רומן ברזולוציה גבוהה
16 ביוני 2013
אנו מתארים רומן In vivo טכניקת הדמיה שזוגות עכברי chimeric ניאון עם חלונות תוך גולגולתי ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה 2 פוטונים. מחקרי הדמיה זו פלטפורמת איידס של שינויים דינמיים ברקמת המוח וmicrovasculature, ברמת תא בודד, בעקבות עלבונות פתולוגיים וניתנים להתאמה על מנת להעריך משלוח סמים תוך גולגולתי והפצה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים של תאי מקור המופקים ממח העצם, בעקבות דפוסי הגיוס שלהם לכלי דם במוח תקין ובמוח עם גידול מוחי לאורך זמן. מטרה זו מושגת על ידי הסרת השוקה (tibia) והירך (femur) מעכברי תורם כדי להשיג תאי מקור פלורסצנטיים ממח העצם, ולאחר מכן הזרקת תאים אלו לעכברי מקבל שהוקרנו. השלב השני הוא יצירת קסנוגרפטים (xenografts) של GBM תוך-גולגולתיים בעכברים הכימריים בתוך תא חלון גולגולתי.
בשלב הבא, העכברים עוברים משטרי טיפול מגוונים הכוללים הקרנה מודרכת סטריאוטקטית. השלב הסופי הוא הדמיה של העכברים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דו-פוטוני. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור באופן דינמי את מנגנוני הווסקולריזציה תוך-גולגולתית במגוון מודלים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון היסטופתולוגיה של רקמה ex vivo, הוא היכולת לחקור מידע דינמי קריטי הקשור להיווצרות כלי דם במוח. באופן זה, אנו יכולים לענות על שאלות מפתח הנוגעות למנגנונים של נאווסקולריזציה תוך-גולגולתית. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפיק תובנות על נאווסקולריזציה תוך-גולגולתית, היא ניתנת ליישום גם במערכות ובתהליכי מחלה אחרים במוח, כגון איסכמיה תוך-גולגולתית או שבץ מוחי, מחלות נוירודגנרטיביות ומנגנונים של גרורות תאי גידול למוח.
לצורך סרטון זה, לא יכולנו להקפיד על טכניקה אספטית מחמירה. לפיכך, פתח מטאב הסביבה העצירית הוא רחב מ-12 אינץ' והחיות אינן מכוסות, כדי לאפשר לצופה תמונה ברורה יותר וגישה טובה יותר להבנת הפרוצדורות לצורך עבודה ניסיונית. יש להקפיד באופן מחמיר על טכניקה אספטית.
התחילו את הפרוצדורה על ידי אישור ביטוי הפלורסצנציה של עכבר התורק של ה-GFP והקריבו אותו בהתאם להנחיות ועדת הרווחה לבעלי חיים המוסדית. לאחר מכן, נקו את שתי הגפיים האחוריות והוציאו את הטיביה (שוק) ואת הפמור (ירך) תוך עבודה בתנאים אספטיים. הסירו את כל הרקמות העודפות מהעצמות.
לאחר מכן, הסירו את לוחות הקצה משני קצוותיהם של ארבע העצמות שהוצאו. שטפו אותן באמצעות מחט במידה 22 ו-1 ml של PBS סטרילי. הן יהפכו לשקופות ברגע שכל מחולית העצם תסולק.
לאחר מכן, ערבבו את תרחיף מחית העצם שהופק. התרחיף צריך להכיל כ-20 מיליון תאים, כמות המספיקה לשחזור של שלושה עכברים מאכסנים. כעת, הכינו 3 מחטי טוברקולין במידה 27 ושאבו 300 µL של תרחיף מחית העצם לתוך כל אחת מהן.
בעוד העכבר ממוקם במכשיר הריסון, סמנו את פני השטח הגבי של הזנב כדי להכווין את עצמכם. לאחר מכן, הזריקו את התמיה לווריד הצדי של הזנב בשלושה עכברים שהוקרנו בעבר.
שבב עכברים מסוג nod skid בפרוצדורה זו תחת תנאים אספטיים. הרדם את עכברי ה-nod skid הכימריים שקיבלו השתלה של מוח עצם, ותן אלגזיה מניעתית מאושרת על ידי ה-iacuc. מרח ג'ל דמעות למניעת התייבשות הקרנית.
נקה תחילה את הראש באמצעות תמיסת Betadine, לאחר מכן באמצעות אלכוהול והסר את השערות העודפות. לאחר מכן, נקה את קרקפת הראש שמתחתן פעם נוספת עם אלכוהול. בצע חתך מנקודת האמצע של האוזניים עד למעלה מהעיניים.
הסיר את הקרקפת משני צדי החתך הראשון כדי לחשוף כחמישה מילימטרים מהגולגולת שמתחתיה. לאחר מכן, זהה את נקודות הציון האנטומיות של פני השטח של הגולגולת. בשלב הבא, זהה והרם את הפריאוסטום (קרום העצם) על ידי הזרקת תמיסת 2%lidocaine עם epinephrine.
לאחר מכן, נתק את הפריאוסטיום (periosteum) מפני השגוללה באמצעות מכשיר חד. לאחר מכן, השתמש במקדח TR refine בקוטר 2.7 מילימטר כדי להחליש לשונית עצם מעגלית בקוטר 2.7 מילימטר בחצי הכדור הימני של הגולגולת, במרחק שווה מ-Lambda ומ-bgma. אין לחרוץ את העצם עם המקדח כדי להגן על הדורה (dura) והרקמות שמתחתיה.
כעת, הסר את מקריון העצם המוחלש באמצעות הדיסקציה, פינצטה וקוצב שיניים בכוח מכוון אך נשלט. לאחר מכן, טען מזרק Hamilton בכיול 30 gauge עם 10 µL של תרחיף תאים והנח את המחט על המסגרת הסטריאוטקטית. לאחר מכן, הנח את העכבר על המסגרת הסטריאוטקטית.
יישרו את המחט למרכז החלון שנוצר, לאחר מכן הורידו את המחט עד שתיגע בפני השטח של הקורטקס. לאחר מכן, אפסו את הקואורדינטות הדיגיטליות. כעת הורידו את המחט ל-3.2 millimeters לתוך רקמת הקורטקס.
לאחר מכן, נסוגו ב-0.2 מילימטרים והזריקו בעומק של שלושה מילימטרים. את ההזרקה בעומק יש לבצע בקצב של 10 µL לדקה. עם השלמת ההזרקה, השאירו את המחט במקומה למשך דקה אחת לפני נסיגתה באיטיות.
לאחר מכן, הוצא את העכבר מהמסגרת. בהמשך, שמור על פני השטח של המוח הידרטריים, באמצעות טיפות של PBS סטרילי.
הנח זכוכית כיסוי בעובי שלושה מילימטרים על פני השטח של המוח כדי לאטום את החלון שרוחבו 2.7 מילימטרים. לאחר מכן, ייבש את עצם הגולגולת שמסביב. בשלב הבא, מרח vet bond כדי להדביק את רקמת הקרקפת לעצם הגולגולת ולקיבוע זכוכית הכיסוי במקומה.
אין למרוח כמות רבה מדי, שכן היא תדלף תחת הזכוכית ותפחית את פוטנציאל הדימות. לאחר מכן, ערבבו את אבקת האקריליק הדנטלי והתמיסון הטרי בתוך המנדף, ומריחו את התערובת מעל ה-vet bond באמצעות מחט במידה 22 gauge. כדי להבטיח איטום הדוק, מרחו את האקריליק כך שיחפוף מעט את קצה כיסוי הזכוכית, אך לא כך שיכסה את כיסוי הזכוכית עצמו.
בשלב זה, מקם עכבר מורדם במקבע ראש ייעודי בתוך מקרין סטריאוטקטי XAD 2 25 שתוכנן במעבדה. בצע סריקת CT בטכניקת cone beam של 360 מעלות, כאשר צינור ה-x-ray פועל ב-40 peak kilo voltage ו-0.05 milliamps דרך מסנן אלומיניום בעובי שני מילימטרים. השתמש בתמונה כדי למקם את הבמה כך שמרכז הקרינה (ISO center) יופנה אל ההמיספירה הימנית ויהיה מרכזי בכיוון הדורסו-ונטרלי.
קיימים מגוון רחב של קולימטורים להכוונת הקרינה, דבר המדגים את יכולת ההתאמה של המודל. במקרה זה, אנו משתמשים בקולימטור של 8 mm על 11 mm עבור הקרה המיספרית. הכניסו את הקולימטור ההמיספרי למכשיר ההקרה הסטריאוטקטי X RAD 2 25.
השג תמונות CT אורתוגונליות בודדות הן מלמעלה והן מלמטה דרך הקולמטור כדי להבטיח מיקום נכון של הראש, על ידי איתור המבנים העצמיים האנטומיים וכיוון ידני עדין של מיקום הבמה על גבי המסך. החלף את המסנן האלומיניום של ה-XAD 2 25 IRRADIATOR במסנן טיפול מנחושת בעובי 0.93 millimeter. לאחר מכן, הפעל את תוכנית שפופרת ה-x-ray במתח שיאה של 225 peak illa voltage וזרם של 13 milliamps, ומסור מחצית ממנת הקרינה מלמעלה בכיוון AP.
החזירו את המסילה למצב הנמוך והנחילו את מחצית המנה השנייה של קרינת הרדיאציה מהחלק התחתון בכיוון PA. בהליך זה, הרדימו את העכבר עם החלון התוך-גולגולתי שנוצר קודם לכן ונקו את החלון באמצעות תרסיס אלכוהול. הגדירו את הערוצים במיקרוסקופ הקונפוקלי בהתאם לפלואורוכרומים השולבו בעכבר הכימרי שנוצר.
לחלופין, ניתן להשתמש שוב בהגדרות קודמות כדי להפחית את השונות בין מפגשי הדימות. במקרה זה, הזרק את כל התיוגים הנדרשים לדימות לווריד הזנב הלטרלי, לדוגמה dextran עבור כלי הדם. הפוך את העכבר אל תוך מחזיק הראש שנבנה במיוחד, תוך תמיכה באמצעות פלסטילינה גמישה, והבטח שהראש ניצב ללייזר; הנח את המחזיק בצורה שטוחה על במה המיקרוסקופ הניידת.
הפעילו את הלייזר בערוץ הראשון ומקמו אותו במרכז החלון התוך-גולגולתי על ידי התבוננות ישירה בנקודת השילוב של קרן הלייזר על חלון התא. צלמו תמונה של כל ערוץ עבור החלון כולו באמצעות עדשה של 5x, והשתמשו בה כmap עבור תמונות אחרות ברזולוציה גבוהה יותר עם עדשות ארוכות טווח של 10x ו-20x. סכימה זו מדגישה את השגיאות הטכניות הקשורות לתהליך הכירורגי ומדגימה את ההשפעה שתהיה לכל אחת מהן על התמונות שיו produced.
אוויר שנלכד תחת החלון ייראה כבועות בתמונות. הצטברות של אקריליקה על הזכוכית היא אוטופלורסצנטית בערוץ האדום הרחוק ותחסום חלק משדה הראייה. באופן דומה, לכלוך על החלון במהלך ההדמיה יופיע כנצנוץ אוטופלורסצנטי בתמונות.
אפילו חלון תוך-גולגולתי מושלם עלול להיתקל בבעיות ברגע שהוא נמצא תחת המיקרוסקופ. ארטיפקטים של נשימה גורמים לתמונות עם פסים, בעוד שמיקום לקוי של העכבר על המסגרת גורם לתמונה מקוטעת. מכיוון שהלייזר חוצה רק חלק מהרקמה, באמצעות עיבוד תמונה לאחר הצילום ניתן להוסיף ערוץ נוסף לתאים המסומנים ב-CFP, כך שניתן להפחית את תמונות ה-GFP מתמונות ה-CFP כדי לחשוף את אות ה-CFP האמיתי.
בנוסף, באמצעות שימוש במאפיין האוטופלורסצנציה של יצירת הרמוניה שנייה (SHG) של סיבי קולגן ארבעה, אנו יכולים לדמות את קרומי הבסיס של מערכת כלי הדם. הזמינות של חמישה ערוצים פלואורסצנטיים מאפשרת למשתמש גמישות רבה ויכולת התאמה של מודל השקיפות החדש המתואר במאמר זה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את המוצרים המסוכנים שנעשה בהם שימוש במהלך הפרוצדורות הכירורגיות.
כמו כן, חיוני להיות דקדקני ולהקדיש תשומת לב מיוחדת לפרטים כדי להבטיח שרקמת המוח תישאר ללא נזק לאורך כל תהליך הדימות ארוך הטווח. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים עכבר כימרי בעל תאי אב פלורסצנטיים, ובכך תוכלו ללכוד תמונות בזמן אמת ברזולוציה גבוהה של כלי הדם התוך-גולגולתיים בעקבות השתלת תאי גידול, עם או ללא התערבות טיפולית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה חדשנית לדימות in vivo המשלבת עכברים כימריים פלואורסצנטיים עם מיקרוסקופיית 2-פוטונים ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת תצפית על שינויים דינמיים ברקמת המוח ובמיקרו-כלי הדם ברמה של תא בודד, במיוחד בעקבות פגיעות פתולוגיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- ביולוגיה של התא
רקע
- המחקר מתמקד בתאי פרוגניטור ממח העצם ובגיוסם לכלי הדם במוח.
- שיטות קיימות, כגון היסטופתולוגיה, מגבילות את היכולת לצפות בתהליכים דינמיים in vivo.
- הבנת נאו-וסקולריזציה (יצירת כלי דם חדשים) תוך-גולגולתית היא קריטית להשגת תובנות לגבי מחלות מוח שונות.
- ניתן להתאים טכניקה זו למחקר של מצבים אחרים, כגון איסכמיה וגרורות של גידולים.
מטרת המחקר
- פיתוח מתודולוגיה לדימוי דינמיקה של תאים בודדים במוח.
- חקירת מנגנוני הווסקולריזציה בגידולי מוח.
- אספקת פלטפורמה להערכת הובלה והפצה של תרופות במוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי אב פלואורסצנטיים ממח העצם של עכברי תורם.
- הזרקת תאים אלו לעכברי מקבל שהוקרנו.
- יצירת קסנוגרפטים תוך-גולגולתיים בעכברים כימריים באמצעות תא חלון גולגולתי.
- דימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דו-פוטוני ללכידת שינויים דינמיים.
תוצאות עיקריות
- טכניקת הדימות הדמימה בהצלחה את גיוס תאי פרוגניטור לכלי הדם במוח.
- שינויים דינמיים במיקרווסקולטורה נצפו בעקבות משטרי טיפול.
- התקבלו תובנות לגבי מנגנוני הניאווסקולריזציה תוך-גולגולתית.
- השיטה הדגימה יכולת התאמה למודלים שונים של מחלות מוח.
מסקנות
- טכניקת דימות חדשנית זו משפרת את ההבנה של הדינמיקה הווסקולרית במוח.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר הולכת ותפוצת תרופות במוח.
- ניתן ליישם את המתודולוגיה על מגוון של מצבים נוירולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו מאפשרת דימוי בזמן אמת ברזולוציה של תא בודד של דינמיקה וסקולרית תוך-גולגולית, ובכך מספקת תובנות מכניסטיות לגבי אנגיוגנזה של גידולים ותגובה טיפולית שאינה ניתנת ללכידה על ידי היסטולוגיה סטטית. באמצעות ויזואליזציה של גיוס תאי פרוגניטור ושינויים במיקרו-סביבה in vivo, היא תומכת בתיקוף מטרות ומקטינה סיכונים במודלים פרה-קליניים של התקדמות גרורות וגידולי מוח. יכולת ההסתגלות של הפלטפורמה למחקרי הקרנה ולפלואורסצנציה רב-ערוצית מגבירה את תועלתה בתהליכי גילוי תרופות בנוירו-אונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר גיוס תאי פרוגניטור ממח העצם לכלי הדם של הגידול לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות באנגיוגנזה באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות בין תאים ועל עיצוב מחדש של כלי הדם (vascular remodeling).
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת שינויים דינמיים במיקרו-סביבה המשפיעים על צמיחת הגידול ועל יעילות הטיפול.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של צפיפות כלי דם, חדירות ואינטגרציה תאית באמצעות רהפורטרים פלואורסצנטיים וצבעים אינטרה-ויטליים.
- יכולת הרחבה: תואם לדימיון רב-ערוצי (עד חמישה אותות פלואורסצנטיים), המאפשר הערכה מקבילה של דינמיקה של גידול, סטרומה ותאי מערכת החיסון.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: הכנה סטנדרטית של חלון גולגולת מאפשרת סשנים של דימיון לאורכי, מה שמפחית שונות ותומך במחקרים פרמקו-דינמיים לאורכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה נאו-וסקולריזציה תוך-גולגולתית ב глиאומה, ומספק מערכת רלוונטית קלינית לחקר דינמיקת מחסום הדם-מוח והחדרת תרופות.
- המשכיות טרנסלציונלית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניטור ארוך-טווח של השפעות טיפוליות על נורמליזציה של כלי דם ופרפוזיה.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות כימות התגובה הווסקולרית להקרנה או לתרכובות אנטי-אנזיוגניות בזמן אמת.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, במיוחד בנוירו-אונקולוגיה ובפיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS), על ידי אספקת ביומרקרים דינמיים של תגובה כלי דמית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולים אנגיוגניים ואינטראקציות בין הסטרומה לגידול באמצעות דימוי אורך (longitudinal imaging) של אוכלוסיות תאים המסומנות פלואורסצנטית.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הכנה ניתנת לשחזור של חלון גולגולתיים ופרמטרי דימוי דו-פוטוני עקביים בין הקבוצות הניסוייות.
- אנליטיקה: מספק משתנים תלויים כמותיים כגון אורך כלי דם, נקודות פיצול ושיעורי חדירה תאית, ובכך מקל על ניתוח השוואתי של תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: תואם לפיתוח ביומרקרים על ידי מתאם בין מדדים וסקולריים המופקים מדימוי לבין נקודות קצה היסטולוגיות ותוצאות טיפוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוי רב-שימוש עבור מספר מודלים של מחלות, כולל איסכמיה וגרורות, ובכך ממקסם את ההשקעה בתשתיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באסטרטגיות למיקוד בכלי דם על ידי אספקת ראיות דינמיות וישירות לגיוס תאים ולשינויים בסביבה המיקרוסקופית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח ולדימות, ובכך ממזער שונות טכנית בין אתרים ומחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של מודולטורים וסקולריים לא יעילים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות פעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על בסיס נתוני תגובה וסקולרית בזמן אמת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, השתלת חלון גולגולתי ותפעול של מיקרוסקופ דו-פוטוני.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מסגרות סטריאוטקטיות, מיקרו-מקרינים ומיקרוסקופים סורקים עם לייזר כַּוֵּינָן.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין קבוצות הניתוח, הדימוי וניתוח הנתונים כדי להבטיח איכות נתונים עקבית.
- התאמה למערכות מודלים שונות דורשת אופטימיזציה של גודל החלון, עומק הדימוי ואסטרטגיות של סימון פלואורסצנטי.
- מגבלות מעשיות כוללות עומק דימוי המוגבל ל-~900 µm מפני השטח של הקורטקס, דבר המגביל את הגישה למבני מוח ונטרליים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
3:34
Intracranial Window Generation
6:50
Stereotactic Radiation
9:53
Results: Potential Problems Encountered with this Novel High-resolution In vivo Imaging Technique and the Potential Uses of the Model
11:25
Conclusion
2:14
Bone Marrow Reconstitution
8:39
In vivo Two Photon Laser Microscopy
