פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא היא לאפשר חקירה בקנה מידה גנומי של תפקוד הגנים על ידי ניטור בו זמנית של קריאות תאיות מרובות. בהדגמה זו, מדווחים מבוססי Firefly RAN ו-Cipro Dina Luciferase משמשים לניטור פעילות מסלול P 53 WINT ו-KRAS בהתאמה. שלושת המדווחים הללו הם cot transected עם irna המכוון לגן מעניין ל-HCT אחד 16 תאים, קו תאים של סרטן המעי הגס.

לאחר מכן, נמדדות פעילויות של גחלילית ווניל לוציפראז בליזאטים של התאים בזמן פעילות של Cipro DEA luciferase. אנזים מופרש נמדד בתרבית. מתקבלות תוצאות בינוניות המראות את יכולת השחזור של מערכת הבדיקה כמו גם את היכולת לחשוף פעולות משותפות וייחודיות של גנים בתוך שלושת המסלולים הרלוונטיים לסרטן הללו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרו-ריי או פריס רב צבעוני, שזו דרך משתלמת, אוניברסלית וחסכונית להסתכל על תפוקות התא של התמלול. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בחקר הסרטן כגון פיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות מולקולרית. למרות שפרוטוקול הטרנספקט החולף שלנו מאמץ IL ומחויבות זמן מינימלית מראש להגדרת המסך, סביר להניח שהוא יגדל היטב לשונות האות באר, שניתן להתמודד איתה על ידי התבוננות ביחסי הדיווח במקום להסתכל על כשלים מוחלטים מהבארות כדי להתחיל בהליך זה, שטפו חמש צלחות בגודל 10 סנטימטר מרובעות של 80 עד 90% HCT אחד 16 תאים עם PBS ואז קצרו תאים על ידי טריפסין עבור כל צלחת.

השתמש במיליליטר אחד של תמיסת טריפסין ואחריו נטרול עם 10 מיליליטר DMEM המכיל 2% FBS ו-1% פניצילין. סטרפטומיצין מעביר תאים תלויים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בכ-130 גרם למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר מדיה.

ספור את מספר התא עם מונה תאים ולאחר מכן צור תמיסת תאים עם 10 עד חמישי תאים למיליליטר. שמור 150 מיליליטר של מתלה תאים לשלב הבא באמצעות צלחת מתקן נוזלים אוטומטית מרובת טיפות. 100 מיקרוליטר או 10 לתאים הרביעיים בכל באר של צלחת תרבית של 96 בארות.

מתלה התא במקרה זה אמור להספיק לציפוי 1296. ובכן צלחות דוגרות על הצלחות עם תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה עם 5% פחמן דו חמצני בזמן הכנת תערובת הטרנספקציה. ה-DNA של מבנה המדווח האיכותי המשמש כאן בודד באמצעות ערכות הכנה סטנדרטיות של MIDI ודולל לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.

עבור כל מדווח, הכינו 100 מיקרוליטר של פתרון מלאי בניית מדווח על ידי שילוב של 30 מיקרוליטר הבאים של P 53, FL 30 מיקרוליטר של שמונה X-T-C-F-R-L 30 מיקרוליטר של איילים אחד G ארבעה שישה מיקרוליטר של U-A-S-C-L וארבעה מיקרוליטר של H שניים OH. זה יביא לתערובת DNA עם יחס סופי של אחד לאחד לאחד ל-0.2 של המדווחים וריכוז DNA סופי של 0.3 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, הכינו תערובות טרנספקציה I-R-N-A-D-N-A המספיקות למעבר 1296.

לוחות באר מדללים 80 מיקרוליטר של המדווח בונים תמיסת מלאי בשמונה מיליליטר של מאגר EC מערכת ההשפעה QIAGEN כדי לקבל תמיסת DNA בריכוז סופי של שלושה מיקרוגרם לצלחת מיליליטר. 20 מיקרוליטר של תמיסת ה-DNA לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות. מספר 96 לוחות הבאר יהיה תלוי בכמה בריכות אירנה יש לבדוק.

לדוגמה, במקרה זה, נצטרך 4 צלחות באר 96 כדי להעריך. 384 בריכות שונות של Sir A המשתמשות במטפל נוזלים אוטומטי של ביום מעבירות שני מיקרוליטר מכל חמישה siRNA מיקרומולרי לבאר המתאימה של לוחית ה-PCR המכילה את מלאי ה-DNA המדולל. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת משפר לכל באר של צלחת ה-DNA siRNA.

אפשר לתגובת המשפר להתרחש בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה משפיע לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות. כדי לעצור היווצרות קומפלקס טרנספקציה, הוסף 10 מיקרוליטר של DMEM המכיל 2% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין לכל באר של לוחית ה-PCR.

אחזר את 1296 לוחות הבאר המכילים HCT אחד 16 תאים מהחממה. העבירו 10 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה לכל באר של צלחת 96 בארות המכילה את התאים מכיוון שכל טרנספקציה תבוצע בשלוש עותקים. אותה תערובת תוחל על שתי צלחות נוספות של 96 בארות המכילות תאים.

דגרו את התאים עם תערובות טרנספקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה עם 5% פחמן דו חמצני למשך 36 שעות. 36 שעות לאחר העברת תאים. פעילויות לוציפראז מוכנות למדידה.

מכיוון שמחקר זה משלב מספר מדווחים, אחד מופרש למדיום התרבית ושניים אחרים מתבטאים בציטופלזמה של התא. מדידות יתקבלו הן ממדיום התרבית והן מליזאט תאי כדי לזהות פעילות Cipro Dina luciferase או CL בתרבית. צלחת העתק בינונית.

20 מיקרוליטר של מדיום תרבית לצלחת לבנה אטומה 96 באר. באמצעות הטיפה המרובה הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר בדיקת CL לכל באר. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של Cipro Dina Lucifer ומצע לכל באר וזהה פעילות CL באמצעות לומינומטר לזיהוי פעילויות לוציפראז גחליליות ווניל, תחילה יש לבצע ליזטים של תאים.

הסר את מדיום התרבות מהתאים על ידי הפיכת כל צלחת והשלכת המדיום לכיור. הסר את המדיום שנותר על ידי הקשה עדינה על הצלחת ההפוכה על מגבות נייר. הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר ליזה פסיבי אחד לכל באר תאים.

הניחו את הצלחות על נדנדת פלטפורמה במהירות בינונית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, הוסף 20 מיקרוליטר של מגיב בדיקת לוציפראז לכל באר תאים ומיד מדוד את פעילות לוציפראז הגחלילית באמצעות הלומינומטר. לאחר מכן, הוסף מגיב עצירה וזוהר כדי להרוות את פעילות לוציפראז הגחלילית ולאחר מכן למדוד את פעילות הלוציפראז.

לפני הריבוב הוערכה החוסן של שלוש פלטפורמות הסינון השונות בנפרד. קווי תאי סרטן המעי הגס שצוינו הועברו עם שמונה XTCF PP 53 ta Luke או ALK אחד מבני דיווח מקודדים של Firefly Luciferase יחד עם מאגרים של siRNAs המכוונים ל-WINT beta-Catenin P 53 או KAS בהתאמה. מצוינים גנוטיפים רלוונטיים למסלול עבור כל קו תאים.

החוזק של כל פלטפורמת סינון הוערך על ידי יכולת השחזור של ההשפעות המושרות הללו על מסלול העברת האותות הרלוונטי. כפי שמוצג בתוצאות מייצגות אלה, לבטאין ול-siRNAs אין השפעה על פעילות שמונה מדווח XTCF בתאי RKO. בניגוד ל-DLD אחד ו-HCT אחד 16 תאים, אשר חסרים בהתאמה במסלול A PC, חלבון מדכא ומבטאים צורה מופעלת של בקה טנין.

לאחר מכן, הוכח כי ניתן להשתמש במדווחים אלה יחד למדידות סימולטניות של פעילות הגנים של מסלולי העברת אותות בטא-קטנין P 53 ו-KRAS באמצעות מאגרי ה-IRNA המצוינים בגרפים אלה. פעילויות לוציפראז יחסיות מוצגות על ציר ה-Y ו-siRNAs המכוונים לגן המצוין המעניין מוצגים על ציר ה-X. לדוגמה, מאגר siRNA המכוון לבטא-קטנין מפחית את פעילות מסלול בטא-קטנין ברוח, אך אינו משפיע באופן משמעותי על מסלולי P 53 ו-KRA S.

בעת ניסיון לפתח מערכת מדווח מרובה, חשוב לייעל את קו התאים המעניין עבור אזור הטרנספקציה וכוונת האות המדווח.