Name: בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים Thaliana ארבידופסיס זרעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למדו שיטה יעילה לבידוד עוברים מוקדמים מזרעי Arabidopsis thaliana לצורך ניתוח תמסומים ואפיגנומים. השיטה מאפשרת בידוד של עד 40 עוברים תוך 1-4 שעות ליישומים מולקולריים וציטולוגיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לטל Nawy ומרטין באייר לעצתם בבידוד עובר. MTR, VG, UG וCB פיתחו ציוד בידוד העובר. MTR, VG ו CB פיתחה פרוטוקול בידוד העובר. MTR, VG ו CB הקים את הפרוטוקול, בודד את העוברים, ועובר שנוצר cDNA, VG ביצע PCR, MTR מכתים גאס, ג&#39;יי ג&#39;יי ניסויי הדגים. MTR, VG, CG וUG כתבו את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת ציריך, אחוות קרן מחקר רוש (לMTR), ומענקים מהקרן הלאומית שוויצרי (לUG וCB).

ההליך מסוכם בתרשים הזרימה שמוצגת באיור 1. Microcapillaries והתקנת אינסטרומנטלי מוצגים באיור 2 ואיור 3, וצעדים אופייניים של בידוד עובר מוצגים באיור 4. 1. חומר והכנת המאגר 1.1 ציפוי הסיליקון של זכוכית microcapillaries <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את microcapillaries בצינור פלקון 15 מ&quot;ל עם ~ 5 מ&quot;ל של Sigmacote (סיגמא) ולהפוך כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון, במקום צינור פלקון המכיל את נימי הדם ברדיד אלומיניום ואופה אותם ל3 שעות ב 60 ° C. לאחסן בטמפרטורת חדר. </li></ol> השיגו 1.2 ~ 50-100 טיפים microcapillary מיקרומטר בקוטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך 1 מ&quot;מ בקוטר זכוכית נימים באופן ידני מעל מבער בונזן או באמצעות חולץ מסחרי (אנכי נימה חולץ או micropipette חולץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביהלומיםעט קצה להב או לחתוך את הקצה של הנימים משכו כדי ליצור את הפתיחה הרצויה. בחר את נימי הדם בצורת הטובה ביותר תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפתיחה צריכה להיות 50-100 מיקרומטר (איור 2). </li></ol> הכנת מצגת 1.3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבי סיליקון שקופיות נקיות על ידי כיסוי כל הבארות עם Sigmacote (~ מיליליטר שקופית 1 /) במשך 5 דקות, להסיר. שעות 3 אופים ברדיד אלומיניום. לאחסן בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שקופיות הזכוכית המיקרוסקופיות רב גם למשך 10 דקות ב10% SDS, דקות 2 X 2 במי nuclease (autoclaved DEPC שDDH 2 O), 2 דק &#39;ב 70% אתנול, 2 דקות ב 100% אתנול, אוויר ייבוש. כל הצעדים נעשים בצנצנות Coplin autoclaved. שקופיות יכולות להיות שימוש חוזרת מספר פעמים מתן ניקוי יסודי בין כל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני התפשטות בידוד עובר ~ 0.5 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) עם טפטפת על כל פני השטח של כל טוב והאוויר יבש. </li></ol> 1.4 מיקרוסקופ והתקנת נימים &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ הפוכה עם 10x ומטרה בהגדלה 20x. לייעל את ניגוד האור (עוברים הם די שקופים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח micromanipulator להחזיק נימי הזכוכית לצד מיקרוסקופ. נימי הזכוכית הוא מחוברת לmicroinjector (איור 3 א) או P-200 פיפטה רגילה דרך צינור גומי (איור 3, ראה דיון לתיאור מפורט של התקנה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנימים מעל שקופית מיקרוסקופ ב~ 70 ° זווית (איור 3), ולהתאים את המיקום ליש הפתח בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני בידוד עובר תופס ולשחרר ~ 5-10 μl BSA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) למעייל הנימים. </li></ol> 1.5 חוצצים טבלה 1 מפרטת את מאגרי הבידוד ויעד בהתאם ליישומים במורד הזרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ~ בידוד חיץ 1 מ&quot;ל לדגימה טרי לפני שימוש ולשמור אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ היעד בצינור נמוך מחייב מיליליטר אפנדורף 0.5 על קרח (יישומים מולקולריים) או בשקופית מיקרוסקופ (יישומי ציטולוגיה) בתא לח. </li></ol> 2. Dissection הזרע וחילוץ העובר 2.1 סנכרון של פיתוח זרעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> לסרס פרחים ולשמור אותם 2 ימים בחדר הצמיחה תוך הימנעות ממגע של עליים שנחשפו עם פרחים אחרים, ולאחר מכן האביק אותם (למשל 11). </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השלב של התפתחות בתנאי הצמיחה שלך על ידי חקירה מיקרוסקופית של זרעים מנוקים. עם תנאי הגידול שלנו (אור 16 שעות ב21 מעלות צלזיוס, 8 שעות חשכה על 18 מעלות צלזיוס ו -70% לחות) זרעים נאספו 2.5 ימים לאחר האבקה (DAP) הניבו בעיקר 2-4 עוברים סלולריים וזרעים נאספים 3.5-4 DAP הניב כדורי עוברים. </li></ol> Dissection זרע 2.2 ושבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את יםeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) תחת stereomicroscope עם מלקחיים ומחטים לאינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הזרעים ב20 חיץ בידוד μl בצינור הונח על קרח מ&quot;ל מסביב לתחתית אפנדורף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למחוץ את הזרעים עם העלי פלסטיק (טרום לנקות עם 10% SDS, שטף עם DEPC שDDH 2 O ונשטף עם אתנול 70%) כדי לשחרר את העוברים עד תמצית הזרעים היא חלקית. כוח ליישם הוא שייקבע על ידי כל משתמש על פי דין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העלי עם 300 μl של חיץ בידוד כדי לשטוף את העלי ולדלל את הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התמצית ב 5000 XG במשך 5 שניות. בעדינות resuspend תמצית pelleted על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התמצית עם רשת ניילון 30 מיקרומטר (רכוב על מתאמי צינור, למשל, על פי PartecCelltricks). יש לשטוף את הרשת עם חיץ בידוד μl 200 נוסף. </li></ol> 3. בידוד עובר הכנת מצגת 3.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; מקום שקופית רב גם נקי, BSA מצופה וsiliconized על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה, resuspend תמצית הזרעים המסוננים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה ופיפטה 2 טיפות של תמצית 40-50 μl זרע לתוך בארות 1 או 2 . הקרנה רק 1 או 2 טיפות בכל פעם מונעת אידוי של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום μl 50 של חיץ בידוד טרי (1 טיפת st לשטוף) בבאר של שקופית אחרת מוכנה כמו בעבר. שמור את השקופית הזו בתא מכוסה ולח על מנת למנוע אידוי. </li></ol> 3.2 מסך, לנקות, לאסוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך טיפות של תמצית זרעים לעוברים בשלב הרצוי עם המטרה בהגדלה 10x. במידת צורך, לאשר את הבמה עם הגדלת 20x. את העוברים לרוב לשקוע בתחתית של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר באופן ידני פסולת סביב העובר עם מחט טונגסטן, מחט אינסולין או ציוד דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את נימי הזכוכית ליד העובר באמצעות micromanipulator, לאהאייק את העובר עם כפתרון קטן ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כמה עוברים (למשל כל טיפה אחת) ולשחרר אותם בטיפה לשטוף -1 (יישום מולקולרי) או במאגר היעד (יישומי ציטולוגיה). כל סיבוב איסוף צריך להיות כל הזמן בתוך דקות ועובר 5-10 צריכים להיות שנאסף בנפח מינימאלי (הנפח הכולל של כל סבבי האיסוף צריך להיות &lt;5 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ההקרנה והגבייה עד לכמות הרצויה של עוברים שנאספה בירידת 1 st לשטוף (מרכזי, אם אפשר, כדי להקל על זכירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוכר את כל העוברים בבת אחת מהירידה לשטוף (אם הפסולת מתבצעת מעל, להסיר אותם עם מחט לפני הזיכרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים לירידה לשטוף 2 nd של 50 μl. חזור על 3.2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים במאגר היעד. ההעברה צריכה להיות כרוכה רק קשר, ולא טבילה, של קצה הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את microcapilלארי למדגם הבא. </li></ol>

<ol><li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li>
<li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li>
<li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li>
<li>NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://estdb.biology.ucla.edu/seed/">http://estdb.biology.ucla.edu/seed/</a> (2006).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li>
<li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li>
<li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar%2C+parental-dosage-dependent+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li>
<li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li>
<li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li>
<li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).</li>
<li>SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics">http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics</a> (2010).</li>
<li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li>
<li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li>
<li>Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf">http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf</a> (2007).</li>
<li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li>
<li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fusions%3A+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li>
<li>Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), In Press (1111).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פיתחנו פרוטוקול בידוד עובר שהוא מהיר, יעיל, וניתן להעביר בקלות למעבדות אחרות. הציוד המתואר כאן מורכב ממיקרוסקופ ההפוך, micromanipulator, זכוכית microcapillaries, חולץ נימה אנכי וmicroinjector (איור 3 א). ההתקנה דומה לזה שתואר לבידוד תא בעלי חיים יחיד לניתוחי transcriptomics 17. כמו כן, אנו עובדים בהצלחה עם התקנה בסיסית יותר שבו זכוכית microcapillaries נמתחו באופן ידני על אש (ולחתוך עם ...

העובר של צמחים פורחים מוקף האנדוספרם, רקמה תזונתית הנגזרת מאירוע הפריה שנייה. גם העובר והאנדוספרם מוקפים בכמה שכבות תאים של קליפת הזרע. ביחד רקמות אלה יוצרים זרעים, אשר יפתחו בתוך הפרי. לפיכך, רקמות וניתוחים ספציפיים של תאי עוברי ארבידופסיס לקויים בשל חוסר הנגישות שלהם בחום. עם זאת, עובר בשלבים מאוחר הכדוריים או במאוחר הם טוב יחסית נוחים לנתיחה ידנית על ידי שימוש במחטים עדינות תחת טונגסטן סטראו, או על ידי הפעלת לחץ קל על הזרע באמצעות מלקחיים כדי לחלץ אותם. טכניקות כאלה היו בשימוש בהצלחה לtranscriptome או ניתוחי אפיון epigenome כמו הכלאה microarray, רצף bisulfite, או RNA רצף (לדוגמה, 1-3). לעומת זאת, המחקרים של עוברים בשלב הזיגוטה לכדורי מוקדם יישארו מאתגרים מבחינה טכנית. נכון להיום, רק כמה מחקרים יש נציגניתוחי transcriptome orted על עוברים צעירים או באמצעות microdissection לייזר לכידה (LCM) של רקמות עוברי מסעיפי זרעים קבועים 4 או מיצוי ידני של עוברים נפרדים מתוך זרעים באמצעות כלים עדינים 5. עם זאת, ציוד LCM אינו זמין בדרך כלל והפקת מדריך לעובר בשלבים מוקדמים הוא זמן רב ודורשים מיומנויות נתיחה מצוינות כי הם לא בקלות להעברה. בנוסף לניתוחי הגנום כולו, בניתוח ביטוי גנים באתרו הם גם קשה לביצוע בעוברים של ארבידופסיס צעירים, כל ההר. במידה מסוימת, ניתן לשחרר עוברים צעירים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי לחץ עדין על הזרעים ומשמשים למבחני גן כתב או זיהוי חלבון על ידי immunostaining (לדוגמה ראה 6,7). טכניקה זו, עם זאת, אינה מאפשרת בידוד עובר תפוקה גבוהה, ובכך פוגע בניתוחים כמותיים. לכן, פיתחנו פרוטוקול יעיל ומהירלבידוד עובר מוקדם מזרעי ארבידופסיס כי הוא פשוט להתקנה, להעברה בקלות, ומתאים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם. העיקרון הבסיסי הוא לרסק את הזרעים בעדינות - גזור מsiliques צעיר בצינור Eppendorf באמצעות העלי פלסטיק בחיץ בידוד מתאים. תמצית הזרעים ממוקמת בטיפין בשקופית רב גם, והוא הוקרן בנוכחותם של עוברים שפורסמו בשלב הרצוי באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary המצורפת microinjector או פיפטה מעבדה סטנדרטית. עבור יישומים מולקולריים, עוברים נשטפים פעמיים על ידי שחרורו חזר לטיפין של חיץ בידוד חדש לפני העברתם למאגר שהיעד בנפח מינימאלי. עבור יישומי ציטולוגיה (מבחני כתב, immunostaining, דגים), ניתן להשמיט שלבי כביסה. השיטה מציעה מספר יתרונות: (i) זה מניב 25-40 עוברים ב~ 45 דקות לאפליקצית ציטולוגיהlications או בשעות 3-4 עבור יישומים מולקולריים (כולל שלבי הכביסה), (ב) שהוא מאפשר בידוד של שלבים עובריים ספציפיים, (iii) הוא בקלות להעברה לאנשים אחרים ומעבדות עקב ההתקנה הפשוטה שלה, (ד) אותה דורש ציוד במחיר סביר עבור ההתקנה הבסיסית, הניתנת לשדרוג, ו( V) זה היה בשימוש בהצלחה ליישומים שונים במורד הזרם, כגון RNA רצף 8, גן ספציפי ניתוח ה-DNA מתילציה 9, מבחני כתב (10 וRaissig et al., בהכנה.), ודגים (ג&#39;Jaenisch, ע Grossniklaus, ג Baroux לא פורסם, ראו איור 5).

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (טכנולוגיות חיים)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>מאגר גדיל ראשון</td><td>Invitrogen (טכנולוגיות חיים)</td><td>18064-022</td><td>כלול בחבילת Superscript II</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (טכנולוגיות חיים)</td><td>18064-022</td><td>כלול באריזה Superscript II</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA) 100x = 10 מ"ג/מ"ל </td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ.</td><td></td><td>ספקים שונים יעבדו גם </td></tr><tr><td>נימים דקים 1.0 מ"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind צינור 0.5 מ"ל</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 & #956; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5 בארות בקוטר 10 מ"מ שקופיות</td> אלקטרונים <td>מדעי מיקרוסקופיה</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופית</td><td>תרמו פישר</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228; סר</td></tr><tr><td>טריס</td><td>אמרסקו</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פלוקה</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>כדורי SDS</td><td>רוט</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו עלי</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין מיקרופיין</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</מיקרוסקופ חזק></td></tr>הפוך <tr><td></td><td>Nikon TMS (יפן),</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>לייץ</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Micomanipulator Post mount LH1 בדיקה Leica</td><td>microsystems</td><td>39430101</td><td>מותג אחר יעשה גם את העבודה</td></tr><tr><td>חולץ נימה אנכי</td><td>מכשיר Sutter</td><td>דגם P-20</td><td>דגם אחר מתאים גם </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט פלואורומטר</td><td>Invitrogen (טכנולוגיות</td><td></td><td></td> חיים</tr></tbody></table>

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

בצמחים פורחים, העובר מתפתח בתוך רקמה מזינה - האנדוספרם - מוקפת נעשה עור הזרעים האימהי (או מעיל זרע). כתוצאה מכך, את הבידוד של עוברי צמחים בשלבים מוקדמים (שלב 1 עד תא כדורי) הוא מבחינה טכנית מאתגר בשל הנגישות היחסית שלהם. נתיחת שימוש יעילה בשלבים מוקדמים הנו פגומה מאוד על ידי הגודל הקטן של זרעי ארבידופסיס צעירים והדביקות של העובר לרקמות שמסביב. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת בידוד יעיל של עוברי ארבידופסיס צעירים, מניב עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. עוברים משתחררים לחיץ בידוד על ידי ריסוק מעט 250-750 זרעים עם העלי פלסטיק בצינור Eppendorf. זכוכית microcapillary קשורה הוא למעבדת פיפטה סטנדרטית (דרך צינור גומי) או microinjector נשלט הידראולי משמש כדי לאסוף עובר ממקום טיפותד בשקופית רב גם במיקרוסקופ אור הפוכה. את הכישורים הטכניים הנדרשים הם פשוט והעברה בקלות, וההתקנה הבסיסית אינה דורשת ציוד יקר. עוברים שנאספו מתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כגון מבחני גן כתב RT-PCR, RNA רצף, ניתוחי מתילציה DNA, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), immunostaining, ו.

הליך בידוד העובר שלנו (איור 1) מאפשר בידוד של עד 40 עוברים בשעה 4 אם שוטף מבוצע, למשל עבור יישומים מולקולריים, או בפחות משעה אם שוטף מושמט, למשל עבור יישומי ציטולוגיה. מציג איור 2 גבוה ונמוך טיפים microcapillary איכות ואיור 3 מציג את ההגדרה של המכונה בידוד העובר. איור 4 מציג תהליך של בידוד עובר במיקרוסקופ ההפוכה. אנחנו מיושמים ב...

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח מ<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים. יכולים להיות מבודדים עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. ההליך מתאים לtranscriptome, מתילציה DNA, ביטוי עיתונאי גן, immunostaining וקרינה<em&gt; באתר</em&gt; ניתוחי הכלאה.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד עוברי צמחים צעירים. זה מושג על ידי ניתוח הזרעים תחילה. השלב השני הוא לרסק בעדינות את הזרעים במאגר בידוד.לאחר מכן, העוברים נבדקים ולאחר מכן נאספים על ידי מיקרו-שאיבה תחת מיקרוסקופ הפוך. השלב האחרון הוא לאסוף את כל העוברים בנפח מינימלי לאחר הכביסה ולהעבירם למאגר היעד. בסופו של דבר, עוברים יכולים לשמש למיצוי RNA או DNA כדי לנתח את הטרנסקריפטום או האפיגנום, או להשתמש בהם לניתוחים ציטולוגיים, כגון מבחני מדווח גנים, או הכלאה פלואורסצנטית באתר.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבודד עוברי צמחים בכמויות גדולות ובשלבי התפתחות ספציפיים. בדרך כלל, לאנשים חדשים בשיטה זו לא תהיה בעיה ליישם אותה במהירות וביעילות. כדי להתחיל, בחר את הנימים המעוצבים ביותר תחת מיקרוסקופ סטריאו שבעבר נמשכו ונחתכו בסיליקון.כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הפתח צריך להיות חלק ובסביבות 50 עד 100 מיקרון. לאחר מכן, שטפו את שקופיות המיקרוסקופ מזכוכית מרובות בארות סיליקון בצנצנות קופלין למשך 10 דקות ב-10% SDS לאחר שטיפת חומר הניקוי. שוטפים את השקופיות פעמיים למשך שתי דקות.במים נטולי נוקלאז למשך שתי דקות ב-70% אתנול למשך שתי דקות ב-100% אתנול ולאחר מכן לייבש באוויר. לאחר מכן מורחים כ-0.5 מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר, אלבומין בסרום בקר או BSA עם פיפטה על כל פני השטח של כל באר ומייבשים באוויר. לאחר מכן, הכינו את מיקרוסקופ בידוד העוברים.השתמש במיקרוסקופ הפוך עם מטרת הגדלה של 10 x ו-20x. חבר את נימי הזכוכית למזרק מיקרו כדי לצפות את נימי המיקרו. קח כשישה מיקרוליטר של BSA ושחרר אותו.אסוף חלקות בשלב ההתפתחות הרצוי, לאחר הכלאות או סוליות הפריה עצמית. 2.5 ימים לאחר ההאבקה משמשים כאן ומכילים שניים עד ארבעה עוברי תאים. הסר את הזרעים מ-10 עד 15 LICs תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מלקחיים ואינסולין. מחטים.טבלו את הזרעים ב-20 מיקרוליטר של מאגר בידוד בצינור תחתון עגול של שני מיליליטר המונח על קרח. מועכים בעדינות את הזרעים בעזרת עלי פלסטיק שנוקה מראש כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לשחרר את העוברים עד שתמצית הזרעים עכורה. כוח היישום ייקבע על ידי כל משתמש במשפט.שוטפים את העלי עם 300 מיקרוליטר של מאגר בידוד כדי לשטוף את העלי ולדלל את הדגימה. סובב את התמצית ב -5, 000 צ'י למשך חמש שניות לאחר הצנטריפוגה. השעו בעדינות את תמצית הכדורים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש.מסננים את התמצית עם רשת ניילון 30 מיקרון המותקנת על מתאמי צינור ומניפים את הצינור. שוטפים את הרשת עם 200 מיקרוליטר נוספים של בידוד, חיץ ונדנדה. שוב. להכנת שקופיות לבידוד עוברים, הנח שקופית נקייה מצופה BSA ומצופה סיליקון על במת המיקרוסקופ ההפוך.הנח את הנימים מעל המגלשה והתאם את המיקום כך שהפתח יהיה בשדה הראיה. לאחר Resus, השעיית תמצית הזרעים המסוננת על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה פיפטה שתי טיפות של 40 עד 50 מיקרוליטר תמצית זרעים לבאר אחת או שתיים. סינון של טיפה אחת או שתיים בלבד בכל פעם, מונע אידוי של הדגימה מניחים 50 מיקרוליטר של מאגר בידוד טרי בבאר של שקופית אחרת שהוכנה כמו קודם.לשמש כטיפת הכביסה הראשונה. שמור את המגלשה הזו בתא לח מכוסה כדי למנוע אידוי. סנן את טיפות תמצית הזרעים לעוברים בשלב הרצוי עם מטרת ההגדלה פי 10 במידת הצורך.אשר את השלב עם הגדלה של פי 20. העוברים בדרך כלל שוקעים לתחתית המגלשה. ההיבט החשוב ביותר בהליך זה הוא איסוף עוברים עם פסולת מינימלית.ניתן להשיג זאת על ידי ניקוי עם מחט טונגסטן, על ידי שליטה קפדנית על טיפת הכביסה לאיתור פסולת נשיאה פוטנציאלית ועל ידי חזרה על וואס במידת הצורך. הסר ידנית פסולת סביב העובר בעזרת מחט טונגסטן, מחט אינסולין או ציוד דומה. הזיזו את נימי הזכוכית ליד העובר באמצעות המניפולטור המיקרו וקחו את העובר עם כמה שפחות תמיסה.אוספים מספר עוברים ומשחררים אותם בכביסה הראשונה. טיפה. עבור יישומים מולקולריים ליישומים ציטולוגיים, העוברים יכולים לעבור ישירות למאגר היעד. יש לשמור כל סבב איסוף תוך חמש עד 10 דקות, ולאסוף עוברים בנפח מינימלי.חזור על הסינון והאיסוף עד לאיסוף כמות העוברים הרצויה בטיפת הכביסה הראשונה. אם פסולת מועברת לתוך טיפת הכביסה, הסר אותם בעזרת מחט לפני שתחזיר את כל העוברים בבת אחת מהטיפה. שחררו את העוברים לטיפת כביסה שנייה של 50 מיקרוליטר וחזרו על ההיזכרות.לבסוף, שחררו את העוברים במאגר היעד. ההעברה צריכה לכלול רק מגע ולא טבילה של קצה הנימים המוצג. להלן מספר עוברים בטיפה האחרונה לאחר כביסות.כעת ניתן להשתמש בעוברי הצמחים המבודדים ליישומים שונים במורד הזרם כדי לשלוט ב-CD NA העוברי. ספריות לפני ריצוף. הוצגו תעתיקים ספציפיים לעובר. להלן התוצאות של הגברת PCR ב-CD NA. ספריות משניים עד ארבעה עוברי תאים נשטפו פעם אחת, ובבידוד עוברי DNA גנומי הוכח כשימושי מאוד במבחני גנים מדווחים עם ביטוי עוברי נמוך וכאשר מעטפת הזרע האימהית מבלבלת את הזיהוי המוצג כאן הוא עובר המבטא גן מדווח GUS בשליטת מקדם Madea.לבסוף, הכלאה פלואורסצנטית ב-C 2 יושמה כדי לחקור את הארכיטקטורה הגרעינית בעוברים מבודדים המשובצים ברפידות אקרילאמיד על שקופיות. דוגמה המשתמשת בבדיקות כנגד חזרות הצנטרומר ואזורי הארגון התחתון הגרעיניים מוצגת כאן. לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת בידוד של 30 עוברים בפחות משעה ליישומים ציטולוגיים, ותוך פחות משלוש שעות ליישומים מולקולריים, כולל כל שלבי השטיפה.למעשה, טכניקה זו תאפשר לקהילת מחקר הצמחים לחקור מנגנונים גנטיים ואפיגנטיים באמבריוגנזה.

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מציג את נוהל בידוד protoplasts שלם מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס. בהתחשב בכך protoplasts מבודדים נותרו על כנן לפחות 96h והם מבודדים שתילים במקום אחד בן חודש צמחים בוגרים, הליך זה מזרז מבחני המחייב protoplasts ללא פגע.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים...

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

המטרה היא להמחיש שניתן להשתמש בקלות במודל הקטניות Medicago truncatula כדי לחקור את הוויסות של עובריות צמחים מוקדמות כדי להשלים את מודל ה-Arabidopsis שאינו קטניות. מורפולוגיה של תרמילים קשורה לשלבי אמבריוגנזה זיגוטית ומסופק גם פרוטוקול לאיסוף עוברים באמצעות תרבית רקמה.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

פרוטוקול תפוקה גבוהה לעיקור פני השטח של זרעי Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) מסופק, אופטימיזציה של שלבי הטיפול בנוזל עם מכשיר יניקה פשוט שנבנה עם משאבת ואקום. מאות דגימות זרעים יכולות להיות מעוקרות על פני השטח ביום אחד.

שיטה חזקה וגמישה מאוד לעיקור פני השטח של זרעי ערבידופסיס

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.

בדיקה ביולוגית ברזולוציה גבוהה, מדגן יחיד, In Vivo אבקת הידרציה עבור Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

למדו שיטה יעילה לבידוד עוברים מוקדמים מזרעי Arabidopsis thaliana לצורך ניתוח תמסומים ואפיגנומים. השיטה מאפשרת בידוד של עד 40 עוברים תוך 1-4 שעות ליישומים מולקולריים וציטולוגיים שונים.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים

גלה סרטונים נוספים