Name: הערכת פנוטיפים ניווניות ב דרוזופילה נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למדו להעריך ניוון נוירונים דופאמינרגיים בדרוזופילה באמצעות מבחני לאז ו-immunostaining. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכי הזדקנות עצבית ולהבין מנגנונים של מחלות ניווניות כמו פרקינסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליאו Pallanck למניות זבובים, כריסטין סומרס לקבלת סיוע טכני וגרסימוס פ Sykiotis לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי NIH אימוני המענק T32CA009363 לMCB

1. Assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זבובים של הגנוטיפ הרצוי, להפריד ביניהם על פי מין, באופן אקראי קבוצתם בקבוצות של 20-30 חיות ולהעיף אותם לתוך צלוחיות מזון חדשות כל 2-3 ימים; בדיקה כל קבוצה של זבובים (קבוצות גיל בהתאמה כלומר, עוקבה / אחד גנוטיפ) לפחות פעם בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושים דקות לפני בדיקת geotaxis השלילית, להרדים את הזבובים עם CO 2 ולמקם אותם בצינורות פלסטיק שקופים שכותרתו מראש שנעשו עם שני בקבוקוני מזון ריקים (ראה טבלת חומרים) הצטרפו בפתחיהם עם קלטת ברורה (קאמריים ממדים: 19 ס&quot;מ על 2.85 ס&quot;מ). במבחנים שלנו בדרך כלל אנו משתמשים 25 זבובים / צינור. הערה. זמן ההתאוששות מהרדמה יכול להיות מגוון מכמה דקות לכמה שעות (לדוגמה: O / N) וצריך להיות מותאמת לגנוטיפים הספציפיים שנבדקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן גבהים שונים (מ -1 עד 20 ס&quot;מ) על פיסת נייר וקלטת נייר סופג בsurfac אנכידואר, בניצב לספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות בראשונים של העיתון: הצינורות צריכים להיות כל מיושרים וקרובים ככל האפשר לנייר כדי לאפשר מדידת גובה מדויקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה הדיגיטלית (ראה טבלת &quot;ציוד המיוחדת&quot;) בחזית של הצינורות, במרחק של 20-30 ס&quot;מ מהנייר, על מעמד (למשל תיבת קצה פיפטה), בחר באפשרות &quot;הסרט&quot; ולהתחיל הקלטה; בשלב זה אתה גם צריך להתחיל טיימר כדי לעקוב אחר הזמן בין משפטים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לזבובים לאסוף בחלק התחתון של הצינור על ידי הקשה על הצינור לכמה שניות (לדוגמא 10 שניות). צעד זה צריך להתבצע באופן עקבי (כלומר אותו משך זמן, אותו כוח, אותו מפעיל) לאורך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועות &quot;זבובים להקליט עם המצלמה הדיגיטלית עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.5-1.7 ארבעה עשר פעמים במרווחים חד min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר הזבובים שהם מעלסימן 2 ס&quot;מ לאחר 10 שניות על ידי בדיקה ויזואלית של סרטים המוקלטים. הערה: בתנאי assay שלנו התנהגות geotaxis השלילית של הזבובים לא נמשכת מעבר ל10 שניות הראשונה לאחר מפתיע (כלומר זבובים החלו לנוע לכל הכיוונים 10 שניות לאחר שהבהיל אותם). המרחק המינימאלי טיפס על ידי זבובי בקרה (כלומר 1 זבובים ישנים בשבוע המבטאים את נהג THGal4, ראה אגדה של איור 1) בחלון זמן זה היה 2 ס&quot;מ. לכן, השתמשנו בסימן 2 ס&quot;מ כהפניה לניתוח פעילות הטיפוס של זבובים של גילים וגנוטיפים 10 שניות לאחר שיזם את ההתנהגות שונים. פרמטרים אלה עשויים לדרוש התאמה לחשבון להבדלים בהתנהגותם של הזבובים שנבדקו (בשל למשל לרקע גנטי שונה או בתנאי מעבדה). שים לב שבתנאי assay שלנו, את כל גנוטיפים נבדקו ביצע גרוע או בדומה לזבובים של גנוטיפ השליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הממוצע של התוצאות מהחמש עשרניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע מפורש כאחוז מהמספר הכולל של זבובים בצינור (= פעילות טיפוס%); מספר החזרות (N) ניתן על ידי מספר הקבוצות עצמאיות שנבדקו עבור כל גנוטיפ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את המשמעות סטטיסטית בין גנוטיפים שונים לאורך זמן. זה יכול להיות מושלם עם מבחן t של סטודנט (כאשר משווים שני גנוטיפים) או ניתוח ANOVA-2 דרך ואחריו Bonferroni פוסט הוק בדיקה (בעת ביצוע השוואות מרובות) באמצעות תוכנות מסחריות כגון GraphPad (GraphPad תוכנה, Inc.La הויה, קליפורניה, ארה&quot;ב). </li></ol></li></ol> פתק אנו מבצעים את כל מבחני שלנו באותו הזמן של היום, ב RT ותחת אותם תנאי האור. שמירה על הזבובים בסביבת מחזור אור / חושך 12 שעות רצוי לשלוט על ההשפעה של מקצבי היממה על ההתנהגות של תנועה של הזבובים. 2. Immunofluorescence hydroxylase טירוזיןAssay של Mounts המוח כל פתרונות וחוצצים פתרון מקבע: paraformaldehyde 4% (PFA) ב פוספט שנאגרו מלוח (PBS) כביסה חיץ: 0.1% טריטון X-100 ב PBS חסימת מאגר: 0.1% טריס-HCl, pH 7.5, 0.15 מ &#39;NaCl, 0.1 טריטון X-100 ו 0.5% BSA תקשורת הרכבה: Mowiol-Dabco (ראה פרוטוקול המתואר בארלו E, ליין ד, נוגדנים-מעבדה ידני, מעבדות קולד ספרינג הרבור עיתונות, קולד ספרינג הארבור, ניו יורק, ארה&quot;ב, 10:418 (1988)) נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים זבובים בצלחת לנתיחה מלאות EtOH 70% לכ - 1 דקות כדי להסיר את השעווה לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה עפה לצלחת לנתיחה נוספת מלאות קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את המוח: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הזבוב עם הצד עד הגחון (אופציונלי: כנפיים ורגליים סרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הראש מהגוף: להשתמש בסט אחד של מלקחייםלשמור על הגוף ועוד אחד להחזיק בציפורן תחת עיינותיו כדי למנוע נזק למוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק בציפורן את הראש בצדדים מנוגדים של החריץ שנותרו פתוח לאחר הסרת החוטם ומושך בכיוונים מנוגדים, עד שהמוח הוא להסיר את הקפסולה בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הציפורן מהמוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הרקמות קנה הנשימה אוויר מלאה, זה ימנע מהמוח צף בשלבי הדגירה הבאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כמה מילימטרים מחוץ לקצה של קצה P-200 פיפטה ולאזן אותו עם 0.1% פתרון X-100/PBS טריטון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה P-200 פיפטה המוכן, להעביר את המוח לצינור Eppendorf 0.5 מ&quot;ל מלא 0.5 מ&quot;ל של PFA 4% / PBS ולשמור על קרח עד לנתיחה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המוח על RT במשך 20 דקות: להחיל סיבוב עדין על ידי לשים את צינורות Eppendorf על מדף ומיקום המדף על nutator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבעבאמצעות P-1000 מיקרו פיפטה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של X-100/PBS טריטון 0.1%, מערבב על ידי היפוך ולתת דגירה דקות 1; חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החוצץ מלשטוף את השני, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של X-100/PBS טריטון 0.1% ולתת לדגור על RT במשך 20 דקות, לחזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ הכביסה ולתת למוח של דגירה בחיץ חסימה (0.1 מ &#39;טריס-HCl, pH 7.5, 0.15 מ&#39; NaCl, 0.1% טריטון X-100 ו 0.5% BSA) עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את המוח עם דילול 1:100 של נוגדן אנטי-TH (ראה &quot;טבלה של חומרים כימיים ספציפיים&quot;) בפתרון חסימה, במשך יומיים, בשעת 4 ° C, עם סיבוב עדין (ראה שלב 2.6.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעדי הכביסה 2.7. ו2.8 .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את המוח עם דילול 1:200 של פתרון חסימת antibodyin המשני, במשך יומיים, ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צעדי הכביסה 2.7. ו2.8 .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שקופיות הרכבה כפי שמודגם באיור 2 א: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">dd 2 X 25 טיפות של μl תקשורת הרכבה למכסה זכוכית (24 מ&quot;מ X 60, לא. 1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שתי כוסות כיסוי (גודל 18 x 18 מ&quot;מ, לא. 2) על תקשורת ההרכבה עוזבת פער באמצע השקופית ולתת להתייבש. </li></ol> שים לב. בדקו את בעל המדגם על הבמה של מיקרוסקופ confocal שלך. אתה יכול לעשות את מכסה הזכוכית באותו גודל של 25 x 75 מ&quot;מ שקופית על ידי הצמדת זכוכית 22 x 22 מ&quot;מ 1.5 כיסוי לאחד הקצוות (להשתמש בלק וקלטת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ הכביסה, להוסיף 50 μl של תקשורת הרכבה ולאפשר למוח כדי לאזן עם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חתך P-200 פיפטה קצה (ראה שלב 2.4) להעביר את מוחות לשקופית במרחב שבין שתי coverslips ולכסות אותם עם coverslip לא. 1.5 (ראה איור 2 א; כדי לכוון את מוחם בשקופית רואה 7). הערה: את הדגימות הם רכובים בין שתי כוסות כיסוי כדי לאפשר הדמיה של שניהם הקדמי וPosteצד rior של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את כל החלל שבין משקפיים לכסות עם תקשורת הרכבה; פיפטה מפינה אחת כדי להסיר את כל האוויר; לתת יבש וחותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעריך את המספר של נוירונים דופאמין באשכול ספציפי לרכוש סדרה של קטעים אופטיים לאורך ציר ה-Z עם 1.0 מיקרומטר גודל צעד באמצעות מיקרוסקופ confocal (לזיהוי האנטומי של אשכולות דופאמין במוח הבוגר תסיסנית לראות 7). </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li>
<li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson%27s+Disease+and+Related+Synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706(2011).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li>
<li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

אנו מצהירים כי אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים.

מבחני מתוארים כאן לספק גישה כדאי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים, מסלולי איתות או תרכובות קטנות בתחזוקה של נוירונים תובע בהזדקנות, כמו גם ברקע גנטי הקשורים למחלות שונות (הנסקרת ב 5). התנהגות geotaxis השלילית הנגרמת בהלה של דרוזופילה כבר נעשתה שימוש נרחב כפונקציונלי קריאה החוצה לפונקציונלי של תאי עצב DA ברקע גנטי שונה, במיוחד בנוכחות של מוטציות פ&quot;ד צמודות. כמה סתירות בין מחקרים שונים נצפו...

את הספציפיות של מבחני המתוארות כאן מסתמכת על השימוש בקו זבוב Gal4 המנצל את רצפי הרגולטורים של גן hydroxylase טירוזין כדי להשיג ביטוי ספציפי בדופאמין נוירונים 3. hydroxylase טירוזין מזרז את הצעד הראשון ושער הגבלת בסינתזת דופמין. immunoreactivity בעולם בחופף במוח זבוב בוגר עם זה של דופמין, מה שהופך TH מועמד טוב לזהות נוירונים DA in vivo (ראה, למשל, 6). יתר על כן, את דפוס הביטוי של THGal4 הוא יותר ספציפי מזה של Gal4 קווים אחרים כגון DdcGal4, המכיל רצפים רגולטוריים מגן decarboxylase dopa ומניע את הביטוי מהונדס לא רק בתאי עצב DA, אלא גם בתאי עצב serotoninergic ותת קבוצות של תאי גלייה 3 . Feany והנדר (2000) נצפו לראשונה כי ביטוי הפאן עצבי של גן פ&quot;ד הצמוד האנושי α-synuclein מאיץ את האובדן ההדרגתי של STAהתנהגות geotaxis שלילית מושרה rtle בדרוזופילה. יש לנו נצפתה תוצאות דומות באמצעות THGal4 הקו הספציפי DA-נוירון לנהוג expressionof α-synuclein transgene 10 והשתמשה בזה תפקודי קריאה החוצה כדי ללמוד את תפקיד neuroprotective של מסלול Nrf2 בזה מודל של דרוזופילה פ&quot;ד 14. Assay הספציפי המתוארים כאן הוא עיבוד 2 ו -3. מוח תסיסנית מכיל יותר מ -100 נוירונים DA, מסודרים בלפחות 5 אשכולות שונים (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) אשר יכולה להיות דמיינו בmounts כל המוח על ידי מיקרוסקופיה confocal (ראה למשל 11 ו -7). זה עדיין שנוי במחלוקת או לא מספר הנוירונים DA בירידות במוח תסיסנית עם גיל 9, 11, עם זאת, ניוון מוחיים תלוי גיל הוא ציין בזבובים שבו גני פ&quot;ד צמודים כבר מוטציה / overexpressed למודל מחלות אנושיות5. הביטוי של אדם α-DA synuclein בנוירונים יש השפעה כזו, ולכן, כבר משמש כמודל למחלת פרקינסון. כאן אנו מתארים assay לנוירונים DA לספור במוח כולו עולה באמצעות TH כסמן תא. assay זה הותאם מ -13 ו -10.

<table><tbody><tr><td>נוגדן אנטי טירוזין הידרוקסילאז מארנבת</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מסומן TRITC מארנבת נגד IgG מארנבת</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ציוד</td></tr><tr><td>בקבוקונים מפוליסטירן</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 ממ</td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (מודל)</td><td>12.1 מגה-פיקסל זום אופטי 4X</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית מס' 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>גדלים: 18 x 18 ממ, 24 x 60 ממ</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית מס' 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>גודל: 18 x 18 ממ</td></tr><tr><td>צלחות ניתוח</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>גודל: 30 ממ קוטר חיצוני</td></tr><tr><td>מלקחיים Dumostar מס' 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (מודל)</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>SP2 או SP5 (מודל)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלת חומרים.</td></tr></tbody></table>

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

תסיסנית היא אורגניזם מודל חשוב ללמוד הזדקנות ותהליכים ניווניים פתולוגיים במערכת העצבים. היתרונות של הזבוב כמערכת ניסיונית כוללים עקיבותיה גנטיות, תוחלת חיים קצרה ואת האפשרות להתבונן ולנתח כמותית התנהגויות מורכבות. הביטוי של גני מחלה צמודים באוכלוסיות עצביות מסוימות במוח דרוזופילה, יכול לשמש מודל למחלות אנושיות ניווניות כגון פרקינסון ואלצהיימר 5 של. דופאמין (DA) נוירונים הם בין האוכלוסיות העצביות הפגיעות ביותר במוח האנושי ההזדקנות. במחלת הפרקינסון (PD), ההפרעה בתנועת ניווניות השכיחה ביותר, האובדן המואץ של תובע הנוירונים מוביל לירידה הדרגתית ובלתי הפיכה בתפקוד של תנועה. בנוסף לגיל וחשיפה לרעלים סביבתיים, אובדן DA נוירונים מחריף על ידי מוטציות ספציפיות בקידודאזורי האמרגן או של מספר גנים. זיהוי אללים כאלה PD-נלווים מספק את הבסיס הניסיוני לשימוש בדרוזופילה כמודל ללמוד ניוון מוחיים של נוירונים DA in vivo. לדוגמה, הביטוי של גן α-synuclein האנושי פ&quot;ד הצמוד בתסיסנית משחזר DA נוירונים תכונות מסוימות של המחלה בבני האדם, למשל אובדן הדרגתי של נוירונים DA ותפקוד של תנועה 2 במגמת ירידה. בהתאם לכך, מודל זה שימש בהצלחה לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות בפ&quot;ד 8. כאן אנו מתארים שני מבחני שיש בדרך כלל נעשה שימוש כדי ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של נוירונים DA בדרוזופילה: assay טיפוס המבוסס על התגובה הנגרמת בהלה השלילית geotaxis וimmunostaining hydroxylase טירוזין של כל המוח בוגר mounts כדי לפקח על מספר הנוירונים DA בגילים שונים. בשני המקרים, בביטוי vivo של כטב&quot;מ לאransgenes במיוחד בנוירונים DA יכול להיות מושגת על ידי השימוש בhydroxylase טירוזין (TH) אמרגן Gal4 קו נהג 3, 10.

יש לנו בשימוש במבחנים שתוארו כאן כדי ללמוד את התפקיד של מסלול Nrf2 מגן מתח במודל של דרוזופילה פ&quot;ד 14. מודל זה מסתמך על הביטוי של גן α-synuclein האנושי בנוירונים תובע באמצעות Gal4 נהג TH 2, 10. איור 1 מראה תוצאת נציג של geotaxis שלילית המושרה בהלה (טיפוס) assay בזבובי זכרים מבטאים transgenes שונה תחת שליטתו של נהג Gal4 TH. כל גנוטיפים נבדקו יפגינו ירידה בפעילות ...

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA) בנוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt;: הטיפוס / assay geotaxis השלילי הנגרם בהלה המאפשר ללמוד את ההשפעות הפונקציונליות של תאי עצב וניוון DA immunostaining hydroxylase טירוזין המשמש לזיהוי וספירת תאי עצב DA בmounts כל המוח.

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

המטרה הכוללת של הנוהל הזה היא להעריך ניוון של נוירונים דופמינרגיים בדרוזופילה טרנסגנית. זה מושג על ידי הבעת הגנים הרצויים תחת שליטה של פרומוטר טירוזין הידרוקסילאז באמצעות מערכת GAL ארבע UAS. השלב השני של הנוהל הוא לאסוף זבובים מהגנוטיפ הרצוי, להפריד אותם לפי מין ולהזקינם.השלב השלישי הוא לבדוק את פעילות הטיפוס של הזבובים על ידי ציר גאו-שלילי כשהם מזדקנים. השלב האחרון הוא לספור את מספר הנוירונים הדופמינרגיים ממוחות מנותחות שנאספו בגילאים שונים. בסופו של דבר, התוצאות יציגו שינויים בהתנהגות הלוקומוטורית של החיה ובגודל אוכלוסיית הנוירונים הדופמינרגיים שלה.ההשלכות של גישה זו משתרעות על טיפול במחלות ניווניות כגון מחלת פרקינסון. גישה זו יכולה לעזור בזיהוי גנים נוירופרוטקטיביים והתערבויות פרמקולוגיות. כדי להקים את הבדיקה, בחר זבובים בני גיל תואם מהגנוטיפים הרצויים. הפרד אותם לפי מין וקבץ אותם באופן אקראי לקבוצות של 20 עד 30 בעלי חיים.כל קבוצה מייצגת מדגם סטטיסטי. שמור את הקבוצות במחזור 12 שעות של אור וחושך כדי לשלוט בהשפעות של מחזורי יומיים על התנהגות הלוקומוטורית, ובטמפרטורה שניתן לשכפל אותה בחדר הבדיקה. החלף את בקבוקי הקבוצה כל יומיים-שלושה ובדוק אותם מדי שבוע בזמן קבוע.30 דקות לפני הבדיקה, הקהה כל קבוצה בפחמן דו-חמצני והעביר אותם לצינור פלסטי ממוספר העשוי מבקבוקי מזון ריקים המחוברים בסרט. הזבובים צריכים להתעורר לאחר חמש עד 10 דקות, אך התאוששות מוחלטת מההרדמה משתנה בהתאם לגיל ולגנוטיפ ויש לייעל אותה. עכשיו. צור סולם גובה כדי לראות מאחורי בקבוקי הבדיקה.סמן מרחקים בין אחד ל-20 סנטימטרים על פיסת נייר לבן. לאחר מכן אבטח את הסולם במקומו. עכשיו יישר את הצינורות שיש לבדוק אותם לעומת הסולם במרחק של כ-20 עד 30 סנטימטרים.מקם מצלמה דיגיטלית עם תצוגה מרובעת של הצינורות. וודא שהתוויות על הצינורות והסולם נראות בבירור. לאחר המיקום, התחל את ההקלטה והתחל טיימר דיגיטלי.עכשיו הקש על צינור למספר שניות. כל הזבובים צריכים לאסוף את תחתית הצינור. הקפד לעשות את השלב הזה באופן עקבי עם אותו משך זמן וכוח זהה לאורך כל הניסוי.לאחר דקה, חזור על ההדחה שוב למשך 15 ניסויים רצופים. כאשר כל 15 הניסויים הושלמו, החזיר את הזבובים לצינורות טריים על ידי בדיקה ויזואלית של הסרטונים. עבור כל אחד מ-15 הניסויים שבוצעו לכל קבוצה, ספרו את מספר הזבובים מעל סימן שני סנטימטרים.לאחר שחלפו 10 שניות, סימן שני הסנטימטרים נקבע באופן אמפירי, זהו המרחק שכל הבקרות חוצות לאחר 10 שניות ברוב הגילאים שנבדקו. קח את הציון הממוצע מ-15 הניסויים ובטא אותו כאחוז מחברי הקבוצה שחצו את הסימן. מספר החזרות הסטטיסטיות שווה למספר הקבוצות שנבדקו לכל קבוצה, ולא ל-15 הניסויים.הערך את המשמעות הסטטיסטית בין גנוטיפים שונים באמצעות בדיקת T של סטודנט, ANOVA או שיטות ניתוח מתאימות אחרות. שים את הזבובים בכלי ניתוח עם 70% אתנול למשך דקה אחת. כדי להסיר את שעווה הגוף.לאחר מכן העבירו את הזבובים לכלי ניתוח אחר מלא PBS קר קרח, והמשיכו בניתוח המוח. הציבו את הזבוב עם הצד הגחון כלפי מעלה ואופציונלית הסירו את הכנפיים והרגליים. השתמשו בסט צבת כדי להחזיק את הגוף, ובאחר להחזיק את הגוף מתחת לעין.לאחר מכן משוך את הראש מהגוף. לאחר מכן הסר את החדק על ידי משיכתו מעל הראש. לאחר מכן אחז בגוף הראש על קצוותיו הנגדיות של החור החדש, ומשך לכיוונים מנוגדים עד שהמוח הוסר מקפסולת הראש.כעת הסר בעדינות את יתרת הגוף משטח המוח. לאחר מכן הס

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מבחני התנהגות למדידת פונקציות של תנועה, למידה, ויכולות...

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

סרטון זה מתאר שיטה פשוטה לכימות תנועת הזבובים ומציג את בדיקת הטיפוס שבוצעה. מבחן טיפוס הזבובים הוא מבחן כללי של תפקוד מוטורי המסתמך על תגובת גיאוטקסיס שלילית.

בדיקת טיפוס זבובים: שיטה לבדיקת תנועה כללית בדרוזופילה מלנוגסטר

אנו מציגים בדיקת גיאוטקסיס שלילית אופטימלית, זולה ואמינה ב-Drosophila melanogaster כמודל להפרעות ניווניות. בהיותה רגישה יותר לפגמים תנועתיים קלים, בדיקה זו תעזור לסנן אינטראקציות גנטיות פוטנציאליות ומטרות תרופתיות.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מנתח התנהגות שלילית geotaxis דרוזופילה באמצעות מערכת אוטומטית צילינדר רב מארח מאות זבובים ומסנכרן פעולתם על ידי מנוע חשמלי. בעת סינכרון, התנהגות לטוס geotaxis שלילי זה לבדיקה, דיגיטלית המוקלט ולאחר שנותחה שימוש בתוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.

וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות הכולל עריפת ראש, קיבוע, קריוסקציה, צביעה פלואורסצנטית, צביעה חיסונית והדמיה, שניתן להרחיב להדמיה קונפוקלית ורב-פוטונית. השיטה שומרת על יעילות דומה לדיסקציות מורכבות, ועוקפת את הצורך במיומנויות מוטוריות מתקדמות. ניתוח תמונה כמותי מספק פוטנציאל חקירה נרחב.

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

למדו להעריך ניוון נוירונים דופאמינרגיים בדרוזופילה באמצעות מבחני לאז ו-immunostaining. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכי הזדקנות עצבית ולהבין מנגנונים של מחלות ניווניות כמו פרקינסון.

הערכת פנוטיפים ניווניות ב

גלה סרטונים נוספים