Name: מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: למד מיקרוסקופיה גומלת לניתוח מבני תלת-ממדי של אינטראקציות דינמיות בין חלקיקי HIV-1 לתאי HeLa. שיטה זו משלבת מיקרוסקופיית פלואורסצניה חיה עם טומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לטראוויס וילר ומכונת חנות במחלקה לביולוגיה של תא ופיזיולוגיה, אוניברסיטת פיטסבורג לבניית שלב מדגם cryo-הקרינה, Changlu טאו ונג שו באוניברסיטה למדע והטכנולוגיה של סין לטכנית סיוע, וד&quot;ר תרזה Brosenitsch לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (GM082251 &amp; GM085043).

1. תרבות הלה סלולרי על פחמן מצופה, זהב רשתות Finder EM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרשות זוהרות פחמן בצד של R2-200 רשת / 2 Quantifoil זהב EM Finder רשת מתחת לגיל 25 אמפר עבור 25 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל רשת EM עם פיברונקטין, על ידי אותו צף, פחמן בצד למטה, על רביב μl 40 מ&quot;ל של תמיסת פיברונקטין 50 מיקרוגרם /, ואחר כך לחטא אותו תחת אור UV במשך שעה 2 במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי הלה על גבי רשת בצפיפות של 2 x 10 4 תאים / מ&quot;ל (סה&quot;כ תרבות מ&quot;ל 2) בצלחת תרבות זכוכית תחתונה ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, DMEM בתוספת 4.5 G / L L-גלוטמין וגלוקוז, 10% חום מומת עוברי עגל בסרום, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, וסטרפטומיצין מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​100, לכ -18 שעות. תאים הלה נגועים אחרי תרבות O / N. </li></ol> 2. הידבקות ב-HIV-1 ו-Live-תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף גשש תא ניאון (אדום CMTPX, μl / 2 1 מ&quot;ל) לתוך תרבות זכוכית התחתונהצלחת (משלב 1.3) ו דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי לאפשר את קח של צבע פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף 50 בינונית טרי מחומם מראש μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על החדר לחיות התאים, על 37 מעלות צלזיוס, של מיקרוסקופ סורק Confocal Swept שדה. לבחור שדות מרובים (10-15 עמדות) המכילים תאים / רבוע 1-3, עם התאים בין שני שלבי מיטוזה כאשר הם רוב ההתפשטות החוצה ושטוח (ראה איורים 2 ג ו 2d), שכן cryoEM דורש אזורים קטנים יחסית של מדגם. אחסן את העמדות הללו להדמית עתיד (שלב 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים עם חלקיקי VSV-G פסאודו הוקלד HIV-1 המכילים GFP-VPR (אנו משתמשים 40 μl של מדגם המכיל 40 ng / ml של p24). כאשר מוסיפים את חלקיקי הנגיף לתחתית הצלחת, יש להיזהר שלא להפריע לרשת א&quot;מ, שכן העמדות להדמיה כבר נבחרו ומאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר תוספת של virions, לאסוף TIשלי לשגות תמונות במהירות גבוהה 3D confocal, בעמדות שנבחרו קודם לכן (משלב 2.3) דקות 20-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות confocal נרכשו באמצעות MetaMorph ונותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי לדינמיקת חלקיק יחידה באמצעות תוכנת Imaris (ראה איור 1). מכיוון שאנו נמצאים correlating ההתנהגות הדינמית של השתברות מוגבלת HIV-1 חלקיקים בעלי ultrastructure סלולרי, לחיות תאי הדמיה זמן לשגות ומעקב אחר חלקיקי 3D הם קריטיים לתוצאות. עם זאת, למבנה גדול וסטטית, תמונת הקרינה פשוט (בלי לחיות תאים) תהיה מספיק לניתוח גומל. </li></ol> 3. לדוגמא הכנת EM קפוא התייבשות כדי למזער את השהות בין האוסף של תמונת confocal האחרונה וcryo-הקיבעון של המדגם, Vitrobot פיי (או מכשיר vitrification אחר) צריך להיות יזם ומוכן לצעד-הקפאה באוסף של תמונות לחיות תאי confocal הקרינה.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התקן vitrification ולהגדיר טמפרטורת האקלים שלה ל -22 מעלות צלזיוס, לחות היעד ל -100%, בפעם סופג עד 7 שניות, ואת ההמתנה ולנקז עת לשנייה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תיבת האחסון ברשת דיואר הבוכנה ולהכין אתאן נוזל קר. הר דיואר על גבי מכשיר vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר לחיות תאי ההדמיה confocal (סעיף 2), מניח את צלחת התרבות על בלוק קרח נחושת מקורר ולהעביר אותו לחדר הכנת מדגם cryoEM. טען את רשת EM על גבי פינצטה מיוחדת ולמחוק במהירות את כל סוגי המדיה ברשת. סופג מתבצע באופן ידני, עם נייר סינון, שלאחריו 4 μl של פתרון חרוז זהב 15 ננומטר מעורבב עם 0.2 מיקרומטר microspheres ניאון ממוקמת מייד ברשת. את חרוזי הזהב משמשים כסמני fiducial לסייע אוסף טומוגרפית נתונים ויישור. Microspheres הניאון משמשות סיוע מתאם בין תמונות ניאון וcryoEM (ראה איורים 2 ג-2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פינצטה על מכשיר vitrification ולהורות למכשיר למחוק ולצלול בהקפאת אתאן הנוזלי 16. הפרמטרים הסופגים המותאמים להשגת התוצאה הטובה ביותר הם: זמן כתם, 7 שניות; כתם אופסט, 0; זמן ניקוז, 1 שניות; טמפרטורה, 22 מעלות צלזיוס, ולחות, 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשת קפוא התייבשות לבעל cryoEM הדמיה cryoET מיידית, או לאחסון חנקן נוזלי דיואר לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 4. מיקרוסקופ אור Cryo-הקרינה מערכת קאמרית בית בנוי, cryo-הקרינה מדגם ובמה (איור 3) נדרשה לבצע צעדים 4.1-4.10. התוכניות המפורטות והתיאור של השלב ניתן למצוא ביוני et al. -15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא חנקן נוזלי דיואר עצמי דחוס עם חנקן נוזלי לפחות 2 שעות לפני תחילת מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה (ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר cryo-F homebuiltשלב luorescence מדגם 15 (איור 3) על גבי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוכה, כגון אולימפוס IX 71. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כניסת החנקן הנוזלית של שלב cryo-המדגם לדיואר עצמי הדחוס ולמקם את שקע הגנת הצפת החנקן הנוזלי לתוך המכל מתאים. חבר קו גז חנקן יבש לשרוול ממוקם מעל עדשת המטרה לשמור על העדשה חמה וחופשי של כפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פלטפורמת גוש נחושת (חץ שחור באיור 3) לתוך תא cryo-השלב לטעינת רשת המדגם קפוא התייבשות. להתקרר ולמלא את התא של נחושת cryo-הבמה עם חנקן נוזלי דרך קו היניקה מדיואר המילוי עצמי בלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר cryo-השלב מגיע לטמפרטורת חנקן נוזלית (ב~ 4-6 דקות), להעביר את קופסא אחסון הרשת (משלב 3.5) לcryo-הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רשת המדגם קפוא התייבשות לתוך מחסנית דגימת EM ברחוב הנחושת וקליפ גרםלהיפטר במקום באמצעות C-טבעת (אם שימוש במחסנית מיקרוסקופ Polara), או למקם את טבעת נחושת מראש מקוררת על גבי (ראש החץ שחור באיור 3D), כדי לשמור את הרשת במקום וגם לאחזור קל של הרשת לאחר הדמיה cryo-הקרינה (אם למיקרוסקופ אלקטרונים cryo-הלא Polara). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המחסנית (משלב 4.6) בחדר הפנימי של cryo-השלב (לבן ראש החץ באיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפש ולמצוא את אותם חלקיקי וירוס מנתוני ההדמיה לחיות התאים. מאז רשת EM יש אינדקס, זה פשוט למקם אותו החלקיק על הרשת בשתי תמונות לחיות תאים ותמונות cryo-תפרחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות GFP cryo-DIC ובעמדות המזוהות תחת cryo-תנאי השימוש במיקרוסקופ אור עם עדשת מטרת עבודה ארוכה (2.7-4 מ&quot;מ). במהלך ההדמיה cryo-הקרינה, מעת לעת לבדוק את רמת החנקן הנוזלית בcryo-הבמה ולמלא אותו, לפי צורך, כדי לשמור על הבמה המדגם מתחת -170° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת ההדמיה cryo-הקרינה, יחזור בזהירות את מחסנית הדגימה לפלטפורמת בלוק הנחושת ולאחסן את המחסנית בחנקן נוזלי דיואר לניתוח cryoET עתיד עם מערכת Polara. אם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-הלא Polara, להסיר את טבעת הנחושת, לאחזר את רשת המדגם, למקם אותו בתיבת אחסון רשת, ולאחסן את הדגימה בחנקן נוזלי עד דיואר הדגימה נבדקה על ידי cryoET. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים, חופף את תמונות cryo-DIC וGFP הנרכשים (מצעד 4.9, ראה איור 4) ולתאם את עמדותיהם של אותות ה-GFP בתמונת cryo-הקרינה עם אלה שהושגו בסדרה לחיות תאי ההדמיה. </li></ol> 5. Cryo-טומוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחסנית המדגם לתחנת cryo-העברת מיקרוסקופ אלקטרונים מצוידים באקדח פליטת שדה, כגון מיקרוסקופ G2 Polara. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב במינון נמוך, חיפוש בהגדלה של 140X, IDEntify ולשמור את ריבועי הרשת הכלולות שלה (מצעד 4.11) לקובץ במה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, חיפוש בהגדלה של 3500 X, להוסיף 100 מיקרומטר אובייקטיבי צמצם, חיפוש ולשמור את כל העמדות המתואמות עם אותות GFP לתוך קובץ שלב שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוכה, חשיפה, מוצא את אזור ריק כדי להתאים את עוצמת קרן למינון של דואר 1 או 2 - / a 2 ולחדד את ציר ההטיה, באמצעות פונקצית y הבמה, על ידי שריפה משם הקרח באזור פחם לא חשוב עם כמה חרוזי זהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, פוקוס, להתאים את מרחק המוקד ל~ 3 מיקרומטר ולהתאים את הזווית כדי ליישר את הכיוון של התמקדות להיות מקביל לציר ההטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, חיפוש, זוכרים עמדות נשמרו (משלב 5.3), להתאים את גובה eucentric דגימה ולבדוק את טווח ההטיה לאזור של עניין. לרכוש תמונת הקרנה עם אלקטרונים במינון נמוך מאוד (1 ~ דואר - / a 2) בשעה 8 עד 10 מיקרומטר defocus, בexposמצב יור, כדי לאשר את חלקיקי נגיף בקורלציה לטומוגרפיה קריו אלקטרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב במינון נמוך, פוקוס. בתפריט פונקציות אוטומטי TEM, להקדים את גובה eucentric האוטומטי ולהתמקד בפונקציות את אזור המיקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הפרמטרים לרכישה להטות-Series. לאיור 4 במאמר זה, זוויות הטיה החל ± 70 מעלות, מתחת ומעל 45 מעלות, בגיל 3 ו -2 ° ° מרווחי הטיה, בהתאמה, היו בשימוש, עם 6 מיקרומטר defocus וכ 70 דואר - מינון כולל של 2 /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.7 ו -5.8 לכל העמדות שנשמרו. תוכנת טומוגרפיה אצווה יכולה לשמש לאיסוף נתונים אוטומטי במספר עמדות כדי להגדיל את התפוקה. </li></ol> 6. שחזור תלת ממדי באמצעות IMOD 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הסדרה להטות הגולמית כדי להתאים את ערכי צפיפות המינימום ומקסימום ולקבוע אם יש כל תצוגה שלא להיכלל בשל שינוי תמונה גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל eTomo ופנל tomogram התקנת שימוש בסוג ציר, גודל פיקסל, קוטר fiducial, וכו &#39;. לאחר מכן ליצור תסריטי com. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החלון הראשי כך שיכולים להיות מותאמים בכמה שלבים של חישוב tomogram / אחריו בו זמנית. שנה את הפרמטרים הדרושים ולבצע את התוכניות הספציפיות הנדרשות על ידי כל צעד בתהליך (ראה שיעור eTomo, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הסופי, ליצור ערימה מיושרת מלאה (עם שגיאת שיורי ממוצע פחות מ 0.6) ולשחזר tomograms באמצעות אלגוריתם בחזרה הקרנה משוקלל בIMOD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denoise אזורים פוטנציאליים של עניין באמצעות תכנית 3D קוי אניסוטרופי דיפוזיה קצה שיפור מיושמת בIMOD עם פרמטרים מתאימים כדי לשפר את החדות והבהירות. </li></ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
<li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li>
<li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li>
<li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015(2008).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84(2009).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li>
<li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li>
<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו הצגנו סדרה פשוטה של ​​פרוטוקולים כדי לספק גישה גומלת מתקדמת כדי לנתח את האירועים הסלולר דינמיים באמצעות זמן לשגות הדמיה confocal, לחיות תאי הקרינה ואחרי cryoET. ההתפתחות המתודולוגית שלנו כדי לתאם לחיות תאי ההדמיה 3D עם cryoET ברזולוציה גבוהה היא קריטית כדי לחקור בעיות ביולוגיות מאתגרות רבות, כגון חזותי (לא סטטי, כפי שדווח בעבר), וחלקיקים נדירים, דינמיים עקיפה מוגבלים נגיפיים והאינטראקציות שלהם עם תאי מארח . התנהגות המרחב ובזמן של חלקיקים ספציפיים בתאי חיים מאופיין בניתוח תא...

Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) היא טכניקת הדמיה רב עוצמה המאפשרת הדמיה (3D) תלת ממדית של תאים ורקמות ומספקת תובנות לארגון של האברונים ילידים ומבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית למצב פיסיולוגי קרוב 1. עם זאת, בניגוד מיסוד הנמוך של דגימה קפוא התייבשות בלא כתם, בשילוב עם הרגישות לקרינה שלהם, הופך אותו לקשה לאתר תחומי העניין בתוך תא, ולאחר מכן ביצוע סדרת ההטיה בהצלחה מבלי לפגוע באזור היעד. על מנת להתגבר על בעיות אלה, גישה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופ אור ואלקטרונים היא הכרחית. תכונות ספציפיות מודגשות על ידי ניאון תיוג מזוהים וממוקמות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, ולאחר מכן את הקואורדינטות שלהן מועברות למיקרוסקופ האלקטרונים לרכישת נתונים 3D מבניים ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת גומלת איתור היעדreas של עניין לטפל. בשל הגבלה על עובי מדגם עם cryoEM (&lt;300 ננומטר), כיום רק את אזורי הפריפריה של התא מתאימים לניתוח מבנים על ידי 3D CryoET. בהמשך הפחתת העובי של דגימות קפוא hydrated על ידי זגוגית חתך 8 או על ידי cryo-אלומת יונים ממוקד (FIB) טחינה 9 הייתי להרחיב את היכולת של הדמיה גומלת. בעבר, שיטות גומלות היו בשימוש בעיקר כדי להקל על רכישת cryoET נתונים למבנים גדולים וסטטי 10-13. במחקרים אלה, cryo-שלבים יושמו לקבל רשתות cryoEM ולהתאים אותו גם מיקרוסקופ זקוף או מיקרוסקופ הפוכה 10,11,14. למרות מיתוג רשתות נראה פשוט למדי בעיצובים שלהם, יש העברה נוספת מעורבים לרשת EM צעדים, מגדיל את הסיכוי שהרשת עשויה להיות מעוות, פגומות ומזוהמת. לאחרונה הפגינו התקדמות טכנית במיקרוסקופיה המצטרפת שמאפשרת לנו לדמיין באופן ישיר אירועים דינמיים במהותם קשה לתפוס, כגון אינטראקציות תא מארחות HIV-1 ובשלבים מוקדמים של זיהום 15. אנחנו עשינו זאת על ידי תכנון ויישום שלב מדגם מיקרוסקופיה קריו אור שמתאים את עצמו מערכת מחסנית כדי למזער את נזק הדגימה עקב טיפול רשת, ובכך להקל מתאם. העיצוב שלנו כולל בעל מחסנית דגימה משולב, המאפשר גם מיקרוסקופיה קריו האור ואלקטרוני cryo-להתבצע, ברצף, באותו בעל דגימה, ללא העברת דגימה, ובכך לייעל את תהליך ההיווצרות. בנוסף, אנחנו גם יישמנו הליך התאמה מדויקת ואמין באמצעות חרוזים לטקס ניאון כסמני fiducial.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם L-גלוטמין</td><td>אטלנטה ביולוגית, בע"מ לורנסוויל, ג'ורג'יה</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמה, סנט לואיס, מיזורי</td><td>F1141-1MG</td><td>תרבית תאי HeLa על רשתות EM</td></tr><tr><td>גשש תאים</td><td>Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה</td><td>C34552</td> חלבון <td>CMTPX אדום</td></tr><tr><td>מצומד</td> <td>זהבטד פלה, בע"מ, רדינג, קליפורניה</td><td>15822-1</td><td>קוטר 15 ננומטר</td></tr><tr><td>0.2 &mu; m מיקרוספירות פלואורסצנטיות</td><td>Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה</td><td>F8811</td><td>פלואורסצנטי צהוב-ירוק</td></tr><tr><td>סרום בקר עגל עוברי מומת בחום</td><td>Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen Corporation, קרלסבד, קליפורניה</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית עם תחתית זכוכית</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>זהב quantifoil finder רשתות EM</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, גרמניה</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >Equipment</td></tr><tr><td>Glow-Discharge device 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים Tecnai Polara G2 עם אקדח פליטת שדה</td><td>FEI, הילסבורו, או</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, הילסבורו, או</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס IX 71 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס אמריקה בע"מ, סנטר ואלי, פנסילבניה</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (מרחק עבודה 2.7-4 מ"מ) עדשת אובייקטיבית</td></tr><tr><td>Nikon TiE Nikon Instruments</td><td>, Melville, NY</td><td></td><td>באמצעות עדשת אובייקט טבילה בשמן 60X/1.35 NA</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי Sweptfield</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit תא סלולרי חי</td><td>טוקיו, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שלב דגימה קריו-פלואורסצנטי</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>נבנה על ידי חנות מכונות, ראה התייחסות 15 לעיצוב.</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3d של אינטראקציות דינמיות

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) מאפשרת הדמיה 3D של מבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית במצב קרוב לפיסיולוגי 1. עם זאת, להדמיה ישירה של מתחמים נגיפיים בודדים בסביבה התאית שלהם עם מארח cryoET מאתגרת 2, בשל האופי נדיר ודינמי של כניסת ויראלי, במיוחד במקרה של HIV-1. בעוד לחיות תאי הדמיה זמן לשגות הניבה מידע רב על היבטים רבים של המחזור של 3-7 HIV-1 החיים, המוענקת על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה לחיות תאים הוא מוגבל (~ 200 ננומטר). העבודה שלנו הייתה במטרה לפתח שיטת מתאם המאפשרת הדמיה ישירה של אירועים המוקדמים של HIV-1 זיהום על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור ניאון לחיות תאים, מיקרוסקופיה קריו פלורסנט, וcryoET. באופן זה, ניתן להשתמש באותות בתאים חיים וcryo-ניאון כדי להנחות את הדגימה בcryoET במדויק. יתר על כן, מידע מבני מתקבל מcryoET יכול בהדואר השלים עם הנתונים הפונקציונליים הדינמיים שנרכש דרך לחיות תאי הדמיה של היעד מסומן ניאון. במאמר זה וידאו, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים מפורטות לחקירה מבנית של HIV-1 ואינטראקציות מארח תאים באמצעות הדמיה 3D גומלת במהירות גבוהה תאי חיים וניתוח מבני ברזולוציה גבוהה cryoET. תאים הלה נגועים בחלקיקי HIV-1 אופיינו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה confocal לחיות תאים, ובאזור המכיל אותו החלקיק הנגיפי נותח ולאחר מכן על ידי טומוגרפיה קריו אלקטרון לפרטים מבניים 3D. המתאם בין שני סטים של נתוני הדמיה, דימות אופטי ואלקטרוני הדמיה, הושג באמצעות שלב מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה בבנייה עצמית. הגישה המפורטת כאן תהיה בעל ערך, לא רק למחקר של אינטראקציות תא מארח, וירוס, אלא גם עבור יישומים רחבים יותר בביולוגיה של תא, כגון, סחר בקולט קרום תא איתות, ועוד רבים תהליכים תאיים דינמיים אחרים. &lt;/ P&gt;

כדי לאפיין את ההתנהגות הדינמית של חלקיקי הנגיף, תאי הלה עם HIV-1 היו צילמו על ידי מיקרוסקופ לחיות תאי confocal במהירות גבוהה ותנועות החלקיקים נותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי (איור 1). כדי להימנע מהפער הזמנים של כמה דקות שיכולים להתרחש בין אוסף של התמונה לחיות התאים שעבר confocal ולקפוץ למים קפוא, (שיכול להיות ארוך מספיק כדי לאבד חלקיקים מתואמים HIV-1), שלב מיקרוסקופ אור cryo-פלואורסצנטי (איור 3 ) תוכנן ונבנה עבור הדמיה דגימות קפוא hydrated...

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את השימוש בשיטת מיקרוסקופיה קורלטיבית של אור פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryo-EM) באמצעות דימוי של חלקיקי HIV-1 קטנים ודינמיים המקיימים אינטראקציה עם תאי HeLa של המארח. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעה וגידול של תאי HeLa על רשת EM מסוג gold finder בתוך כלי תרבית בעגית בעלת תחתית זכוכית, והדבקת תאי HeLa בחלקיקי HIV-1 המסומנים ב-GFP. השלב השני הוא איסוף תמונות קונפוקליות של תאים חיים בתלת-ממד במהירות גבוהה ובשיטת time-lapse של תאים נגועי HIV-1, וניתוח התמונות באמצעות מעקב אוטומטי אחר חלקיקים בתלת-ממד לבחינת הדינמיקה של חלקיקים בודדים לאחר vitrify.הדגימה, אותם חלקיקים ויראליים מנתוני דימות תאי חיים, ממוקמת בתמונות פלואורסצנציה קריו-גניות לצורך ניתוח קריו-טומוגרפיה אלקטרונית בתלת-ממד ברזולוציה גבוהה. השלב הסופי הוא איסוף סדרות היטלי cryo EM מוטות עבור כל המיקומים שזוהו ככוללים חלקיקי HIV-1, ושחזור טומוגרמות תלת-ממדיות באמצעות אלגוריתם weighted back projection בתוכנת imad. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת של תאי חיים במתאם (correlative) וקריו-טומוגרפיה אלקטרונית ברזולוציה גבוהה משמשות לוויזואליזציה ישירה של חלקיקים ויראליים דינמיים במגבלת דיפרקציה והאינטראקציות שלהם עם תאי המארח.עבודתנו מכוונת לפיתוח שיטת קורלציה המאפשרת ויזואליזציה ישירה של אירועי זיהום ב-HIV-1 בלבד. באמצעות שילוב של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בקריו (cryo fluorescent microscopy) וטומוגרפיה אלקטרונית בקריו (cryo-electron tomography) באופן זה, ניתן להשתמש באותות פלואורסצנטיים של תאים חיים ובקריו כדי להנחות באופן משמעותי את הדגימה בטומוגרפיה אלקטרונית בקריו. יתרה מכך, ניתן להשלים מידע מבני שהתקבל מטומוגרפיה אלקטרונית בקריו עם נתונים תפקודיים דינמיים הזמינים באמצעות דימות של תאים חיים של מטרות מסומנות פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו או של השיטה הקיימת הוא יישום של גישת דימות תלת-ממדי דינמי מהיר וקורלטיבי עם טומוגרפיה אלקטרונית בקריו תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה, במטרה לחקור אירועים דינמיים שקשה לתפוסם מטבעם, כגון אינטראקציות בין HIV-1 לתאי המאכסן בשלב מוקדם של הזיהום.כדי להכין את הרשת לתרבית תאים, בצע פריקה חשמלית (glow discharge) לצד הפחמן של רשת quanti foil מסוג R 2/2 בנקב 200, עם ציפוי זהב, תחת זרם של 25 mA למשך 25 שניות. צפה את רשת ה-EM ב-fibronectin על ידי הצפתה, כאשר צד הפחמן פונה כלפי מטה, על טיפה של 40 µL של תמיסת fibronectin בריכוז 50 µg/mL. השאר את הרשת במCקת תרביות תאים תחת אור UV למשך שעתיים לצורך חיטוי. זרע תאי HeLa על הרשת בצפיפות של 2×10⁴ תאים למל׳ בתוך צלחת תרבית עם תחתית זכוכית.בתוך DMEM עם תוספים מתאימים, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך כ-18 שעות לפני ההדבקה ב-HIV 1. לפני ההדבקה ב-HIV, הוסיפו למשבצת התאים של HeLa בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית מעקב תאים פלואורסצנטי (fluorescent cell tracker) ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות כדי לאפשר את ספיגת הצבע הפלואורסצנטי. שטפו את התאים ב-PBS והוסיפו 50 µL של מצע טרי שחומם מראש. הניחו את הצלחת בתא תאים חיים בטמפרטורה של 37 °C של מיקרוסקופ סריקה קונפוקלית מסוג swept field. מכיוון ש-cryo EM דורש אזורים דקים יחסית של הדגימה.בחר מספר שדות המכילים תא אחד עד שלושה תאים לריבוע, כאשר התאים נמצאים בין שני שלבי מיטוזה בזמן שהם הפרוסים והשטוחים ביותר; שמור מיקומים אלו באמצעות תוכנת ה-NIS element לצורך הדמיה עתידית. לאחר מכן, הדבק את התאים בחלקיקי HIV-1 מסוג pseudo-typed VSVG המכילים GFP-VPR, והחדר את חלקיקי הווירוס לתחתית הבאר של הצלחת, תוך הקפדה שלא להפריע לרשת ה-EM. מכיוון שמיקומי ההדמיה כבר נבחרו ונשמרו, אסוף מיד לאחר הוספת הווירוסים תמונות confocal תלת-ממדיות במהירות גבוהה בשיטת time-lapse במיקומים שנבחרו קודם לכן, למשך 20 עד 40 דקות.מיד לאחר דימוי תאי חיים במיקרוסקופ קונפוקאלי, הניחו את צלחת התרבית על גבי בלוק נחושת מקורר בקרח והעבירו אותה לחדר להכנת דגימות cryo EM. טענו את רשת ה-EM על פינצטה ייעודית, ספגו במהירות את שאריות מצע התרבית בעזרת נייר סינון, והניחו מיד על הרשת מספר מיקרוליטרים של תמיסת חלקיקי זהב בגודל 15 nm המעורבבת עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות בגודל 0.2 µm. המיקרוספירות הפלואורסצנטיות משמשות לסיוע בביצוע קורלציה בין הפלואורסצנציה ל-cryo-EM.העמיסו את הפינצטה על מכשיר הוויטריפיקציה להקפאה מהירה (plunge freezing), כאשר פרמטרי הספיגה (blotting) מותאמים להשגת התוצאות הטובות ביותר. כדי להתחיל בהליך למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קריוגנית, חברו קו גז חנקן יבש לשרוול הממוקם מעל עדשת העדשה כדי לשמור על העדשה חמה ונקייה מקריסטלי קרח, והרכיבו במהירות במה של דגימות קריו-פלואורסצנטיות שהוקמה במעבדה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. חברו את כניסת החנקן הנוזלי של במה דגימות הקריו למספק הלחץ העצמי, והניחו את יציאת הגנת הגלישה של החנקן הנוזלי בתוך מכל מתאים.הניחו את רשת הדגימה המהומה והקפואה לתוך מחסנית הדגימות של ה-EM על גבי בלוק הנחושת, והניחו מעליה טבעת C-clip שקודמה קירורה כדי לשמור על הרשת במקומה. הניחו את המחסנית בתא הפנימי של שלב הקירור (cryo stage), חפשו ואתרו את אותן חלקיקי וירוס מנתוני הדימוי של התאים החיים. מכיוון שלרשת ה-EM יש אינדקס, קל לאתר את אותו החלקיק על הרשת הן בתמונות התאים החיים והן בתמונות הפלואורסצנציה בקירור.רכשו תמונות fluorescence ו-cryo DIC במיקומים שזוהו תחת תנאי קירור (cryo) באמצעות מיקרוסקופ אור עם עדשת יענית בעלת מרחק עבודה ארוך. במהלך דימות ה-fluorescence בקירור, בדקו מעת לעת את מפלס החנקן הנוזלי בבמה המקוררת ומלאו אותו בעזרת מתקן בלחץ עצמי לפי הצורך, כדי לשמור על במת הדגימה בטמפרטורה נמוכה מ-170- מעלות צלזיוס עבור טומוגרפיה אלקטרונית בקירור (cryo-electron tomography). טענו את רשת הדגימה לתחנת ההעברה בקירור של מיקרוסקופ אלקטרונים המצויד ב-field emission gun במצב חיפוש במינון נמוך (low dose) בהגדלה של 140x.זהו את האזורים או את ריבועי הרשת שבהם נרכשו תמונות פלואורסצנציה בקריו. רשום תמונת cryo EM בהגדלה נמוכה של האזור המתואם ושמור את המיקום בקובץ במה שלב (stage file) תחת מצב חיפוש במינון נמוך בהגדלה של 3,500 x. הכנס מפתח אובייקטיבי (objective aperture) של 100 מיקרון לחיפוש ושמור את כל המיקומים המתואמים עם אותות GFP בקובץ שלב שני.הגדירו את פרמטרי הטומוגרפיה לרכישת סדרת הטיה, כולל טווח זוויות ההטיה, מינון האלקטרונים, ערך הדיפוקוס (defocus) ותוכניות ההטיה. רכשו סדרת הטיה עבור כל המיקומים השמורים כדי להתחיל בהליך זה. הגדירו את החלון הראשי כך שניתן יהיה לכוון או לעקוב אחרי מספר שלבים בחישוב ה-Tomo Graham בו-זמנית, שנו את הפרמטרים הדרושים והריצו את התוכניות הספציפיות הנדרשות לכל שלב בעיבוד.בשלב הסופי, צור ערימה מיושרת מלאה עם שגיאה שאריתית ראשית הפחותה מ-0.6 ושחזר את ה-Toms באמצעות אלגוריתם של הקרנה אחורית משוקללת. במצב Im כדי לאפיין את ההתנהגות הדינמית של חלקיקי נגיף. תאי Hela שהודבקו ב-HIV 1 נסרקו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מהירה של תאים חיים, ותנועת החלקיקים נותחה באמצעות מעקב אוטומטי של חלקיקים בתלת-ממד.בדמות מייצגת זו, חלקיק ויראלי בולט בفلורסצנציה ירוקה, המסומן על ידי חץ צהוב, נסר בערמות קונפוקאליות בתלת-ממד עם מרווח זמן של שלוש דקות בין פריימים, כדי למנוע את השיהיית הזמן של מספר דקות שעלולה להתרחש בין איסוף התמונה החיה האחרונה של התאים במיקרוסקופ קונפוקאלי לבין הקפאה מהירה (plunge freezing). במה של מיקרוסקופיה פלורסצנטית קריוגנית תוכננה ונבנתה לצורך הדמיה של דגימות קפואות מהידרטריות בתוך מחסניות cryo EM.במיקרוסקופים של אור, פאנל A מציג מיכל בלחץ עצמי ממול בחנקן נוזלי המשמש לקירור של במה ה-cryos לנשיאת דגימות נחושת. פאנל B מציג מבט מלמעלה אל תוך במת הדגימות cryos, כאשר התא הפנימי מסומן על ידי ראש חץ לבן. רשת הדגימה מונחת על מחסנית הדגימות E EM, השוכנת במרכז פלטפורמת בלוק נחושת המסומנת על ידי החץ השחור.פלטפורמה זו נוספה לשימוש עם מיקרוסקופים אלקטרוניים לא-פולריים. לאחר טעינת רשת הדגימה, המחסניות הועברו לתא הפנימי לצורך תאורת פלואורסצנציה קריוגנית. בלוחות המיקרוסקופיה C ו-D מוצגות, בהתאמה, מחסנית הדגימה לפני ואחרי הנחת טבעת נחושת לשמירה על מיקומה של הרשת לשימוש במיקרוסקופ אלקטרוני קריוגני לא-פולרי.התועלת של הפרוצדורה למיקרוסקופיה קורלטיבית מתקדמת של תאים חיים וטומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית מודגמת באמצעות הדמיה ישירה של חלקיקי HIV V1 המסומנים פלואורסצנטית בעת אינטראקציה עם תא HeLa של מארח. תמונת DIC שהוקלטה באמצעות שלב מיקרוסקופיה קריוגנית של אור, המוצגת בפאנל A, מונחת מעל תמונת פלואורסצנציה קריוגנית של חלקיקים המסומנים ב-GFP, המוצגת בפאנל B. החלקיקים המסומנים צבועים באדום. פאנלים C, D ו-E הם תמונות cryo-EM במינון נמוך של האזור המכיל חלקיק פלואורסצנטי המסומן במעגל בפאנלים B ו-C, בהגדלות של 140x, 3,500x ו-27,500x בהתאמה.ההגדרה בלוח E היא תצוגה מוגדלת שהוקלטה לאחר רכישת סדרות ההטיה הטומוגרפיות; לוחות FG ו-H מציגים שלושה פרוסות טומוגרפיות בעובי 4 ננומטר, המופרדות במרחק של 21 ננומטר בכיוון Z. קשרים בין החלקיק לממברנת תא ה-helo מסומנים בחצים הן בתמונת ההקרנה בהגדרה ובלוח E והן בפרוסות הטומוגרפיות. בלוחות F ו-g.הצגנו סט פשוט של פרוטוקולים כדי לספק גישה קורלטיבית מתקדמת לניתוח אינטראקציות דינמיות בין וירוסים לתאים סטריליים, תוך שימוש בדימוי פלואורסצנציה של תאי שומן במיקרוסקופ קונפוקלי בשיטת time lapse, ולאחריו טומוגרפיה אלקטרונית בקירור (cryo-electron tomography). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי קורלציה מדויקת ואמינה בין התמונה הפלואורסצנטית לתמונת המיקרוסקופיה האלקטרונית היא קריטית להשגה מוצלחת של טומוגרפיה אלקטרונית בקירור. הנתונים מההליך המתואר יהיו שימושיים ליישומים רבים הכוללים תהליכים תאיים דינמיים בביולוגיה של התא, כגון סיגנל תאי והפנמה של קולטני פני השטח.

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

כאן, אנו מציגים שיטה, cocem3D, לחשיפת המבנה האולטרה-מבני של תא ספציפי ברקמה הטבעית שלו על ידי גישור בין מיקרוסקופ אלקטרונים קונפוקלי וסדרתי.

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לדמיין ולמדוד טבעות אקטין ורכיבים אחרים של השלד התקופתי של הממברנה של המקטע הראשוני של האקסון באמצעות נוירונים היפוקמפליים חולדה מתורבתת ומיקרוסקופיית תאורה מובנית 3D (3D-SIM).

תכונות מדידה של השלד התקופתי של הממברנה של המקטע ההתחלתי של אקסון באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית בתלת-ממד (3D-SIM)

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית (DDM) משלבת תכונות של פיזור אור דינמי ומיקרוסקופיה. כאן מוצג התהליך של שימוש ב- DDM כדי לאפיין רשתות שלד ציטוסקטון משוחזרות על ידי כימות הדינמיקה התת-מפוזרת והכלוב של חלקיקים ברשתות וימנטין והתנועה הבליסטית של מרוכבים פעילים המונעים על ידי מיוזין אקטין-מיקרוטובול.

כימות דינמיקת שלד ציטוסקלטון באמצעות מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לבנות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל מטרה אחת ויריעות אור ואת השימוש בו להדמיית רשתות שלד.

תכנון ובנייה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית, חד-אובייקטיבי, עבור הדמיה של רשתות שלד ציטו-שלד

למד מיקרוסקופיה גומלת לניתוח מבני תלת-ממדי של אינטראקציות דינמיות בין חלקיקי HIV-1 לתאי HeLa. שיטה זו משלבת מיקרוסקופיית פלואורסצניה חיה עם טומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

גלה סרטונים נוספים