הכנת מדגם היסתולוגי למיקרוסקופיה קלה
היסתולוגיה היא חקר תאים ורקמות, אשר בדרך כלל נעזר בשימוש במיקרוסקופ אור. הכנת דגימות היסתולוגיות יכולה להשתנות במידה רבה בהתבסס על המאפיינים הטבועים ש…
היסתולוגיה היא מונח המתייחס לחקר האנטומיה המיקרוסקופית של רקמות ותאים. הכנת מדגם היסתולוגי נכונה למיקרוסקופיה קלה חיונית להשגת תוצאות איכותיות מדגימות רקמה.
ישנם 3 צעדים עיקריים המשותפים כמעט לכל ההליכים ההיסתולוגיים. ראשית, המדגם קבוע, על מנת לשמר את הרקמה ולהאט את השפלת הרקמות. לאחר מכן, המדגם שקוע בחומר, או במדיה משובצת, שיש לו תכונות מכניות דומות לעצמו. לאחר ההטבעה, המדגם מחולק, או חתוך, לפרוסות דקות באמצעות כלי חיתוך מדויק המכונה microtome. סרטון זה מתאר את השלבים הכלליים הללו ואת כמה מהמושגים הקשורים אליהם.
קיבוע רקמות הוא צעד קריטי המשמר רכיבי תאים ורקמות ושומר על המבנה שלהם. לאחר מות תאים, אנזימים טבעיים משתחררים אברונים תאיים ומתחילים לבזות את החלבונים ברחבי התא ואת המטריצה החוץ תאית, ובכך להרוס את מבנה התא. קיבעון מונע השפלה כזו על ידי עיכוב ישיר את היכולת של אנזימים אלה לעכל חלבון ועל ידי הפיכת אתרי מחשוף האנזים בלתי מזוהה.
שני המנגנונים העיקריים של קיבעון הם הצלבה וקשת. הצלבה כרוכה ביצירת קשר קוולנטי הן בתוך חלבונים והן ביניהם, מה שגורם לרקמה להקשיח ולכן להתנגד להשפלה. קרישה נגרמת על ידי התייבשות של חלבונים באמצעות אלכוהול או אצטון, אשר מעוותים את המבנה שלישוני חלבון, כך הידרופובי, או חשש מים, אזורים להזיז את פני השטח של החלבון. קיבוע קרישה יכול לעזור להטמיע מדיה, כמו שעוות פרפין, לחדור לרקמות.
אחד הקיבעוצים הנפוצים ביותר הוא פורמלין, שהוא פורמלדהיד מומס במים. במהלך הקיבעון, פורמלדהיד מתחבר אמינים ראשוניים, כגון אלה שנמצאו על שרשראות הצד של חומצות האמינו ליסין וגלוטמין כדי ליצור crosslink יציב שנקרא גשר מתאמלין. תהליך זה הוא איטי מטבעו והוא יכול לקחת עד 1-2 ימים.
לפני הקיבעון יש לעשות כמה שיקולים. ראשית, שקול את הדיפוזיה של המדגם. קיבועים יפוזר מרחק דרך רקמות בקצב הקשור מקדם דיפוזיה עבור הקיבוע מוכפל על ידי השורש הריבועי של הזמן. קיבוע שלוקח שעה לחדור 1 מ"מ לתוך המדגם ייקח 25 שעות לחדור 5 מ"מ. ברגע שפורמלין הגיע למרכז הרקמה, אדן התגובה הצולבת צריך להתרחש. לכן, גודל המדגם צריך להיות מוגבל ל 4 מ"מ בעובי לקיבעון יסודי בפרק זמן סביר.
שנית, שקול את הנפח ואת ה- pH של הקיבעון. יחס הנפח הקיבוצי לדגימה צריך להיות לפחות 40:1 כך שהריגנט לא יתרוקן בקלות לאורך זמן. בעוד כמה קיבועים נועדו לעבוד ב- pH חומצי, פורמלין עובד בצורה הטובה ביותר כאשר חוצץ עם פוספט כדי לשמור על pH נייטרלי, כך חומצה עודפת אינה מיוצרת, מה שגורם חפצים ברקמה.
השלב הבא בהכנה ההסתדרותית הוא הטמעה, הכוללת תמיכה בדגימות במדיה שיש לה קשיחות מכנית דומה לדגימה עצמה. בחירת אמצעי ההטבעה הנכון היא קריטית, מכיוון שאם הוא נוקשה מדי או חלש מדי, עלולים להתרחש פגמים בעת החתך. ללא ספק, המדיה הנפוצה ביותר המשמשת להטמעה היא שעוות פרפין.
לפני הטמעת פרפין, דגימות חייב להיות מיובש על ידי החלפת המים ברקמה עם אתנול, תחילה, ואחריו קסילן, ולאחר מכן סוף סוף חם שעוות פרפין. לאחר שעווה חדרה המדגם, הוא ממוקם בזהירות מוקף שעווה נוספת באמצעות עובש כדי ליצור בלוק. לאחר מכן, דגימות מחוברות לקלטת רקמות לחתך.
חיתוך הוא תהליך חיתוך פרוסות דקות של דגימה מבלוק הטבעה. המקטעים הם בדרך כלל על סדר של 4-10 מיקרומטר עבה לשימוש עם מיקרוסקופיה קלה.
כדי לחתוך חלקים, מתכת, זכוכית או להב יהלום מאובטחים תחילה על מיקרוטום. לאחר מכן, המדגם ממוקם במחזיק דגימה. לאחר מכן, המדגם מתקדם למשטח החיתוך ונמשך על פני הלהב כדי ליצור פרוסה של עובי הרצוי. מקטעים יצבו כסרטים דקים שניתן למקם על שקופיות זכוכית.
לאחר חתך טקסט, דוגמאות ממוקמות בשקופיות. עבור דוגמאות מוטבעות פרפין, פרוסות ממוקמות תחילה באמבט מים מחומם ולאחר מכן מורמות מהמים אל המגלשה ומותר להן להתייבש.
לרקמה ביולוגית יש מעט מאוד ניגודיות אינהרנטית, ולכן לאחר ההסתדרות, שקופיות מוכתמות בדרך כלל בצבעים או בנוגדנים המדגישים מורפולוגיה או חלבונים ספציפיים. הכתם הנפוץ ביותר שבוצע הוא המטוקסילין ואוסין, או H&E. מכיוון שזה נפוץ כל כך, מכונות אוטומטיות רבות נעשו כדי להכתים באופן רב חלקים רבים עם H.E. המטוקסילין מכתים את הגרעינים של תאים כחולים ו- eosin מכתים את ורוד הציטופלסמה החושף מורפולוגיה תאית של רקמות.
חיסרון אחד לקיבעון הוא כי הצלבה של חלבונים יכול לעשות את זה יותר עבור תיוג נוגדנים כדי למצוא את אתרי הכריכה שלהם. במקום להשתמש קיבעון כדי לשמר דגימות, הקפאה מהירה של רקמות, או הקפאת הצמד יכול לשמש, אשר מלווה טכניקת חתך הנקרא cryosectioning
דגימות רקמה מוטבעות ומכוונות למדיית הקפאה מיוחדת הנקראת OCT, או טמפרטורת חיתוך אופטימלית בינונית ולאחר מכן קפואה במהירות. בדומה למדיה הטמעה אחרת, OCT תואם את קשיחות המדגם.
cryomicrotome או cryostat, משמש לחיתוך קטעים קפואים מכשיר זה שומר על טמפרטורה פנימית של -20 מעלות צלזיוס כדי לשמור על להב חיתוך ודגימות קריר. בניגוד למקטעים המוטבעים בפרפין, ניתן להרים מקטעים קפואים ישירות על שקופית זכוכית טעונה חיובית מיד לאחר החתך.
דרך נוספת להימנע קיבעון היא באמצעות הטמעת אגר, שבו דגימות מכוסות אגרוז נוזלי מוכן טרי. כמו agarose מתקרר, זה נועל את הרקמה למקומו ועודף agarose ניתן לקצץ משם.
ויברטומים, חלופה נוספת למיקרוטום, יש להב כי רוטט וזז על פני מדגם אגורוז מוטבע. Vibrotomes משמשים ליצירת קטעים עבים בסדר גודל של 50-1000 מיקרומטר מדגימות משובצות אגרוז.
דגימות מוסרות בדרך כלל מן האגרוז לפני הכתם , ולאחר מכן להציב על שקופית מוקף חומר כגון שומן ואקום שמונע כיסויים ממכת המדגם. הם נצפים בצורה הטובה ביותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על מנת לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של כל קטע עבה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על הכנת דגימה היסתולוגית למיקרוסקופיה קלה.
עכשיו אתה צריך להבין את השלבים המעורבים להכנת מדגם כדי להביא אותך מחתיכת רקמה לחלק מוכתם. כמו תמיד, תודה שצפית!
היסתולוגיה היא מונח המתייחס לחקר האנטומיה המיקרוסקופית של רקמות ותאים. הכנת מדגם היסתולוגי נכונה למיקרוסקופיה קלה חיונית להשגת תוצאות איכותיות מדגימות רקמה.
ישנם 3 צעדים עיקריים המשותפים כמעט לכל ההליכים ההיסתולוגיים. ראשית, המדגם קבוע, על מנת לשמר את הרקמה ולהאט את השפלת הרקמות. לאחר מכן, המדגם שקוע בחומר, או במדיה משובצת, שיש לו תכונות מכניות דומות לעצמו. לאחר ההטבעה, המדגם מחולק, או חתוך, לפרוסות דקות באמצעות כלי חיתוך מדויק המכונה microtome. סרטון זה מתאר את השלבים הכלליים הללו ואת כמה מהמושגים הקשורים אליהם.
קיבוע רקמות הוא צעד קריטי המשמר רכיבי תאים ורקמות ושומר על המבנה שלהם. לאחר מות תאים, אנזימים טבעיים משתחררים אברונים תאיים ומתחילים לבזות את החלבונים ברחבי התא ואת המטריצה החוץ תאית, ובכך להרוס את מבנה התא. קיבעון מונע השפלה כזו על ידי עיכוב ישיר את היכולת של אנזימים אלה לעכל חלבון ועל ידי הפיכת אתרי מחשוף האנזים בלתי מזוהה.
שני המנגנונים העיקריים של קיבעון הם הצלבה וקשת. הצלבה כרוכה ביצירת קשר קוולנטי הן בתוך חלבונים והן ביניהם, מה שגורם לרקמה להקשיח ולכן להתנגד להשפלה. קרישה נגרמת על ידי התייבשות של חלבונים באמצעות אלכוהול או אצטון, אשר מעוותים את המבנה שלישוני חלבון, כך הידרופובי, או חשש מים, אזורים להזיז את פני השטח של החלבון. קיבוע קרישה יכול לעזור להטמיע מדיה, כמו שעוות פרפין, לחדור לרקמות.
אחד הקיבעוצים הנפוצים ביותר הוא פורמלין, שהוא פורמלדהיד מומס במים. במהלך הקיבעון, פורמלדהיד מתחבר אמינים ראשוניים, כגון אלה שנמצאו על שרשראות הצד של חומצות האמינו ליסין וגלוטמין כדי ליצור crosslink יציב שנקרא גשר מתאמלין. תהליך זה הוא איטי מטבעו והוא יכול לקחת עד 1-2 ימים.
לפני הקיבעון יש לעשות כמה שיקולים. ראשית, שקול את הדיפוזיה של המדגם. קיבועים יפוזר מרחק דרך רקמות בקצב הקשור מקדם דיפוזיה עבור הקיבוע מוכפל על ידי השורש הריבועי של הזמן. קיבוע שלוקח שעה לחדור 1 מ"מ לתוך המדגם ייקח 25 שעות לחדור 5 מ"מ. ברגע שפורמלין הגיע למרכז הרקמה, אדן התגובה הצולבת צריך להתרחש. לכן, גודל המדגם צריך להיות מוגבל ל 4 מ"מ בעובי לקיבעון יסודי בפרק זמן סביר.
שנית, שקול את הנפח ואת ה- pH של הקיבעון. יחס הנפח הקיבוצי לדגימה צריך להיות לפחות 40:1 כך שהריגנט לא יתרוקן בקלות לאורך זמן. בעוד כמה קיבועים נועדו לעבוד ב- pH חומצי, פורמלין עובד בצורה הטובה ביותר כאשר חוצץ עם פוספט כדי לשמור על pH נייטרלי, כך חומצה עודפת אינה מיוצרת, מה שגורם חפצים ברקמה.
השלב הבא בהכנה ההסתדרותית הוא הטמעה, הכוללת תמיכה בדגימות במדיה שיש לה קשיחות מכנית דומה לדגימה עצמה. בחירת אמצעי ההטבעה הנכון היא קריטית, מכיוון שאם הוא נוקשה מדי או חלש מדי, עלולים להתרחש פגמים בעת החתך. ללא ספק, המדיה הנפוצה ביותר המשמשת להטמעה היא שעוות פרפין.
לפני הטמעת פרפין, דגימות חייב להיות מיובש על ידי החלפת המים ברקמה עם אתנול, תחילה, ואחריו קסילן, ולאחר מכן סוף סוף חם שעוות פרפין. לאחר שעווה חדרה המדגם, הוא ממוקם בזהירות מוקף שעווה נוספת באמצעות עובש כדי ליצור בלוק. לאחר מכן, דגימות מחוברות לקלטת רקמות לחתך.
חיתוך הוא תהליך חיתוך פרוסות דקות של דגימה מבלוק הטבעה. המקטעים הם בדרך כלל על סדר של 4-10 מיקרומטר עבה לשימוש עם מיקרוסקופיה קלה.
כדי לחתוך חלקים, מתכת, זכוכית או להב יהלום מאובטחים תחילה על מיקרוטום. לאחר מכן, המדגם ממוקם במחזיק דגימה. לאחר מכן, המדגם מתקדם למשטח החיתוך ונמשך על פני הלהב כדי ליצור פרוסה של עובי הרצוי. מקטעים יצבו כסרטים דקים שניתן למקם על שקופיות זכוכית.
לאחר חתך טקסט, דוגמאות ממוקמות בשקופיות. עבור דוגמאות מוטבעות פרפין, פרוסות ממוקמות תחילה באמבט מים מחומם ולאחר מכן מורמות מהמים אל המגלשה ומותר להן להתייבש.
לרקמה ביולוגית יש מעט מאוד ניגודיות אינהרנטית, ולכן לאחר ההסתדרות, שקופיות מוכתמות בדרך כלל בצבעים או בנוגדנים המדגישים מורפולוגיה או חלבונים ספציפיים. הכתם הנפוץ ביותר שבוצע הוא המטוקסילין ואוסין, או H&E. מכיוון שזה נפוץ כל כך, מכונות אוטומטיות רבות נעשו כדי להכתים באופן רב חלקים רבים עם H.E. המטוקסילין מכתים את הגרעינים של תאים כחולים ו- eosin מכתים את ורוד הציטופלסמה החושף מורפולוגיה תאית של רקמות.
חיסרון אחד לקיבעון הוא כי הצלבה של חלבונים יכול לעשות את זה יותר עבור תיוג נוגדנים כדי למצוא את אתרי הכריכה שלהם. במקום להשתמש קיבעון כדי לשמר דגימות, הקפאה מהירה של רקמות, או הקפאת הצמד יכול לשמש, אשר מלווה טכניקת חתך הנקרא cryosectioning
דגימות רקמה מוטבעות ומכוונות למדיית הקפאה מיוחדת הנקראת OCT, או טמפרטורת חיתוך אופטימלית בינונית ולאחר מכן קפואה במהירות. בדומה למדיה הטמעה אחרת, OCT תואם את קשיחות המדגם.
cryomicrotome או cryostat, משמש לחיתוך קטעים קפואים מכשיר זה שומר על טמפרטורה פנימית של -20 מעלות צלזיוס כדי לשמור על להב חיתוך ודגימות קריר. בניגוד למקטעים המוטבעים בפרפין, ניתן להרים מקטעים קפואים ישירות על שקופית זכוכית טעונה חיובית מיד לאחר החתך.
דרך נוספת להימנע קיבעון היא באמצעות הטמעת אגר, שבו דגימות מכוסות אגרוז נוזלי מוכן טרי. כמו agarose מתקרר, זה נועל את הרקמה למקומו ועודף agarose ניתן לקצץ משם.
ויברטומים, חלופה נוספת למיקרוטום, יש להב כי רוטט וזז על פני מדגם אגורוז מוטבע. Vibrotomes משמשים ליצירת קטעים עבים בסדר גודל של 50-1000 מיקרומטר מדגימות משובצות אגרוז.
דגימות מוסרות בדרך כלל מן האגרוז לפני הכתם , ולאחר מכן להציב על שקופית מוקף חומר כגון שומן ואקום שמונע כיסויים ממכת המדגם. הם נצפים בצורה הטובה ביותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על מנת לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של כל קטע עבה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על הכנת דגימה היסתולוגית למיקרוסקופיה קלה.
עכשיו אתה צריך להבין את השלבים המעורבים להכנת מדגם כדי להביא אותך מחתיכת רקמה לחלק מוכתם. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.