מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השימוש בשיטת האור הפלואורסצנטי המתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים על ידי הדמיית חלקיקי HIV קטנים דינמיים המקיימים אינטראקציה עם תאי הלה מארחים. זה מושג על ידי ציפוי וגידול תאי הילה על רשת ה-EM של מוצא הזהב בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית והדבקת תאי הילה בחלקיקי GFP המסומנים כ-HIV אחד. השלב השני הוא לאסוף תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות של תאים נגועים ב-HIV, ולנתח את התמונות על ידי מעקב אוטומטי אחר חלקיקים תלת-ממדיים לדינמיקה של חלקיק בודד לאחר ויטריפיקציה.

הדגימה, אותם חלקיקים נגיפיים מנתוני הדמיית התאים החיים ממוקמים בתמונות פלואורסצנטיות קריו לניתוח טומוגרפיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה נוספת. השלב האחרון הוא לאסוף סדרות הקרנה של קריו EM מוטות עבור כל המיקומים המזוהים המכילים חלקיקי HIV אחד ולשחזר טומים תלת מימדיים עם אלגוריתם הקרנה אחורית משוקלל באמצעות תוכנת imad. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת של תאים חיים בקורלציה תלת מימדית וטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה משמשות להמחשה ישירה של חלקיקים נגיפיים מוגבלים של עקיפה דינמית והאינטראקציות שלהם עם תאים מארחים.

עבודתנו מכוונת לפיתוח שיטת מתאם המאפשרת הדמיה ישירה של אירועים בלבד של זיהום HIV אחד על ידי שילוב של תאים חיים פלואורסצנטיים כמו מיקרוסקופיה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קריו וטומוגרפיה קריו-אלקטרונית באופן זה, ניתן להשתמש באותות פלואורסצנטיים של תאים חיים וקריו כדי להנחות מאוד את הדגימה בטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. יתר על כן, ניתן להשלים מידע מבני המתקבל מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית עם הנתונים הפונקציונליים הדינמיים הזמינים באמצעות הדמיית אורח חיים של מטרות מסומנות פלואורסצנטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטה קיימת הוא שהדמיית אורח חיים תלת מימדית מתקדמת במהירות גבוהה עם גישת טומוגרפיה אלקטרונית תלת מימדית ברזולוציה גבוהה מיושמת לחקר אירועים דינמיים שמטבעם קשה לתפוס, כגון אינטראקציות HIV מסוג 1 ותאי מארח בשלב מוקדם של ההדבקה.

כדי להכין את הרשת לזוהר תרבית תאים פרוק את צד הפחמן של 200 רשת R שניים על שני רדיד קוונטי, רשת איתור EM זהב מתחת ל-25 מיליאמפר למשך 25 שניות. ציפוי רשת ה-EM בסיב נין על ידי הצפתו בצד הפחמן כלפי מטה על טיפה של 40 מיקרוליטר של 50 מיקרוגרם לתמיסת סיב נין מיליליטר. השאירו אותו במכסה המנוע של תרבית רקמות תחת אור UV למשך שעתיים לחיטוי תאי הלה על הרשת בצפיפות של שניים כפול 10 לתאים הרביעיים למיליליטר בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית.

ב-DMEM עם תוספים מתאימים, דגרו תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך כ-18 שעות לפני הדבקה ב-HIV לפני הדבקה ב-HIV, הוסיפו גשש תאים פלואורסצנטיים לתאי ההלה בצלחת התרבית עם תחתית הזכוכית ודגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר ספיגה של הצבע הפלואורסצנטי, שוטפים את התאים עם PBS ומוסיפים 50 מיקרוליטר של מדיום טרי חם מראש. הנח את הצלחת בתא התא החי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס של מיקרוסקופ סורק קונפוקלי שדה נסחף. מכיוון ש-cryo EM דורש אזורים דקים יחסית של המדגם.

בחר מספר שדות המכילים תא אחד עד שלושה תאים לריבוע כאשר התאים בין שני שלבי מיטוזה כאשר הם מפוזרים ביותר ואחסן את המיקומים הללו עם תוכנת רכיבי NIS להדמיה עתידית. לאחר מכן, הדביקו את התאים ב-VSVG, חלקיקי HIV מסוג פסאודו-1 המכילים G-F-P-V-P-R וחלקיקי הנגיף לבאר התחתונה של הצלחת, והקפידו לא להפריע לרשת ה-EM. מכיוון שהמיקומים להדמיה כבר נבחרו ואוחסנו מיד לאחר הוספת הגרסאות, אוספים תמונות קונפוקליות תלת מימדיות במהירות גבוהה במיקומים שנבחרו בעבר למשך 20 עד 40 דקות.

מיד לאחר הדמיית תאים חיים קונפוקלית, הנח את צלחת התרבית על גוש נחושת מקורר קרח והעביר אותה לחדר הכנת דגימות קריו EM. טען את רשת ה- EM על הפינצטה המתמחה, מחק במהירות את מדיום התרבות השיורי עם נייר סינון הנח מיד על הרשת למיקרוליטר של תמיסת חרוזי זהב 15 ננומטר מעורבבת עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות של 0.2 מיקרון. המיקרוספירות הפלואורסצנטיות משמשות לסיוע במתאם בין פלואורסצנטי לקריו-EM.

טען את הפינצטה על מכשיר הזיגוג להקפאת צלילה עם פרמטרי הספיגה המותאמים להשגת התוצאות הטובות ביותר. כדי להתחיל בהליך של מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי קריו, חבר קו גז חנקן יבש לשרוול המונח מעל עדשת המטרה כדי לשמור על העדשה חמה וללא כפור, הרכיב שלב דגימת פלואורסצנטי קריו ביתי על מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוך. חבר את כניסת החנקן הנוזלי של שלב דגימת הקריוס לעושה בלחץ עצמי והנח את יציאת ההגנה מפני הצפת חנקן נוזלי במיכל מתאים.

הנח את רשת הדגימה המיובשת הקפואה לתוך מחסנית דגימת ה-EM על גוש הנחושת, והנח טבעת קליפ C מקוררת מראש למעלה כדי לשמור על הרשת במקומה. הנח את המחסנית בתא הפנימי של חיפוש שלב הקריו ומצא את אותם חלקיקי וירוס מנתוני הדמיית התאים החיים. מכיוון שלרשת EM יש אינדקס, זה פשוט למקם את אותו חלקיק על הרשת הן בתמונות תאים חיים והן בתמונות פלואורסצנטיות קריו.

רכוש תמונות קריו DIC ופלואורסצנטיות במיקומים שזוהו בתנאי קריו באמצעות מיקרוסקופ אור עם עדשת אובייקט עבודה ארוכה. במהלך הדמיית הקריו הקריאו, בדוק מעת לעת את רמת החנקן הנוזלי בשלב הקריו ומלא אותו מחדש בעושה בלחץ עצמי לפי הצורך כדי לשמור על שלב הדגימה מתחת ל-170 מעלות צלזיוס שליליות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. טען את רשת הדגימה לתחנת העברת הקריו של מיקרוסקופ אלקטרונים המצויד באקדח פליטת שדה במצב חיפוש במינון נמוך בהגדלה של פי 140.

זהה את האזורים או ריבועי הרשת שבהם נרכשו תמונות פלואורסצנטיות קריו. הקלט תמונת קריו EM בהגדלה נמוכה של האזור המתאם ושמור את המיקום בקובץ במה במצב חיפוש במינון נמוך בהגדלה של פי 3, 500. הכנס חיפוש צמצם אובייקטיבי של 100 מיקרון ושמור את כל המיקומים המתואמים עם אותות GFP לקובץ שלב שני.

הגדר את פרמטרי הטומוגרפיה לרכישת סדרת הטיה, כולל טווח זווית הטיה, מינון אלקטרונים, ערך דה-פוקוס ותוכניות הטיה. רכוש סדרת הטיה עבור כל המיקומים השמורים כדי להתחיל בהליך זה. הגדר את החלון הראשי כך שניתן יהיה לכוונן או לעקוב אחר מספר שלבים של חישוב טומו גרהם בו זמנית, לשנות את הפרמטרים הדרושים ולבצע את התוכניות הספציפיות הנדרשות בכל שלב עיבוד.

בשלב הסופי, צור ערימה מיושרת מלאה עם שגיאה שיורית ראשית קטנה מ-0.6 ושחזר את טומס באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורית משוקלל. ב- Im mod כדי לאפיין את ההתנהגות הדינמית של חלקיקי הנגיף. תאי הלה הנגועים ב-HIV 1 צולמו על ידי מיקרוסקופ תאים חיים קונפוקליים במהירות גבוהה ותנועות החלקיקים נותחו על ידי מעקב חלקיקים תלת-ממדי אוטומטי.

באיור מייצג זה, חלקיק ויראלי פלואורסצנטי ירוק יחיד המסומן על ידי ראש החץ הצהוב היה במעקב בערימות קונפוקליות תלת מימדיות עם מרווח זמן של שלוש דקות בין פריימים כדי למנוע חלוף זמן של מספר דקות. זה יכול להתרחש בין איסוף תמונת התא החי הקונפוקלי האחרון לבין הקפאת צלילה. שלב מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי קריו תוכנן ונבנה להדמיית דגימות מיובשות קפואות בתוך מחסניות קריו EM.

במיקרוסקופים קלים פאנל A מציג עושה בלחץ עצמי מלא בחנקן נוזלי המשמש לקירור שלב דגימת קריוס הנחושת. פאנל B מציג את המבט הפנימי העליון של שלב הדגימה של הקריוס עם החדר הפנימי המסומן על ידי ראש החץ הלבן. רשת הדגימה מונחת על מחסנית הדגימה E EM, היושבת במרכז פלטפורמת בלוק נחושת המסומנת על ידי החץ השחור.

פלטפורמה זו נוספה לשימוש עם מיקרוסקופי אלקטרונים לא קוטביים. לאחר הטעינה ברשת הדגימה, המחסניות הועברו לתא הפנימי לאור פלואורסצנטי בוכה. לוחות מיקרוסקופיה C ו-D מציגים בהתאמה את מחסנית הדגימה לפני ואחרי הנחת טבעת נחושת כדי לשמור על הרשת במקומה לשימוש עם מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים לא קוטבי.

התועלת של ההליך למיקרוסקופ מתאם מתקדם של תאי חיים וטומוגרפיה קריו-אלקטרונית מודגמת עם הדמיה ישירה של חלקיקי HIV V המסומנים באופן פלואורסצנטי המקיימים אינטראקציה עם תא הילה מארח. תמונת DIC שהוקלטה עם שלב מיקרוסקופ אור קריו המוצגת בפאנל A מכוסה בתמונת פלואורסצנטיות קריו של חלקיקים מתויגים GFP המוצגים בפאנל B. החלקיקים המתויגים צבעוניים. לוחות אדומים C, D ו-E הם תמונות cryo-EM במינון נמוך של האזור המכיל חלקיק פלואורסצנטי מוקף בלוחות B ו-C ב-140 x 3, 500 x ו-27, 500 x בהתאמה.

הכניסה בפאנל E היא תצוגה מוגדלת שנרשמה לאחר רכישת לוחות סדרת ההטיה הטומוגרפית, FG ו-H מציגים שלוש פרוסות טומוגרפיות בעובי ארבעה ננומטר המופרדות במרחק של 21 ננומטר בכיוון Z. הקשרים בין החלקיק לקרום תא ההלו מסומנים על ידי חיצים הן בתמונת ההקרנה בכניסה והן בפאנל E ובפרוסות טומוגרפיות. בפאנלים F ו-g.

הצגנו קבוצה פשוטה של פרוטוקולים כדי לספק גישה מתאמת מתקדמת לניתוח אינטראקציות דינמיות של וירוסים וסטריליות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית של תאי ליפו קונפוקליים בזמן, ואחריה טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמתאם מדויק ואמין בין תמונה פלואורסצנטית לתמונת מיקרוסקופ האלקטרונים הוא קריטי לרכישה מוצלחת של טומוגרפיה אלקטרונית של עורב. נתונים שהליך זה המתואר יהיה שימושי ליישומים רבים הכוללים תהליכים תאיים דינמיים בביולוגיה של התא כגון הפנמת קולטני פני השטח של איתות תאים.