Name: שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: למדו לבודד איילטים בריאים מלבלב עכבר ולמדוד רמות cAMP בתגובה לטיפולים ניסיוניים שונים. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד תאי בטא ותרומה למחקר הסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לרנה ל Pasker וHarpreet ק Brar לקבלת סיוע טכני מומחה לפרוטוקולים המתוארים בעבודה זו. יתר על כן, ברצוננו להכיר בחונכות של כריסטופר ב Newgard באוניברסיטת דיוק ואלן ד איתי באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון, יחד עם התמיכה של חברי המעבדה שלהם, שאפשרו לנו את הזמן ואת התמיכה הנדרשת כדי למטב פרוטוקולים שתוארו. בפרט, אנו מודים לאנס Hohmeier, Danhong לו, והלנה וינפילד במעבדה Newgard ומרי Rabaglia במעבדה איתי לדיונים ועצות מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק DK080845 וסוכרת נעורים 594 מענק קרן מחקר 17-2011-608 (לMEK)

<ol><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoglycaemia%3A+the+limiting+factor+in+the+glycaemic+management+of+Type+I+and+Type+II+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes.</a> Diabetologia. 45, 937-948 (2002).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Muoio, D. M., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+molecular+and+metabolic+mechanisms+of+insulin+resistance+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).</li>
<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+development+is+correlated+with+insulin+content+in+the+pancreatic+B+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell.</a> Science. 209, 1026-1028 (1980).</li>
<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%2B+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49, 424-430 (2000).</li>
<li>Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from pancreatic islets.</a> Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).</li>
<li>Field, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+insulin+by+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Extraction of insulin by liver.</a> Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).</li>
<li>Emmanouel, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+metabolism+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucagon metabolism in the rat.</a> J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).</li>
<li>Kimple, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+GalphaZ+protein+protects+against+diet-induced+glucose+intolerance+via+expansion+of+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass.</a> J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).</li>
<li>Rabaglia, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Ketoisocaproate-induced+hypersecretion+of+insulin+by+islets+from+diabetes-susceptible+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).</li>
<li>Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+of+mouse+pancreatic+islets+to+oleate+or+palmitate+results+in+reduced+glucose+induced+somatostatin+and+oversecretion+of+glucagon%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon.</a> Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).</li>
<li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Replication+and+Beta+Cell+Function+in+Adenovirally-transduced+Isolated+Rodent+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+G%28z%29+in+pancreatic+islet+beta-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology.</a> J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).</li>
<li>Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+prevalence+of+diabetes+for+2010+and+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030.</a> Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).</li>
<li>Davis, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxM1+is+up-regulated+by+obesity+and+stimulates+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation.</a> Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>Linetsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+islet+isolation+using+a+new+enzyme+blend%2C+liberase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase.</a> Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).</li>
<li>Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+comparison+of+Liberase+HI+and+collagenase+NB1+utilized+for+human+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation.</a> Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

עם השכיחות של הסוכרת צפויה להשפיע 7.7% מאוכלוסיית העולם, הדרישה של טכניקות מחקר רומן הכרחית לשניהם להבין ולטפל בסוכרת 18. בידוד איון הנוכחי הוא פרוטוקול מבוסס היטב המשמש לניסויים במבחנה וכבר הוצג בעבר עם 11,14,16 שינויים קלים. למרות שהפרשת אינסולין היא יישום במורד הזרם משותף לאיים מבודדים, תוך התמקדות במרכיבים במעלה הזרם, כגון cAMP, עשוי לעזור להתוות מנגנוני potentiating ייצור אינסולין ואת הפרשה. <p class="jove_content" style=";text-align:right;d...

התחזוקה הקפדנית של euglycemia היא הכרחית כדי למנוע נלוות כגון נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה, שהם כולם סימני ההיכר של פתולוגיה מסוג בלתי מבוקר 1 ו 2 סוכרת 1. פונקציה מופחתת β-תאים ומסה בשני מהסוג 1 וסוכרת 2 להפריע ריכוז הגלוקוז בדם 2. ואילו סוג החיסון בתיווך תוצאות 1 סוכרת מאובדן הרסני של β-תאים מייצרי אינסולין, הפרשה לקויה β-תאים לאינסולין ואינסולין איתות היקפית בסוכרת מסוג 2 יחד לקדם היפרגליקמיה, דיסליפידמיה, וייצור הגלוקוז בכבד מוגבר, שסופו של דבר תוצאה הוא גם אובדן מסת β-תא והפרשת אינסולין מקיבולת β-תאים בודדים 3. הבנת מנגנוני β-תאי הבסיס בהתקדמות מסוג 1 וסוכרת 2 יהיה בתקווה להצמיח טיפולים חדשניים למניעה וטיפול במחלות אלה. בti המבחנהמודלים תרבות ssue, כגון INS-1 וMIN6 הונצחו קווי β-תאים, יכולים להיות כלי שימושי להבנת פונקציות β-תאים ספציפיים. עם זאת, אינטראקציות בין סוגי התאים השונים בתוך איון עשויים עצמם מווסתים את תפקוד β-תאים. לדוגמא, ההשפעה אוטוקריני של גלוקגון (שוחררה מα-תאים) וסומטוסטטין (שוחרר מδ-תאים) בהגדלת והקטנת הפרשת אינסולין, בהתאמה, מדגים את החשיבות של תא תא קירבה בתגובה האנדוקרינית 4. יתר על כן, צמתים פער בין β-תאים להגביר את שחרור אינסולין 5. יתר על כן, למרות שצעדים שנעשו ביצירת קווי insulinoma שיותר טוב לשכפל את התגובה הפיזיולוגית של איים מבודדים לגלוקוז (לדוגמא, INS-1 נגזר 832/13 ו832/3 שורות תאים), היענות הגלוקוז שלהם עדיין שונה מעכברים רגילים האיונים 6,7. יתר על כן, התגובה של שורות תאים אלה משובטים insulinomaלאגוניסטים כמו גלוקגון פפטיד -1 (GLP-1) יכולה להיות שונה באופן דרמטי מזה, כמו גם מאיונים רגילים 6. לכן, שורות תאים הונצחו לא יכולות לייצג את המודל הטוב ביותר למנסה לאמוד סוכנים המשפיעים על ייצור cAMP. בניגוד לשורות תאי שמקורם בinsulinoma, לומד פונקצית β-תאים אך ורק במודלים של בעלי החיים כולו מציע סדרה של סיבוכים משלו. אחד האתגרים הגדולים ביותר בעבודה עם רקמה האנדוקרינית מודד את הריכוז המדויק של הורמון שפורסם. באופן ספציפי, הכבד ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים של אינסולין, וזרימת דם הלבלב הולכת ישירות אל הכבד. לפיכך, מדידת אינסולין בפלזמה לא יכולה לתאר במדויק את כמויות אינסולין שמופרשות מהלבלב עצמו או את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעור הפרשת אינסולין 8. יתר על כן, חילוף חומרים של כליות של גלוקגון עלול להגביל את מהימנות פלט גלוקגון מהאיון α-תאים 9. לכן, בידוד איונים עכבר עיקריים לניסויים במבחנה מספק הבנה מדויקת יותר של אופן שבו איון מגיב לגירויים ספציפיים כדי להשלים את המדידות שנעשו בגוף חי. הפרוטוקול הנוכחי לבידוד של איי עכבר הוא פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש על ידי מספר הקבוצות (עם שינויים קלים שעשויות לעזור כדי להגדיל את ההצלחה) 10,11. בנוסף, קביעת ייצור cAMP מאפשרת קריאה מתוך ישירה של היענות אינקרטין של β-התאים. בשילוב עם מדידת cAMP, תכולת חלבון והפרשת אינסולין גם ניתן לכמת מאותו מכין מדגם cAMP, עוזר לקבוע אם פגם בתפקודו β-תאים טמון פרוקסימלי או דיסטלי למחנה 10. התוכן הסופי cAMP ויישום הפרשת אינסולין בפרוטוקול זה יכול להיות כלי רב עוצמה להבנת ההשפעה של מרכיבי תרופות ומזון, בין השארים, על מחנה והפרשת אינסולין. בנוסף לגירוי מגלוקוז לבד, יכולה להיות בשימוש תרכובות אחרות כדי למדוד שינויים במחנה והפרשת אינסולין 10,11. לבסוף, למרות שהאינסולין הוא ההורמון העיקרי שאנחנו assay מאיים מבודדים, הורמונים אחרים, כגון גלוקגון וסומטוסטטין, כמו גם ציטוקינים, eicosanoids, וmonophosphate אדנוזין המחזורי, ניתן גם למדוד, או על ידי assay גירוי חולף או על ידי כימות הרמות שלהם במדיום תרבות 12. לבסוף, למרות שמחוץ לתחום של כתב היד הזה, בידוד איון עם שיטת בידוד collagenase תאר מאפשר לשימור איון, כך שיישומים רבים אחרים במורד הזרם עשויים להיות נרדפים, כגון השתלת איון, בידוד RNA בזמן אמת PCR כמוני או microarray מנתח, חלבון בידוד מערבי סופג, הטבעת איון וההדמיה immunofluorescent, ושילוב [3H]-תימידין כמדד לrepli תא איוןקטיון, שחלקם כבר תאר במאמרי יופיטר הקודמים 13-16. בסך הכל, בעקבות הליך בידוד איון שתואר בפרוטוקול עשוי לספק חוקר עם מידע חשוב ושימושי לפיתוח טיפולים וקידום גילוי תרופות שמטרתן שיפור תפקוד β-תאים.

<table><tbody><tr><td>קולגנאז מClostridium histolyticum מתאים לבידוד איים פעילים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks תמיסת מלח מאוזנת 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (אבקה)</td><td>Invitrogen (גיבקו)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 חוט תפר משי</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0.8 מ"מ מלקחיים&nbsp; &nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; מספריים קפיציים bingen - ישר / חד / 8.5 ס"מ / 5 מ"מ קצה חיתוך</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ניתוח</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק BD Luer-Lok</td> BD <td></td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>BD 309628</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם מחט BD 1/2 אינץ' אורך</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם מחט BD 1/2 אינץ' אורך</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>השחזה אבן</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>מונופוטסיום פוספט (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מומת בחום (H.I. FBS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית camp

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

הגלוקוז לא מבוקר הוא סימן היכר של סוכרת ומקדם נלוות כמו נוירופתיה, נפרופתיה ורטינופתיה. עם השכיחות הגוברת של סוכרת, הן סוג החיסון בתיווך 1 וסוג 2 צמוד להשמנת יתר, מחקרים שמטרתם מגדירים הפתופיזיולוגיה סוכרת ומנגנונים טיפוליים הם בעלי חשיבות קריטית. Β-התאים של איי הלבלב לנגרהנס אחראים כראוי מפרישי אינסולין בתגובה לריכוז הגלוקוז בדם גבוה. בנוסף לגלוקוז וחומרים מזינים אחרים, β-התאים גם מגורה על ידי הורמונים מסוימים, כינה incretins, אשר מופרשים מהבטן בתגובה לארוחה ולפעול על קולטני β-תאים המגבירים את הייצור של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים ( cAMP). ירידה בתפקוד β-תא, מסה, ואת היענות אינקרטין הם הבינו היטב לתרום לפתופיזיולוגיה של סוכרת מסוג 2, וגם להיות מקושר יותר ויותר wiה סוכרת מסוג 1. הבידוד הנוכחי עכבר איון ופרוטוקול נחישות cAMP יכולים להיות כלי כדי לעזור להתוות מנגנוני קידום התקדמות מחלה והתערבויות טיפוליות, בעיקר אלה שמתווכים על ידי קולטנים אינקרטין או קשור קולטנים הפועלים באמצעות אפנון של ייצור cAMP תוך תאי. בעוד מדידות cAMP רק תתואר, פרוטוקול בידוד איון תאר יוצר הכנה נקייה שמאפשרת גם ליישומים רבים במורד הזרם אחרים, כוללים גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין, [3 H]-תימידין התאגדות, שפע חלבון, וביטוי mRNA.

כדי להבטיח תשואת איון גבוהה במהלך בידוד, צריכים להיות אחרי הטכניקות ניתוחיות המפורטים בפרוטוקול באופן הדוק. למרות הטכניקות שהוצגו כאן תהיה מותאמות לכל מעבדה, יש כמה שלבים קריטיים שיובילו לבידוד מוצלח. על מנת להפוך את צינור המרה המשותף נגיש בקלות, מומלץ שהאיברים להיות עקורים לצד הימני של העכבר (איור 1). יתר על כן, זה יאפשר הלבלב לנפח עם כמות קטנה יותר של התנגדות מאז תהיה התרחבות במשקל מגביל פחות. שלב קריטי נוסף על מנת למקסם את תשואת איון הוא קשירה של צינור המרה המש...

מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד איי לangers בריאים לצורך מדידת הבדלים בייצור cyclic A MP בתגובה לטיפולים ניסיוניים שונים. הדבר מתבצע תחילה על ידי ניפוח הלבלב ולאחר מכן על ידי הסרתו בשלב השני. איי הלangers הבריאים מבודדים באמצעות סדרה של סבבי סרכזיות ושטיפות.בשלב הבא, העיניות החיות מועברות למצע תרבית איים רענן ומוכנסות לדגירה למשך לילה. בשלב הסופי, העיניות נחשפות לטיפולים הניסויים הרצויים ומבוצעת בדיקת cyclic A MP. לבסוף, נעשה שימוש בסבדיסורס (enzyme immunoassay) כדי למדוד שינויים בייצור של cyclic A MP בתגובה לטיפולים השונים שהוחלו על העיניות.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בהתחלה, מכיוון שנדרש תרגול רב כדי להשיג ניפוח מלא של הלבלב. ראשית, מלאו מזרק וקנולה בחמישה מיליליטרים של תמיסת קולגנז. הרכיבו מחט קהה בכילוי 30 על הקנולה והניחו את המזרק והקנולה על קרח.לאחר הזזת המעי הדק לצד ימין של העכבר, אתרו את ספינקטר אודי (sphincter of oddi), הנמצא בקצה תעלת המרה המשותפת ונפרש על המעי הדק, כך שהוא יוצר משולש לבן. ברגע שספינקטר אודי אותרה, קחו פינצטה מסוג dumont מספר 5 והחליקו את הקצה תחת תעלת המרה המשותפת, קרוב ככל האפשר למעי הדק. יש להיזהר לא לדקור את התעלה.לאחר החדירה דרך המעי הדק והרקמה החיבורית, השתמש בקצה הפינצטה מסוג dumont כדי לתפוס את התפר ולמשוך אותו תחת התעלה המרה המשותפת. קשור את התעלה המרה המשותפת קרוב ככל האפשר לספינקטר של Odd, תוך כדי וידוא שהקשר מתוח כדי למנוע דליפות. לאחר מכן, תפוס את שני קצות התפר ומשוך אותם לכיוון הזנב כדי להפעיל מתיחה על התעלה המרה המשותפת.לאחר מכן, בעזרת יד חופשית, בצעו חתך קטן בעזרת מספרי מיקרו בתעלה המרה המשותפת, מעל הפיצול האחרון לכיוון הכבד, תוך החזקת שני קצות החוט כך שתעלת המרה המשותפת תהיה מתוחה. הוציאו את המזרק והקנולה מדלי הדקרח. הניחו את המזרק בצד והחדירו את מחט ה-30 gauge הקה שהוכנה לתוך החתך.תעלה מרה משותפת. יש להיזהר לא לנקב את דופן התעלה. השגת ניפוח מלא של הלבלב היא החלק המורכב ביותר.אנו משתמשים במחט המבטיחה אטימה טובה. אם המחט הראשונה אינה מספקת אטימה טובה, השתמשו במחט רחבה יותר, כגון מחט בכייח (gauge) 27. כעת לחצו על בוכנת המזרק באיטיות, תוך שחרור הלחץ באופן פולסטילי, עד שחלקו הראשון של הלבלב יתנפח.המשיכו להפעיל לחץ קבוע ועדין עד שהלבלב אינו מתנפח יותר. ניפוח מוצלח יתאפיין בחלוקה שווה של רקמה אקסוקרינית, וחלקו של הלבלב הממוקם מעל הקיבה יהיה מנופח. כדי להוציא את הלבלב, השתמשו בפינצטה ביד אחת כדי לתפוס את המעי הדק בספינקטר של אודי.בעזרת היד השנייה, הכניסו את הקצה הסגור של מספריים מעוקלים כדי להפריד חלק מהלבלב מהמעי הדק. העבירו את הקצה במורד המעי הדק לכיוון רקמת החיבור הוורודה. לאחר מכן, הרימו את המעי הדק בקרבת נקודת חיבורו לקיבה וגזרו את הלבלב משאר המעי הדק.תפסו חלק גדול ככל האפשר מהלבלב והרימו אותו בעדינות. בעזרת המספריים הקמורות, חתכו את החיבורים שנותרו בין הלבלב לבין חלל בית החזה.להסרה מלאה של הלבלב, יש לאחסן כל לבלב שהוסר בכ-2.5 מיליליטר של תמיסת קולגנאז. השתמשו במבחנות קוניות של 50 מיליליטר בנפרד על קרח כדי לשטוף את הלבלבנים. ראשית, העבירו כל לבלב למבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר המכילה 25 מיליליטר של קולגנאז.לאחר מכן, מקמיים את מבחנות הקונוס בנפח 50 milliliter המכילות את הלבלב במצב אנכי בתוך מקבץ מים רוטט בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, המסוגל להגיע ל-220 עד 250 RPM, כאשר המכשיר כבוי. כעת, מנפחים כל מבחנה קונוס בנפח 50 milliliter בגז המורכב מ-95% oxygen ו-5% carbon dioxide למשך חמש דקות.באמצעות פיפט פסטור, סגרו היטב כל מבחנה והניחו אותן בשכיבה בתוך אמבט מים רועד, מתחת לפני המים. החל מהדקה השישית, נערנו את המבחנות במהירות של 220 עד 250 RPM למשך 20 שניות בכל דקה שנייה, וזאת עד למשך 16 דקות. לאחר הנעורה, סובבו את המבחנות ב-400 עד 500 Gs בטמפרטורת החדר, תוך כיבוי מיידי של הצנטריפוגה ברגע שהיא הגיעה למהירות מלאה.בשלב הבא, מבלי להפריע למשקע, השתמשו בשואב ואקום כדי לשאוב כ-22.5 milliliters של תמיסת הקולגנאז מכל מבחנה. לאחר מכן, השביו את המשקעים ב-12.5 milliliter של HBSS ובצעו ערבול עדין במכשיר vortex כדי לפרק את המשקעים. לאחר שטיפה וערבול של התאים עם HBSS נוסף, שפכו כל תרחיף תאים דרך רשת של 1000 micron אל תוך מבחנות קוניות חדשות בנפח 50 milliliter.לאחר סבב ספינטר נוסף של תרחיפי התאים, השתמשו בשואב ואקום כדי לשאוב בזהירות את כל ה-HBSS מבלי להפריע למשקע. לאחר הסרת כל ה-HBSS, הוסיפו 4.8 milliliters של תמיסת 25%F לכל מבחנה. לאחר ערבוב ב-vortex לפירוק המשקע, מזקו בזהירות 2.4 milliliters של תמיסת 23%20.5%and 11%fial לאורך דופן המבחנה, תוך סיבוב המבחנה הקונית בנפח 50 milliliters.כדי להבטיח שכבה אחידה לאחר סבוב במערך צנטריפוגה של תמיסת ה-FI call, שפכו את כל תמיסת ה-FI call לפרוכת קונית חדשה בנפח 50 milliliter, תוך הקפדה להשאיר מאחור את המשקע של הרקמה האקסוקרינית. הוסיפו HBSS קר מאוד לפרוכת החדשה עד לסימון של 50 milliliter. לאחר מכן, סגרו את הפרוכת במכסה והפכו אותה ארבע עד שש פעמים.כדי לערבב את ה-FI call וה-HBSS יחד. השתמש במלכודת הוואקום כדי לשאוב בזהירות את רוב תערובת ה-HBSS מבלי להפריע למשקע הרפוי. לאחר מכן, העבר את המשקע למסביבב חדש.השתמשו בפיפטת פסטור כדי להעביר את הפתחי העין (eyelets) לתוך צלחת פטרי המכילה מצע גידול לפתחי עין, תוך הקפדה להימנע מהעברת שאריות רקמה של ASIN art. הניחו את צלחת הפטרי על מיקרוסקופ להכנה תחת תאורה אחורית.איילטים (eyelets) בריאים יהיו בעלי צורה כדורית ומרכז בצבע חום-זהוב עד חום כהה. אין להשתמש באיילטים המחוברים ל-ASIN או לרקמה, שייראו עמומים ואפורים, ויש להשליכם. בנוסף, יש להשליך איילטים גדולים יותר שפיתחו מרכז נמק כהה לאחר דגירה של לילה, שכן הם אינם מתפקדים כראוי.אם הכנת ה-eyelet מכילה כמות גדולה של פסולת, העבירו את ה-eyelets ידנית פעמיים לתוך מצע טרי, והוסיפו DNA למסדי העיכול כדי לסייע במניעת התגבשות של ה-eyelets. התחילו שלב זה על ידי גלגול ה-eyelets למרכז פטרי dish. באמצעות פיפטה P 20, העבירו את ה-eyelets לפטרי dish פוליסטירן חדש בגודל 15 מילימטר על 60 מילימטר המכיל חמישה מיליליטר של תמיסת קדם-דגירה כדי לשטוף את מצע השיתול המכיל גלוקוז מה-eyelets.לאחר מכן, השתמשו בפיפטה P 20 כדי להעביר לפחות 13 eyelets למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות המכילות מיליליטר אחד של בופר Krebs ringer bicarbonate טרי ומגוז, תוך שמירה על עקביות בגודל ה-eyelets בין המבחנות. לאחר דגירה של הדגימות ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 45 דקות, סגרו את המבחנות, בצעו ערבוב מהיר ב-vortex וסובבו את מבחנות הצנטריפוגה בצנטריפוגה שולחנית בטמפרטורת החדר עד ל-7,000 עד 7,500 Gs. אם יישום המשך רצוי הוא מדידת אינסולין או מטבוליט אחר, השתמשו בפיפטה P 1000 כדי לאסוף אליקוט של המצע למבחנת מיקרו-צנטריפוגה. אם אין צורך באיסוף מצעי הגירוי, ניתן להשליכם.השתמשו בפיפט P 1000 כדי להסיר את רוב תמיסת ה-Krebs מכל מבחנה למיקרוצנטריפוגה, כך שיישארו כ-10 עד 15 µL של Krebs על משקע העין. לאחר מכן, השתמשו בפיפט P 20 כדי להסיר את החלק הקרוב ביותר למשקע. לבסוף, כאשר נותרו פחות מ-10 עד 15 µL של Krebs על העין, הקפיאו במהירות את משקעי העין בחנקן נוזלי.לאחר מכן, יש לאחסן את הכדוריות שהקפיאו בהקפאה מהירה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למדידת ה-cyclic AMP. בדרך כלל, השפעתו של חומר על ייצור cyclic AMP נמצאת במתאם ישיר עם השפעתו על הפרשת אינסולין. בניסוי זה, איים מבודדים מעכברים מסוג Wildtype או עכברים עם נוק-אאוט גנטי גורו לגירוי באמצעות 11.1 מילימולר גלוקוז ו-cyclic תוך-תאי.נמדדה הפקת cAMP ונורמלה לחלבון התאי הכולל. אינסולין מופרש נמדד באמצעות אינסולין סטנדרטי, Eliza, ונורמל אף הוא לחלבון התאי הכולל. כצפוי, השינוי בהפקת cAMP קריאלי באופן ישיר עם העלייה בהפרשת אינסולין המעוררת גלוקוז.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם תהיו מסוגלים לבודד תרבית ולמדוד רמות של cyclic a ו-p בעקלי עיניים של עכברים בריאים.

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של דיסקציה הלבלב הדמיה פרוסה וירטואלית, ועל כימות הבאים של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב כולו.

ב כימות באתרו של המיסה הלבלב בטא תא עכברים

תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

איי הלבלב, המכונים גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצר הורמונים לוויסות גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. פרוטוקול זה מסביר שיטה לבידוד איי הלבלב על ידי החדרת קולגנאז תחילה דרך אמפולה של Vater כדי לעכל את רקמת הלבלב האקסוקרינית וצנטריפוגה הדרגתית צפיפות פשוטה כדי לטהר את האיים מעכברים.

בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור דימות וכימות הדינמיקה סידן באוכלוסיות תאים הטרוגנית, כגון תאים איון הלבלב. כתבים פלורסנט מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון, אשר לאחר מכן מאויית והתמונה, ועל ניתוח לתאים של הדינמיקה של עוצמת הניאון מבוצעת.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

למדו לבודד איילטים בריאים מלבלב עכבר ולמדוד רמות cAMP בתגובה לטיפולים ניסיוניים שונים. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד תאי בטא ותרומה למחקר הסוכרת.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

גלה סרטונים נוספים