעוברים של עכברים והן בעוברים של חולדות. בשלב E 16.5 עד E 17 או מוקדם יותר, ניתן להבחין בקריסה קלה של המערכת (ventricle) במיקום של פיפטת המיקרו-קפילריה. זרימת ה-CSF תיעצר בעקבות אירוע זה; עם סיום הזרימה, הוצא בעדינות את פיפטת המיקרו-קפילריה.בשלב הבא, העבירו בעדינות את דגימת ה-CSF שנאספה אל מבחנה למיקרו-צנטריפוגה שקוללרה על קרח, מໝיר גורים של עכברים ביום הריון E 14.5. צפויות לאסוף בין 10 ל-15 µL של CSF עם השלמת כל פעולות האיסוף. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 10,000 Gs ובטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.כדי להסיר תאי זיהום, העבירו את ה-CSF הצלול למבחנה חדשה. כעת ניתן לבצע בדיקה מיקרוסקופית לאיתור מזהמים במידה והדגימה נחשבת לטהורה. ניתן להשתמש בדגימה לצורך אנליזה, לאגג אותה עם דגימות אחרות, או להקפיאה באופן מהיר (snap frozen) באמצעות חנקן נוזלי ולאחסנה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, כדי לאסוף נתחים קורטיקליים (cortical explants) לניסויים עם מצע השלמה של CSF.בצלחת מצופה סיגר (cigar coated dish), חשוף את קליפת המוח (cortex) של עובר ביום E 14.5. הסר בעזרת סקלפל את הקרומי העבה (duro) יחד עם הגולגולת המתפתחת, אך השאר את הקרומי הרך (pia) ואת הקרומי העכבישי (arachnoid) צמודים לקליפת המוח. בצע חיתוך של המוח לאורכה לאורך קו האמצע במישור הסגיטלי המרכזי (midsagittal plane), כך שתפריד בין חצאי כדור המוח הימני והשמאלי.הכינו כל המיספרה קורטיקלית באופן נפרד. הניחו את ההמיספרה כאשר הצד המדיאלי פונה כלפי מעלה, כך שניתן יהיה לראות את ה-ganglionic imminence ואת הקורטקס המתפתח. בעזרת הסקאלפל, בצעו חתך קורונלי דרך הנוירו-אפיתל הקורטיקלי עד לבצולת הריח המתפתחת.חתך זה צריך להתחיל בגבול הקדמי של הבליטות הגנגליוניות הלטרליות והמדיאליות (lateral and medial ganglionic eminences), ולהתרחב דרך אזור החגורה הקדמי (anterior cingulate region) של נבטי הקורטקס המתפתחים. בצעו חתך קורונלי נוסף צמוד לגבול האחורי של הבליטה הגנגליונית הלטרלית. חתך זה צריך להתרחב מהגבול הלטרלי של הבליטה הגנגליונית עד לקיר המדיאלי של נבטי הקורטקס המתפתחים.השתמשו בסקאלפל כדי להסית את השכבה החיצונית של הקורטקס (cortical flap) שנוצרה על ידי שתי החתכים. פעולה זו מגבילה את הסיכון לפגיעה בקורטקס. כעת, בצעו דיסקציה של ההיפוקמפוס המפתח וההמ הקורטיקלי (cortical hem) של הראש המדיאלי (medial cephalon).בצעו זאת מקודקונו של הניאוקורטקס (neocortex), במקום שבו פני השטח הקורטיקליים הלטרליים פוגשים את הדופן הבין-המיספירהית. לאחר מכן, בצעו חתך רוחבי לאורך הגבול המפריד בין ה-lateral ganglionic eminence לבין הקורטקס שבשלבי התפתחות.הקליפה המנותחת מוכנה כעת כאשר הצד הקרומי פונה כלפי מטה. כדי להעביר את הקליפה, הכינו לולאת תיל פלטינה המחוברת לפיפטת זכוכית; השתמשו במבער בונס כדי להמיס את קצה הפיפטה על תיל הפלטינה. לאחר ההרכבה, סטריליזו את לולאת תיל הפלטינה והמתינו לקירורה.הסיר את עודפי המצע מסביב ל-X explan באמצעות שאיבה עדינה. השאר כמות קטנה של תמיסה לשימוש עם לולאת התיל. לאחר מכן, הנח ממברנת פוליקרבונט של one centimeter בתוך צלחת דימוי בקוטר four centimeter.כעת, באמצעות דופן לולאת תיל הפלטינה, הפכו בעדינות את הקורטקס כך שהצד המנינגיאלי יפנה כלפי מעלה. לאחר מכן, מקמו את ה-X explan במרכז הלולאה, והניפו את ה-cortical X explan מהצלחת באמצעות כוחות הידרוסטטיים פנימיים. לאחר מכן, הניחו בעדינות את ה-explan על ממבנה הפוליקרבונט והסִירו את לולאת תיל הפלטינה.בשלב הבא, טענו פפטה עם 50 µL של CSF או מצע אחר. הרימו בעדינות את הממברנה וזהו את המצע שמתחתיה. לאחר מכן, כסו את כלי הדמיון.הניחו את הדגימה בתוך מיכל משני מלחלח והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 24 שעות. כדי לתמוך בהמשך הפרוליפרציה וצמיחת האקספלנט, חושבו נפחי איסוף של CSF מגודלי שגרים ממוצעים עבור עכברים וחולדות מגילאים עובריים שונים. לאחר איסוף דגימות CSF טהורות, ניתן לנתח את ה-CSF באמצעות מספר טכניקות שונות, כגון צביעה בכסף של מספר µg.נוזל CSF זה הגיע מעכבר בשלב E 14.5. תרביות רקמה (explants) בנות 24 שעות שהתרבו עם 100% CSF הראו היסטולוגיה של רקמה הדומה לעוברים של מכרסמים באותו גיל הריוני, כפי שמוצג בצביעה אימונוהיסטוכימית. pH 3.סמן של חלוקת תאים מובע לאורך המשטח הוונטריקולרי. סמן B-R-D-U של סינתזת DNA מראה גם הוא שילוב לאורך האזור הוונטריקולרי. ו-T uj one, סמן נוירונלי, מובע בפלטה הקורטקלית המתפתחת.לפני ניסיון ביצוע הליכים אלה, חשוב לבדוק את המדיניות המוסדית שלכם בנוגע לטכניקות שהדגמנו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים ללמוד את האותות המופרשים בתוך ה-CSF בהדרכת תפקידו של קליפת המוח במהלך התפתחות in vitro.

isolation-cerebrospinal-fluid-from-rodent-embryos-for-use-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מדגים את פרוטוקול עבור בידוד explants culturing של forebrain העכבר מיום embyonic 12 עכברים. נהלים להסרת הרחם, עוברים מן הרחם, ואת ביתור של עוברים מקבלים. בנוסף המתודולוגיה להעברת אלה explants על ממברנות המקצועית שעליו הם מתורבתים מודגם. התפתחות של המוח הקדמי ניתן ללמוד במבחנה באמצעות ההכנות וכן שינויים בביטוי הגנים.

Forebrain הגב עכבר Explant בידוד

אנו מתארים מתודולוגיה מהירה לבודד ותרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח של עוברי מכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע ניסויים שבהם תרבויות עצביים כמעט טהור נדרשים.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

שיטה שבאמצעותה ביטוי גנים בצינור העצבי יכול להיות downregulated באופן ספציפי לסוג תא, מעקב מתוארת. אנחנו מדגימים...

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח

הסרטון מדגים שיטה פשוטה לתרבית אסטרוציטים מורינים בבידוד מתאי מוח אחרים. במהלך התרבית, על ידי שימוש במדיה ספציפית לאסטרוציטים ועיכוב היצמדות של תאים שאינם אסטרוציטים, השיטה תרבית אסטרוציטים באופן סלקטיבי. אסטרוציטים מתורבתים אלה מציגים מורפולוגיה מהממת עם תהליכים עדינים.

טכניקה פשוטה לבידוד ותרבית אסטרוציטים מורינים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי קליפת המוח הראשוניים מהטלנספלון הדורסולטרלי של עוברי עכברים.

בידוד וגידול תאים מעובר עכבר טלנספלונים דורסולטרליים

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר...

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

אבות להביע Nestin הם אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של אבות עצביים במוח הקטן מתפתח. שימוש בטכניקת microdissection מוצגת כאן בשילוב עם מיון תא הופעל ניאון, אוכלוסיית תא זו יכולה להיות מטוהרת ללא זיהום מאזורים אחרים של מוח קטנים ויכולה להיות מתורבת למחקרים נוספים.

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשחול הידראולי של חוט השדרה וכן זיהוי ובידוד של גרעיני שורש גב ספציפיים (DRGs) באותו מכרסם. בהשוואה לשיטות בידוד חוט השדרה הסטנדרטיות, שיטה זו מהירה משמעותית ומפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

למדו לבודד נוזל שדרתי עוברי ממכרסמים ולטפח explants מוח קליפתי על ממברנות פוליקרבונט. שיטה זו חושפת אותות הדרכה קריטיים לפיתוח הקורטקס ומאפשרת מחקר מתקדם במחלות נוירודגנרטיביות.

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

גלה סרטונים נוספים