שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד איי לangers בריאים לצורך מדידת הבדלים בייצור cyclic A MP בתגובה לטיפולים ניסיוניים שונים. הדבר מתבצע תחילה על ידי ניפוח הלבלב ולאחר מכן על ידי הסרתו בשלב השני. איי הלangers הבריאים מבודדים באמצעות סדרה של סבבי סרכזיות ושטיפות.

בשלב הבא, העיניות החיות מועברות למצע תרבית איים רענן ומוכנסות לדגירה למשך לילה. בשלב הסופי, העיניות נחשפות לטיפולים הניסויים הרצויים ומבוצעת בדיקת cyclic A MP. לבסוף, נעשה שימוש בסבדיסורס (enzyme immunoassay) כדי למדוד שינויים בייצור של cyclic A MP בתגובה לטיפולים השונים שהוחלו על העיניות.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בהתחלה, מכיוון שנדרש תרגול רב כדי להשיג ניפוח מלא של הלבלב. ראשית, מלאו מזרק וקנולה בחמישה מיליליטרים של תמיסת קולגנז. הרכיבו מחט קהה בכילוי 30 על הקנולה והניחו את המזרק והקנולה על קרח.

לאחר הזזת המעי הדק לצד ימין של העכבר, אתרו את ספינקטר אודי (sphincter of oddi), הנמצא בקצה תעלת המרה המשותפת ונפרש על המעי הדק, כך שהוא יוצר משולש לבן. ברגע שספינקטר אודי אותרה, קחו פינצטה מסוג dumont מספר 5 והחליקו את הקצה תחת תעלת המרה המשותפת, קרוב ככל האפשר למעי הדק. יש להיזהר לא לדקור את התעלה.

לאחר החדירה דרך המעי הדק והרקמה החיבורית, השתמש בקצה הפינצטה מסוג dumont כדי לתפוס את התפר ולמשוך אותו תחת התעלה המרה המשותפת. קשור את התעלה המרה המשותפת קרוב ככל האפשר לספינקטר של Odd, תוך כדי וידוא שהקשר מתוח כדי למנוע דליפות. לאחר מכן, תפוס את שני קצות התפר ומשוך אותם לכיוון הזנב כדי להפעיל מתיחה על התעלה המרה המשותפת.

לאחר מכן, בעזרת יד חופשית, בצעו חתך קטן בעזרת מספרי מיקרו בתעלה המרה המשותפת, מעל הפיצול האחרון לכיוון הכבד, תוך החזקת שני קצות החוט כך שתעלת המרה המשותפת תהיה מתוחה. הוציאו את המזרק והקנולה מדלי הדקרח. הניחו את המזרק בצד והחדירו את מחט ה-30 gauge הקה שהוכנה לתוך החתך.

תעלה מרה משותפת. יש להיזהר לא לנקב את דופן התעלה. השגת ניפוח מלא של הלבלב היא החלק המורכב ביותר.

אנו משתמשים במחט המבטיחה אטימה טובה. אם המחט הראשונה אינה מספקת אטימה טובה, השתמשו במחט רחבה יותר, כגון מחט בכייח (gauge) 27. כעת לחצו על בוכנת המזרק באיטיות, תוך שחרור הלחץ באופן פולסטילי, עד שחלקו הראשון של הלבלב יתנפח.

המשיכו להפעיל לחץ קבוע ועדין עד שהלבלב אינו מתנפח יותר. ניפוח מוצלח יתאפיין בחלוקה שווה של רקמה אקסוקרינית, וחלקו של הלבלב הממוקם מעל הקיבה יהיה מנופח. כדי להוציא את הלבלב, השתמשו בפינצטה ביד אחת כדי לתפוס את המעי הדק בספינקטר של אודי.

בעזרת היד השנייה, הכניסו את הקצה הסגור של מספריים מעוקלים כדי להפריד חלק מהלבלב מהמעי הדק. העבירו את הקצה במורד המעי הדק לכיוון רקמת החיבור הוורודה. לאחר מכן, הרימו את המעי הדק בקרבת נקודת חיבורו לקיבה וגזרו את הלבלב משאר המעי הדק.

תפסו חלק גדול ככל האפשר מהלבלב והרימו אותו בעדינות. בעזרת המספריים הקמורות, חתכו את החיבורים שנותרו בין הלבלב לבין חלל בית החזה.

להסרה מלאה של הלבלב, יש לאחסן כל לבלב שהוסר בכ-2.5 מיליליטר של תמיסת קולגנאז. השתמשו במבחנות קוניות של 50 מיליליטר בנפרד על קרח כדי לשטוף את הלבלבנים. ראשית, העבירו כל לבלב למבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר המכילה 25 מיליליטר של קולגנאז.

לאחר מכן, מקמיים את מבחנות הקונוס בנפח 50 milliliter המכילות את הלבלב במצב אנכי בתוך מקבץ מים רוטט בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, המסוגל להגיע ל-220 עד 250 RPM, כאשר המכשיר כבוי. כעת, מנפחים כל מבחנה קונוס בנפח 50 milliliter בגז המורכב מ-95% oxygen ו-5% carbon dioxide למשך חמש דקות.

באמצעות פיפט פסטור, סגרו היטב כל מבחנה והניחו אותן בשכיבה בתוך אמבט מים רועד, מתחת לפני המים. החל מהדקה השישית, נערנו את המבחנות במהירות של 220 עד 250 RPM למשך 20 שניות בכל דקה שנייה, וזאת עד למשך 16 דקות. לאחר הנעורה, סובבו את המבחנות ב-400 עד 500 Gs בטמפרטורת החדר, תוך כיבוי מיידי של הצנטריפוגה ברגע שהיא הגיעה למהירות מלאה.

בשלב הבא, מבלי להפריע למשקע, השתמשו בשואב ואקום כדי לשאוב כ-22.5 milliliters של תמיסת הקולגנאז מכל מבחנה. לאחר מכן, השביו את המשקעים ב-12.5 milliliter של HBSS ובצעו ערבול עדין במכשיר vortex כדי לפרק את המשקעים. לאחר שטיפה וערבול של התאים עם HBSS נוסף, שפכו כל תרחיף תאים דרך רשת של 1000 micron אל תוך מבחנות קוניות חדשות בנפח 50 milliliter.

לאחר סבב ספינטר נוסף של תרחיפי התאים, השתמשו בשואב ואקום כדי לשאוב בזהירות את כל ה-HBSS מבלי להפריע למשקע. לאחר הסרת כל ה-HBSS, הוסיפו 4.8 milliliters של תמיסת 25%F לכל מבחנה. לאחר ערבוב ב-vortex לפירוק המשקע, מזקו בזהירות 2.4 milliliters של תמיסת 23%20.5%and 11%fial לאורך דופן המבחנה, תוך סיבוב המבחנה הקונית בנפח 50 milliliters.

כדי להבטיח שכבה אחידה לאחר סבוב במערך צנטריפוגה של תמיסת ה-FI call, שפכו את כל תמיסת ה-FI call לפרוכת קונית חדשה בנפח 50 milliliter, תוך הקפדה להשאיר מאחור את המשקע של הרקמה האקסוקרינית. הוסיפו HBSS קר מאוד לפרוכת החדשה עד לסימון של 50 milliliter. לאחר מכן, סגרו את הפרוכת במכסה והפכו אותה ארבע עד שש פעמים.

כדי לערבב את ה-FI call וה-HBSS יחד. השתמש במלכודת הוואקום כדי לשאוב בזהירות את רוב תערובת ה-HBSS מבלי להפריע למשקע הרפוי. לאחר מכן, העבר את המשקע למסביבב חדש.

השתמשו בפיפטת פסטור כדי להעביר את הפתחי העין (eyelets) לתוך צלחת פטרי המכילה מצע גידול לפתחי עין, תוך הקפדה להימנע מהעברת שאריות רקמה של ASIN art. הניחו את צלחת הפטרי על מיקרוסקופ להכנה תחת תאורה אחורית.

איילטים (eyelets) בריאים יהיו בעלי צורה כדורית ומרכז בצבע חום-זהוב עד חום כהה. אין להשתמש באיילטים המחוברים ל-ASIN או לרקמה, שייראו עמומים ואפורים, ויש להשליכם. בנוסף, יש להשליך איילטים גדולים יותר שפיתחו מרכז נמק כהה לאחר דגירה של לילה, שכן הם אינם מתפקדים כראוי.

אם הכנת ה-eyelet מכילה כמות גדולה של פסולת, העבירו את ה-eyelets ידנית פעמיים לתוך מצע טרי, והוסיפו DNA למסדי העיכול כדי לסייע במניעת התגבשות של ה-eyelets. התחילו שלב זה על ידי גלגול ה-eyelets למרכז פטרי dish. באמצעות פיפטה P 20, העבירו את ה-eyelets לפטרי dish פוליסטירן חדש בגודל 15 מילימטר על 60 מילימטר המכיל חמישה מיליליטר של תמיסת קדם-דגירה כדי לשטוף את מצע השיתול המכיל גלוקוז מה-eyelets.

לאחר מכן, השתמשו בפיפטה P 20 כדי להעביר לפחות 13 eyelets למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות המכילות מיליליטר אחד של בופר Krebs ringer bicarbonate טרי ומגוז, תוך שמירה על עקביות בגודל ה-eyelets בין המבחנות. לאחר דגירה של הדגימות ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 45 דקות, סגרו את המבחנות, בצעו ערבוב מהיר ב-vortex וסובבו את מבחנות הצנטריפוגה בצנטריפוגה שולחנית בטמפרטורת החדר עד ל-7,000 עד 7,500 Gs. אם יישום המשך רצוי הוא מדידת אינסולין או מטבוליט אחר, השתמשו בפיפטה P 1000 כדי לאסוף אליקוט של המצע למבחנת מיקרו-צנטריפוגה. אם אין צורך באיסוף מצעי הגירוי, ניתן להשליכם.

השתמשו בפיפט P 1000 כדי להסיר את רוב תמיסת ה-Krebs מכל מבחנה למיקרוצנטריפוגה, כך שיישארו כ-10 עד 15 µL של Krebs על משקע העין. לאחר מכן, השתמשו בפיפט P 20 כדי להסיר את החלק הקרוב ביותר למשקע. לבסוף, כאשר נותרו פחות מ-10 עד 15 µL של Krebs על העין, הקפיאו במהירות את משקעי העין בחנקן נוזלי.

לאחר מכן, יש לאחסן את הכדוריות שהקפיאו בהקפאה מהירה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למדידת ה-cyclic AMP. בדרך כלל, השפעתו של חומר על ייצור cyclic AMP נמצאת במתאם ישיר עם השפעתו על הפרשת אינסולין. בניסוי זה, איים מבודדים מעכברים מסוג Wildtype או עכברים עם נוק-אאוט גנטי גורו לגירוי באמצעות 11.1 מילימולר גלוקוז ו-cyclic תוך-תאי.

נמדדה הפקת cAMP ונורמלה לחלבון התאי הכולל. אינסולין מופרש נמדד באמצעות אינסולין סטנדרטי, Eliza, ונורמל אף הוא לחלבון התאי הכולל. כצפוי, השינוי בהפקת cAMP קריאלי באופן ישיר עם העלייה בהפרשת אינסולין המעוררת גלוקוז.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם תהיו מסוגלים לבודד תרבית ולמדוד רמות של cyclic a ו-p בעקלי עיניים של עכברים בריאים.