בידוד של מיקרואורגניזמים באדמה אינדיאני עם פוטנציאל לפירוק סרטים מאלצים פלסטיק מתכלים המשמש בחקלאות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד פטריות וחיידקים בקרקע המתיישבים ומפרקים סרטי חיפוי מתכלים. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של סרטי חיפוי מתכלים בשקיות רשת באדמה מספיק זמן כדי לאפשר התיישבות משמעותית על ידי חיידקי קרקע מקומיים. לאחר הדגירה, החיפויים מופקים ומצופים בדילול, מה שמניב מושבות בודדות בודדות של כל סוג של חיידקים הקשורים באופן אינטימי.

לאחר מכן חיידקים מבודדים מודבקים על משטח טרי, חיפויים נגועים ומתכלים, כמו גם על צלחות אגר עם או בלי מקור פחמן. על מנת להשוות צמיחה, התוצאות מאושרות לאחר מכן במדיום נוזלי. התוצאות מראות קולוניזציה ו/או פירוק על ידי מבודדים מסוימים על סמך מיקרוסקופ אלקטרונים סורק וניתן לאמת אותן על ידי כרומטוגרפיה של חדירת ג'ל.

אל תשכח שעבודה עם מבודדים פטרייתיים וחיידקיים לא מזוהים עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה כגון לבישת כפפות, איטום צינורות תרבית וכלים ועבודה בארון בטיחות ביולוגית. לאחר דגירה של חלקי חיפוי באדמה והכנת מדיה וריאגנטים לפי פרוטוקול הטקסט, חותכים חתיכות חיפוי חדשות לריבועים של 4.25 ס"מ כדי לטהר את חלקי החיפוי. חיטוי אותם אם זה לא ישנה או ישפיל אותם עבור חלקי חיפוי שאינם ניתנים לחיטוי כמו אלה העשויים מפלסטיק.

לאחר הכנת ארון בטיחות ביולוגית לפי פרוטוקול הטקסט, הנח את חלקי החיפוי במכסה המנוע המטוהר בשורות ודגר את חלקי החיפוי תחת אור UV למשך שעתיים, באמצעות מלקחיים מעוקרים נקיים והחל מהשורה הקדמית ועבוד לכיוון הגב כדי להימנע מהנחת ידיים וזרועות על המשטחים החדשים שטוהרו. הפוך את חלקי החיפוי, הנח את הצד הנגוע כלפי מטה על אזור נקי, חשוף לאור UV, אך לא היה במגע קודם עם מאלץ'. לאחר שעתיים של טיפול UV בכל צד, שוב, עבודה מקדימה לאחור.

השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את חלקי החיפוי מארון הבטיחות הביולוגית ולהניח אותם במיכלים מכוסים יבשים סטריליים כגון כוסות מכוסות נייר כסף. אחסן אותם בטמפרטורת החדר בחושך מתחת למכסה מנוע סטרילי. בעזרת טכניקה אספטית, הניחו את חתיכות החיפוי הנגועות ב-UV על פני צלחות האגר והניחו פינה אחת תחילה ובעדינות, ותנו לשאר הריבוע להתגלגל במגע עם האגר.

עבור סרטים שאינם חדירים למים, הניחו ארבע טיפות של 10 מיקרוליטר של מדיום מותך חצי מוצק, מינימלי על גבי פינות חתיכות החיפוי כדי לספק מקור מים וחומרים מזינים להתיישבות ראשונית של פלסטיק הידרופובי. אל תיגע במשטח חלקי החיפוי. עם קצה הפיפטה, הטיפות יתקשו לחרוזים.

דגרו את הצלחות המכוסות זקופות למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי להתמצק. לאחר מכן אחסן את הצלחות עם הצד כלפי מעלה בחושך בארבע מעלות צלזיוס. כל החומרים הדרושים לבדיקות הביולוגיות מוכנים כעת ואתה מוכן להתחיל בבידוד של פטריות משפילות פוטנציאליות של חיפוי מחתיכות חיפוי שנקברו באדמה.

חפרו שקיות רשת מהאדמה והסירו חתיכות חיפוי משקיות הרשת. השתמש במרית סטרילית ובמלקחיים כדי להסיר בעדינות את עודפי האדמה מהחיפויים מבלי להפריע לאדמה הנצמדת לפני השטח. חותכים את סרט ה- BDM לחתיכות מרובעות של סנטימטר אחד עד להתאוששות של 0.5 גרם חומר.

עבור כל העברת דגימה משוכפלת, 0.5 גרם חתיכות חיפוי ואדמה מחוברת ל-25 מיליליטר. צינורות תרבית המכילים 9.5 מיליליטר PBS מוסיפים 0.5 גרם אדמה לאדמה רק צינורות בקרה או לדגימות שבהן החיפוי מתפרק לחלוטין כדי לפרק את כל הביופילמים ולנתק תאים מחתיכות חיפוי. מערבל את הצינורות למשך 30 שניות במהירות גבוהה, ואז סוניקציה אותם באמבט מים למשך 10 דקות ומערבל אותם שוב.

זה אמור להניב תרחיף הומוגני של תאים מיקרוביאליים שהיו קשורים לחתיכות החיפוי. לדילול סדרתי של דגימות. הכינו צינור תרבית אחד עם 4.5 מיליליטר PBS סטרילי ומלאו שלוש בארות של צלחת באר עמוקה ב -450 מיקרוליטר PBS לדגימה מצינורות ההשעיה המקוריים.

העבירו 0.5 מיליליטר לתוך 4.5 מיליליטר של PBS סטרילי כדי לקבל 5.0 כפול 10 לדילול השלישי השלילי לאחר מערבולת במהירות גבוהה למשך 30 שניות, הוסיפו 50 מיקרוליטר ל-450 מיקרוליטר PBS בתערובת צלחות 96 בארות על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 10 פעמים חזור על הפעולה עד להשלמת דילול של עד 5.0 כפול 10 לשש השלילי. השתמש במוטות זכוכית כפופים מעוקרים להבה כדי לפזר באופן שווה 100 מיקרוליטר מכל אחד מהדילולים על פני השטח של לוחות PDA המכילים כלורמפניקול כדי לעכב צמיחת חיידקים. אחסן צלחות זקופות למשך 30 דקות כדי לתת לנוזל להיספג פנימה.

לאחר מכן אטמו את הצלחות עם פרפורם כדי למנוע נבגים לברוח מבודדים לא מזוהים. דגרו צלחות הפוכות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בחושך למשך חמישה ימים כדי לאפשר לפטריות הגדלות במהירות ובאיטיות ליצור מושבות בארון בטיחות ביולוגית. בדוק את לוחות הדילול עבור מושבות בודדות מבודדות באמצעות קיסם שיניים סטרילי יחיד.

גע בעדינות במושבה ולאחר מכן גע באגר של מדיום מינימלי פטרייתי, מדיום מינימלי פטרייתי בתוספת פלסטיק וצלחות בינוניות מינימליות של גלוקוז על מנת לחסן חרוזי אגר על גבי סרטי פלסטיק. שפשפו את הקיסם בעדינות על פני נקודת האגר ולאחר מכן החליקו אותו על פני סרט הפלסטיק. חזור על החיסון מאותה מושבת מקור עד שיהיו ארבעה.

שכפל פסים על כל צלחת לאחר דגירה של הלוחות ב-20 מעלות צלזיוס בחושך במשך חמישה ימים. השווה צלחות כדי לזהות מבודדים שגדלים על חתיכות חיפוי טוב יותר מאשר על מדיום מינימלי שאינו מכיל פחמן נוסף מלבד אגר. אלה הם מפרקי חיפוי פוטנציאליים.

צלחת ה- GMM צריכה להכיל את הצמיחה הגדולה ביותר מכיוון שמדובר בצלחת בקרה חיובית בה המדיום מכיל גלוקוז. ייתכן שמבודדי אדמה אינם טהורים לחלוטין בשלב זה, לכן השתמשו בקיסם סטרילי כדי לגרד את החיסון מהפטרייה, ליישב את החיפוי ולפס אותו לבידוד על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה, ואז לאטום את הצלחת ולדגור למשך חמישה ימים. לאחר הדגירה של חמישה ימים, ייווצרו מושבות בודדות מבודדות.

אשר כי המושבות המטוהרות החדשות הללו מראות קולוניזציה של חיפוי בבדיקה הביולוגית של הצלחת הדומה לזו, שנצפתה עם המבודדים המקוריים שעלולים להיות לא טהורים. לאחר שזוהו מפרקי חיפוי פוטנציאליים על ידי הבדיקה הביולוגית של הצלחת אימות באמצעות בדיקה ביולוגית נוזלית בבדיקה המאשרת הסופית הזו, אפילו אגר חסר מתחת לחיפוי. חתיכות הן באמת מקור הפחמן היחיד לגידול מיקרוביאלי במדיום המוכן בקפדנות כדי להתחיל את הבדיקה על פני השטח של חתיכת חיפוי נגועה למדיום פטרייתי חסר כל תוספת פחמן אחרת עבור כל שכפול של מבודד מיקרוביאלי.

הכן שלושה צינורות לחיסון. האחד, צינור ניסיוני עם חמישה מיליליטר של מדיום מינימלי המסומן כאן FMM המכיל חתיכת חיפוי בגודל שנקבע מראש. שתיים, בקרה שלילית עם חמישה מיליליטר של מדיום מינימלי ללא מקור פחמן.

ושלוש, בקרה חיובית עם חמישה מיליליטר גלוקוז המכיל נוזל. כאן מסומן GMM. בנוסף, הכינו צינור משוכפל של מדיום מינימלי המכיל כל חיפוי לבדיקה, אך אל תחסן אותו.

צינור בקרה זה יחשוף כל גידול מיקרוביאלי הנובע מזיהום לאחר גידול ואיסוף נבגים טריים. על פי פרוטוקול הטקסט, במכסה מנוע העברה סטרילי יש לחסן את צינורות התרבות שהוכנו בעבר במיליון נבגים או תאי שמרים, לאטום את הכובעים ולדגור בחושך מבלי לרעוד ב -20 מעלות צלזיוס. התבונן בדגימות מדי שבוע לצמיחה.

צמיחת תפטיר של פטריות על חתיכות חיפוי עשויה להיראות בשבוע הראשון לאחר החיסון, במיוחד בשולי חלקי החיפוי עבור שמרים פלנקטוניים מנטרים את הצמיחה על ידי קריאות צפיפות אופטיות ב-600 ננומטר מכיוון שפטריות חוטים עשויות להיצמד ישירות לחתיכות החיפוי. העריכו את הגידול בעין ואשרו על ידי מיקרוסקופ אור ו/או מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בבקרות בינוניות מינימליות בלבד. חפש פלקס לבן זעיר שהם קטנים מכדי לרשום שינוי בצפיפות האופטית.

שימוש בשיטות פוטומטריות ספקטרו. השתמש בפיפטה פסטר כדי לשאוב את הגמישות ולהתבונן בהם באמצעות הפרעות דיפרנציאליות. מיקרוסקופ ניגודיות לאחר בידוד שלושה מבודדים משפילים פוטנציאליים לחיפוי בבדיקה הביולוגית של הצלחת הן מחיפוי תאית הנקרא מגן עשבים פלוס שהייתה הבקרה החיובית שלנו והן מחיפוי פלסטיק מבוסס עמילן בשם Biore.

הם הודגרו בבדיקה הביולוגית הנוזלית במשך 68 ימים ונקטפו לפני שהעבירו אותם למיקרוסקופ אלקטרונים סורק. כצפוי. היפי פטרייתי נצפה בכל הדגימות למעט XX ו-YY שם נצפו תאים בצורת מוט עבור המבודדים על חיפוי בקרת התאית שלנו.

לא נצפתה צמיחה בבקרות FMM בלבד, כפי שמוצג כאן בבקרות המחוסנות של האו"ם עבור מגן העשבים בתוספת שאריות חיפוי אלמנטים של קנה הנשימה של הסיבים שמקורם בצמחים היו ניתנים לזיהוי רק כסימני נקבוב קלים שנראו בשורות על חלק מהסיבים, אם כי היפי פטרייתי נצפה בכל שלוש הדגימות המחוסנות של חיפוי בקרת התאית שלנו. אלמנטים של קנה הנשימה נראו בבירור רק בדגימות SS מה שמרמז על כך שעיכול של חומר תאית חשף את יסודות קנה הנשימה הנוזליים מתחת ל-SS מבודד זוהה באופן זמני באמצעות 18 s ריבוזומלי, DNA כסודה מיי בתוך הזמנת משקאות מוגזים לחיפוי פלסטיק מבוסס עמילן. מבודדים לא נצפתה צמיחה משמעותית במדיום המינימלי בקרות רק מפרט לבן בודד הנראה בעת סיבוב בצינורות התרבות של מבודדים, VV ו-ZZ נצפו באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות עבור VV מבודד.

המפרט היה מסת נבגים, ככל הנראה שארית מהחיסון הראשוני. לבידוד zz. המסה הייתה מורכבת מרשת רופפת של היפי, בקוטר של כ-0.2 מילימטרים, מה שמרמז על כך שהחיסון המקורי של הנבגים נבט אך לא גדל מעבר למסה המוצגת כאן.

כפי שניתן לראות כאן בבקרות המחוסנות של האו"ם לחיפוי הפלסטיק המבוסס על עמילן, נצפה מרקם גבשושי. זהותם של המאפיינים הלבנים אינה ידועה, אך הם נעדרים בסרט שנכבש על ידי VV מבודד המוצג כאן. גם החלקיקים הלבנים וגם הבליטות נעלמו בסרט שהתיישב על ידי zz מבודד.

בנוסף, הדגימה האחרונה הראתה התרחשות אחידה של סדקים על פני מבודדי פני השטח של BDM. VV ו-ZZ זוהו באופן זמני באמצעות DNA ריבוזומלי ב-s כפניציליום ו-ACE בסדר ההיפו בהתאמה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פירוק ביולוגי של חיפויי פלסטיק לתעשייה החקלאית, ניתן ליישם אותה גם על כל פלסטיק אחר שהפירוק הביולוגי שלו בסביבה מוטל בספק.

לדוגמה, פלסטיק שעלול להגיע לסביבה הימית. האם אלה משמשים לתעשיית המזון? אני.