ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור כיצד אינטראקציות טרנס-תאיות הכוללות את התחומים החוץ-תאיים של חלבונים טרנסממברניים ספציפיים משפיעות על תפקוד תאי הבטא וליתר דיוק על הפרשת אינסולין. זה מושג על ידי טרנסקציה ראשונה, קו תאים של יונקים עם פלסמיד המכיל את החלבון המעניין בשלב השני. קו תאי בטא הוא תרבית משותפת עם תאי היונקים.

בשלב האחרון, התרבות המשותפת מודגרת במדיה עם ריכוזי גלוקוז שונים על מנת לאפשר הערכה של הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז. בסופו של דבר, בדיקות אינסולין רדיו אימונולוגיות או Eliza משמשות להערכת רמות האינסולין המופרשות לתקשורת על ידי תאי הבטא המתורבתים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי יתר של גנים ונוקדאון, הוא שהיא מונעת הפרעה של ה-mRNA וביטוי החלבון שעלולה להשפיע על בריאות תאי הבטא או תפקודם בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של האינטראקציה הספציפית של החלבון.

התחל בהעברת תאי HEC 2 93 לצלחת של 24 בארות ב-0.5 מיליליטר של מדיה HEC 2 93 לבאר כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה על פני תחתית הצלחת. נענע את הצלחת לאורך ציר אחד בכל פעם במהירות סינכרונית לגל שנוצר בבאר. כאשר תאי HEC 2 93 מגיעים לשטף של 100%, העבירו את התרבויות עם 0.8 מיקרוגרם של קידוד הפלסמיד לחלבון המעניין בשני מיקרוליטרים של lipo 2000.

על פי פרוטוקול הליפו, התוכנית הכוללת של התרבות המשותפת שעומדת להיות מודגמת מתוארת כאן באמצעות מסיר תאים לא אנזימטי. התחל שלב זה על ידי קצירת תאי INS אחד בכ-70 עד 80% שטף מתחתית בקבוק תרבית T 75. לאחר סיבוב התאים במשך שלוש דקות ב-150 גרם בטמפרטורת החדר, השתמש בפיפטה P 1000 כדי להשעות את הגלולה במיליליטר אחד של חצי INS וחצי.

לאחר מכן הוא משתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להוסיף עוד 24 מיליליטר של מדיה מעורבת ולהחיות את התאים לשאוב את המדיה מהבארות של צלחת 24 הבאר המכילה את תאי HEC 2 9 3. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P 1000, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של תרחיף תא אחד של INS על שכבת תאי המשושה לאורך דפנות הבאר. לאחר כל שש בארות, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להשעות מחדש את התא האחד של INS.

שוב כדי להבטיח השעיית תאים הומוגנית. כעת דגרו על התאים למשך 24 עד 48 שעות, תלוי בפרוטוקול הניסוי. לאחר שהתאים דגרו לתקופת הניסוי הרצויה, באר אחת בכל פעם, שאפו את מדיום התרבות המשותפת ביד אחת והחליפו מיד את המדיה ב-250 מיקרוליטר של גלוקוז 2.5 מילי-מולרי במאגר קרבס רינגר ביקרבונט ביד השנייה.

לאחר דגירה מוקדמת של תרביות הקו למשך שעה, החלף את מאגר ה-KRB הנמוך של הגלוקוז ב-250 מיקרוליטר של גלוקוז של 2.5 מילי-מולרי או 20 מילי-מולרי. לאחר שעה נוספת של דגירה, העבירו את מאגר ה-KRB לצינורות מיקרו-פוגה וסובבו את המאגר למשך חמש דקות ב-1500 Gs וארבע מעלות צלזיוס בזמן שהצינורות נמצאים בצנטריפוגה. הוסף מיד 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאי rippa עם מעכבי פרוטאז לצלחת ודגר את הצלחת למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

כאשר הצינורות סיימו להסתובב, הסר 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט לניתוח מאוחר יותר על ידי בדיקת אינסולין רדיו אימונולוגית או אלייזה. לבסוף, סובב את מה שעכשיו הוא ליזאט תאים למשך 15 דקות ב-10,000 גרם ואז הסר 50 מיקרוליטר של SNAT לניתוח על ידי בדיקת אינסולין רדיו אימונולוגית או אלייזה. כאן, מוצגות התוצאות שהתקבלו מתאי בטא INS 1 עם HC 2 93 תאי טרנספטציה כדי לבטא איזופורם נוירו-ליגן המכונה כאן NLX.

הביטוי של NLX הגביר את הפרשת האינסולין הבסיסית ועורר את הפרשת האינסולין על ידי תאי I NS one בתרבית משותפת. התחום החוץ-תאי של NX חייב להיות באינטראקציה עם חלבון או מולקולה אחרים על פני התא I NS אחד כדי לגרום לתאי INS אחד להפריש יותר אינסולין. התוצאות מסוגים אחרים של ניתוחים המשתמשים במערכת התרבות המשותפת מתוארות בשני הגרפים הבאים.

בגרף ראשון זה, מוצגת העלייה בתכולת האינסולין של תאי INS one בתרבית משותפת על ידי NLY. ואילו בניסוי זה, RNA נקצר משכבת התא ונותח על ידי R-T-Q-P-C-R. התרבות המשותפת עם NLY העלתה את רמות האינסולין וה-PDX 1 mRNA.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון QPCR או אימונוהיסטוכימיה כמותית כדי לענות על שאלות נוספות כמו האם אינטראקציות חוץ-תאיות של החלבון הטרנספקט יכולות לגרום לשינויים במבנה התא או בביטוי הגנים.