הערכת פנוטיפים ניווניות ב דרוזופילה נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך ניוון עצבי של נוירונים דופמינרגיים בדרוזופילה טרנסגנית. זה מושג על ידי ביטוי ראשון של הטרנסגנים הרצויים תחת שליטת מקדם הטירוזין הידרוקסילאז באמצעות מערכת GAL four UAS. השלב השני של ההליך הוא איסוף זבובים מהגנוטיפ הרצוי, להפריד אותם לפי מין ולהזדקן אותם.

השלב השלישי הוא לבחון את פעילות הטיפוס של זבובים על ידי ציר גיאוגרפי שלילי ככל שהם מזדקנים. השלב האחרון הוא לספור את מספר הנוירונים הדופמינרגיים ממוחות מנותחים שנאספו בגילאים שונים. בסופו של דבר, התוצאות יראו שינויים בהתנהגות התנועתית של בעל החיים ובגודל אוכלוסיית הנוירונים הדופמינרגיים שלהם.

ההשלכות של גישה זו משתרעות על טיפול במחלות ניווניות כמו מחלת פרקינסון. גישה זו יכולה לסייע בזיהוי גנים נוירו-פרוטקטיביים והתערבויות פרמקולוגיות כדי להגדיר את הבדיקה, בחר זבובים מותאמי גיל של הגנוטיפים הרצויים. הפרד אותם לפי מין וקבץ אותם באופן אקראי לקבוצות של 20 עד 30 בעלי חיים.

כל קבוצה מייצגת מדגם סטטיסטי. שמור על הקבוצות במחזור חושך בהיר של 12 שעות כדי לשלוט בהשפעות השעון הביולוגי על ההתנהגות התנועה, ובטמפרטורה שניתן לשכפל בחדר הבדיקות. החלף את הבקבוקונים של הקבוצה כל יומיים-שלושה ובדוק אותם מדי שבוע בזמן קבוע.

30 דקות לפני הבדיקה, יש להרדים כל קבוצה בפחמן דו חמצני ולהעביר אותם לצינור פלסטיק מסומן העשוי מבקבוקוני מזון ריקים המחוברים בנייר דבק. הזבובים צריכים להיות ערים לאחר חמש עד 10 דקות, אך התאוששות מלאה מההרדמה משתנה עם הגיל והגנוטיפ ויש לייעל אותה. כעת. צור סולם גובה כדי להציג מאחורי בקבוקוני הבדיקה.

סמן מרחקים בין סנטימטר ל -20 סנטימטרים על פיסת נייר לבן. לאחר מכן אבטח את הסולם למקומו. כעת יישר את הצינורות שייבדקו כנגד האבנית במרחק של כ-20 עד 30 סנטימטרים.

מקם מצלמה דיגיטלית עם תצוגה מרובעת של הבקבוקונים. ודא שהתוויות על הצינורות והסולם נראים בבירור. לאחר המיקום, התחל את ההקלטה והפעל טיימר דיגיטלי.

כעת הקש על צינור למשך מספר שניות. כל הזבובים צריכים לאסוף את תחתית הצינור. הקפד לבצע שלב זה באופן עקבי באותו משך ובאותו כוח לאורך כל הניסוי.

לאחר דקה, חזור שוב על הנוקדאון בשני מתוך 15 ניסיונות רצופים. לאחר השלמת 15 הניסויים, החזירו את הזבובים לבקבוקונים טריים על ידי בדיקה ויזואלית של הסרטים. עבור כל אחד מ-15 הניסויים שבוצעו לכל עוקבה, ספרו את מספר הזבובים מעל שני הסנטימטרים.

לאחר שחלפו 10 שניות, סימן שני הסנטימטרים נקבע באופן אמפירי, זהו המרחק שכל הפקדים חוצים לאחר 10 שניות ברבים מהגילאים הנבדקים. קח את הציון הממוצע מ-15 הניסויים והביע אותו כאחוז מחברי הקבוצה שחצו את המטרה. מספר החזרות הסטטיסטיות שווה למספר הקבוצות שנבדקו עבור כל קבוצה, ולא לפי 15 הניסויים.

להעריך את המובהקות הסטטיסטית בין גנוטיפים שונים באמצעות מבחן T, אנובה או שיטות ניתוח מתאימות אחרות. שמים זבובים בכלי דיסקציה עם 70% אתנול למשך כדקה. להסרת שעוות הציפורן.

לאחר מכן העבירו את הזבובים לצלחת חיתוך אחרת מלאה ב-PBS קר כקרח, והמשיכו בניתוח המוח. מקם את הזבוב כשהצד הגחוני כלפי מעלה והסירו את הכנפיים והרגליים. השתמשו בסט אחד של מלקחיים כדי לאחוז בגוף, ובסט אחר כדי להחזיק את הקוטיקולה שמתחת לעין.

ואז משוך את הראש מהגוף. לאחר מכן, הסר את החרטום על ידי משיכתו מהראש. לאחר מכן תפסו את ציפורן הראש בקצוות מנוגדים של החור החדש, ומשכו בכיוונים מנוגדים עד שהמוח מוסר מקפסולת הראש.

כעת, בעדינות, הסר את הקוטיקולה שנותרה משטח המוח. לאחר מכן הסר את כל רקמת קנה הנשימה המלאה באוויר. זה ימנע מהמוח לצוף במהלך שלבי הדגירה הבאים.

הכן פיפטה לטיפול במוח מקצה פיפטה P 200. חותכים כמה מילימטרים ומאזן אותו עם 0.1%טריטון X 100 ב-PBS. העבירו את המוח לצינור של חצי מיליליטר מלא כולו ב-4% PFA ב-PBS.

תקן את המוח בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בסיבוב עדין. לאחר 20 דקות, השתמש בפיפטה P 1000 כדי להחליף את הקיבוע בחצי מיליליטר של מאגר כביסה שהוא 0.1% טריטון X 100 ב-PBS. מערבבים על ידי היפוך ומאפשרים למוח לדגור במשך דקה אחת לפני החלפת מאגר הכביסה.

לאחר דקה, החלף את מאגר הכביסה בפעם השנייה ודגר את המוח בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן החלף את מאגר הכביסה בפעם השלישית ודגר את המוח למשך 20 דקות נוספות. כעת, הסר את מאגר הכביסה ותן למוח לדגור בחצי מילימטר של מאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר שעה, הוסף דילול של 1 עד 100 של נוגדן אנטיט בתמיסת חסימה. תן לו לדגור במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. כדי להסיר את החסימה, חזור על השטיפות המשמשות להסרת התיקון.

לאחר מכן יש לאזן את המוח עם חצי מיליליטר של דילול של 1 עד 200 של נוגדן משני בתמיסת חסימה למשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. מספר ימים לאחר מכן, הסר את הנוגדן המשני באותו הליך שטיפה. להכנת שקופיות ההרכבה, הוסף 2 טיפות של 25 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה לזכוכית כיסוי.

הנח שתי כוסות כיסוי על אמצעי ההרכבה עם רווח באמצע. הניחו לשקופיות להתייבש. אם רוחב שקופית ההרכבה אינו מתאים ל-tagשל המיקרוסקופ הקונפוקלי, השתמש בלק כדי לחבר לשקופית כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר כך שתתאים כראוי.

כעת החלף את הפתרון בו נמצאים המוחות ב -50 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה. אזנו את המוח עם אמצעי ההרכבה על ידי פיפטינג עם קצה P 200 חתוך. לאחר מכן, השתמש בקצה P 200 חתוך כדי להעביר את המוח לתעלה.

בשקופית ההרכבה, כוונו את המוח כדי לראות את הצד הקדמי או האחורי שלהם. לאחר מכן כסו אותם בהחלקת כיסוי מספר 1.5 ומפינה אחת, מלאו את החלל בין משקפי הכיסוי באמצעי הרכבה כדי להסיר את כל האוויר. הניחו לשקופיות להתייבש ולאחר מכן אטמו אותן בלק לפני בדיקתן.

אלפא-סינוקלאין אנושי התבטא בתאי עצב DA באמצעות נהג TH GAL 4 במבחן הטיפוס. זכרים המבטאים טרנסגן זה הראו ירידה מואצת ביחס לבקרות המותאמות לגיל ולטיסה כ-coex המבטא את השותף המחייב NRF 2D NA. נקבות Math S הראו תוצאות דומות בהשוואה בין זבובים זכרים בני ארבעה שבועות מגנוטיפים שונים.

ספירת נוירוני DA מבוססת אימונופלואורסצנציה שימשה לכימות מספר נוירוני PPL one. אובדן קטן אך משמעותי של נוירוני PPL 1 נמצא בזבובים המבטאים אלפא-סינוקלאין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך ניוון עצבי של נוירוני ה-varg ב-ZOA טרנסגני על ידי מבחני CLA ואימונופלואורסצנציה של טירוזין aase.

תודה שצפית.