Name: יישום של במבחנה Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: למדו לטהר את חלבון Dps מ-E. coli ולהעריך את יכולתו להגן על DNA מפני נזק חמצוני באמצעות אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הישרדות חיידקיים תחת לחץ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה למיקלה דה מרטינו, וילפרד ר &#39;הייגן, וKourosh Honarmand אברהימי לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק מימון מאוניברסיטת דלפט לטכנולוגיה.

1. ביטוי וטיהור DPS קבלת חלבון של טוהר גבוה היא צעד ראשון חיוני לassay-DNA הגנה. טיהור של חלבון DPS יכולה להתבצע ב4 עד 5 ימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך זן פרוטאז לקוי של א &#39; coli (כגון BL21 (DE3) pLysS) עם וקטור PET (כגון pET17) שלתוכו רצף חלבון קידוד DPS כבר משובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס הפך את תאים לצלחות מרק לוריא (LB) אגר המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (כמו אמפיצילין וchloramphenicol לדוגמות שסופקו ב1.1). דגירה צלחות הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת מהצלחת לתוך 30 מ&quot;ל של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב 200-250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 2 מדיום LB L 1 X המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם 10 כל אחד מתרבות לילה מ&quot;ל. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, ואילו רועד, לקוטר 600 </תת&gt; של כ 0.6. (גידול תאים לתשואת חלבון עליות OD גבוהה יותר, מבלי להתפשר באופן ניכר על טוהר של המוצר הסופי.) לגרום ביטוי של DPS על ידי הוספת IPTG לריכוז של 0.3 מ&quot;מ, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 3-4 בזמן רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 6000 במשך 15 דקות. Resuspend את כדורי התא ב7.5 מ&quot;ל של חיץ DEAE (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 100 מ&quot;מ NaCl, 0.1 מ&quot;מ EDTA) לכל ליטר של תרבית תאים מושרה. דוגמאות ניתן להקפיא בחנקן נוזלי ומאוחסנות ב -80 ° C, אם תרצה בכך. ההליך לאחר מכן ניתן להמשיך על ידי הפשרת הדגימות באמבט מים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תערובת של מעכבי פרוטאז (כגון מעכבי פרוטאז Calbiochem סט שלישי, ב0.167 μl לכל מ&quot;ל של השעיה תא) להשעית התא כדי למנוע השפלה של DPS overexpressed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמצית תא ללא שימוש בעיתונות צרפתית. ראש העיתונות הצרפתית עם 20 מ&quot;ל DEAE מאגר (אם משתמש במודל זרימה רציפה), ואז disrupלא מדגם פעמיים ב 20 KPSI. צנטריפוגה XG lysate ב30,000 עבור 35 דקות ב 4 ° C כדי להבהיר חלקיקים מסיסים, ולשמור את supernatant. Supernatant אז יכול להיות קפוא באמצעות חנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 ° C, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודת 30 מיליליטר DEAE Sepharose CL-6B עם DEAE הצפת, באמצעות FPLC. הפעל חיץ דרך העמודה ב1-2 מ&quot;ל / דקה עם לחץ מקסימאלי של 0.2 מגפ&quot;ס על רקע. טען את תמצית תא ללא על הטור, ומתחיל לאסוף את הזרימה דרך פעם אחת את אות OD 280 מתחילה לעלות מעל קו בסיס. לשטוף את העמודה עם DEAE הצפת ערך OD עד 280 חוזר לנקודת התחלה, תוך איסוף הזרימה דרך ברציפות. זרימה דרך אמור להכיל את רוב חלבון DPS, ללא תשלום מ-DNA המאוגד. לשטוף את העמודה עם 100% הצפת B (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 1 M NaCl, 0.1 mM EDTA). eluate זה מכיל מתחמי DPS-DNA כמו גם חלבונים אחרים, ויכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המודעהditional מזהם חלבונים באמצעות ממטרים אמוניום סולפט. לקבוע את עוצמת הקול של נקווה זרימת הדרך. לאט לאט (על פני תקופה של 10-20 דקות) להוסיף אמוניום סולפט קטן תבואה היבשה לרוויה 62% (390 מ&quot;ג לכל מ&quot;ל של תמיסה) ב 4 ° C תוך ערבוב טוב. מערבבים את התערובת במשך 20-30 דקות נוספות לאחר הוספת החלק האחרון של אמוניום סולפט כדי להבטיח איזון מלא. DPS יישאר מסיס, ואילו חלבונים מזהמים יהיו לזרז את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלבונים זרזו ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C ולשמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף אמוניום סולפט 227 מ&quot;ג נוסף לכל מ&quot;ל של supernatant להגיע 94% רוויה ומערבבים במשך 20-30 דקות על מנת להבטיח איזון מלא. DPS משקעים בריכוז מלח גבוה וזה יכול להיות שנאסף על ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 עבור 30 דקות ב 4 ° C. DPS יהיה בגלולה; יכול להיות מושלך supernatant. ניתן לאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס אם desired. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה המכילה-DPS במאגר resuspension (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl, 0.1 mM EDTA). התאם את נפח הדגימה של 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ חילופי להסיר אמוניום סולפט באמצעות עמודת סינון PD-10 ג&#39;ל. לאזן מיטת ג&#39;ל עם 25 הצפת resuspension מ&quot;ל. החל מ&quot;ל של 2.5 מדגם DPS לחלק העליון של PD-10 העמודה ולאפשר לו לספוג פנימה מחק את הזרימה דרכו. לאסוף DPS על ידי משחררי עם 3.5 הצפת resuspension מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם-החליף חיץ XG 16,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את כל רכיבים מסיסים, ולדלל אותו עם 6-10 חיץ דילול מ&quot;ל (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 0.1 mM EDTA) על מנת להבטיח כי ריכוז המלח הוא נמוך מספיק בשביל DPS להיקשר לעמודת Sepharose SP. דגימות במיוחד מרוכזות של DPS עשויות להיות פחות מסיסה על דילול לתוך מאגר התחתון מלח, כפי שמעיד עננות של הנוזל, אך ניתן resolubilized לחלוטין על ידי התוספת של amou קטןNT של פתרון 5 M NaCl (10-20 מ&quot;מ נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודת 30 מיליליטר SP Sepharose מהירה זרימה עם SP המאגר (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl, 0.1 mM EDTA). הפעל חיץ דרך העמודה ב1.5-2 מ&quot;ל / דקה עם מגבלת לחץ של 0.3 MPa על רקע. טען את המדגם על העמודה. לשטוף עם SP מאגר עד שחוזר קורט 280 OD לנקודת התחלה, וזורקים את הזרימה דרך. הפעל שיפוע ליניארית 150 מ&quot;ל מ -0 ל -100 ב &#39;הצפת%, תוך איסוף שברים 2 מ&quot;ל. DPS יהיה elute בשיא חד בסביבות 50% ב &#39;, אם כי ב -10% הווריאציה אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את השברים elution על 15% ג&#39;ל-SDS, ולבדוק אם יש זיהום הדנ&quot;א על ידי מדידת יחס 280 260 / OD OD באמצעות ספקטרופוטומטר. ג&#39;ל רק צריך להראות להקה אחת סביב 19 kDa, ו260 / 280 קוטר חיצוני קוטר חיצוני הוא בדרך כלל סביב 0.7. הברכה שברי DPS הטהור ביותר. השתמש ביחידת מסנן צנטריפוגלי (כגון יחידת סינון Ultra Amicon) עם10K משקל מולקולרי החתך כדי לרכז את העקורים ולהחליף אותו למאגר אחסון (50 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl). Aliquot העקורים המטוהרים, ולהקפיא בחנקן נוזלי לאחסון ב -80 ° C. </li></ol> 2. Assay הגנת ה-DNA Assay כרוך שלבים רגישים לזמן מרובים וצריך להיות מתוזמן לשנייה כדי להשיג תוצאות לשחזור. מרכיבים רבים וצעדי pipetting מעורבים, ולכן שולחן pipetting (ראה טבלה 1) רצוי לעקוב אחר צעדים ואמצעי אחסון. הזמן הכולל הנדרשים עבור assay הוא לא יותר משעה 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 30 מ&quot;ל מים לתוך בקבוקון אטום; לשטוף את המים עם N 2 במשך 10 דקות (באמצעות מזרק שתי מחטים, אחד בנוזל, אחד מעליו) כדי להסיר את החמצן מפתרון. הוסף 0.0168 4 • 2 O 7H גרם FeSO למים כדי להשיג פתרון מניית 2 מ&quot;מ. לאטום את הבקבוקון ולשטוף עם חנקן במשך 5 דקות נוספות, ואז לערבב. הפתרון חייב להיותברור, אם כל רמז לצהוב הוא לגילוי, להכין פתרון ברזל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 100 מ&quot;מ פתרון H 2 O 2 (10.87 μl של 9.2MH 2 O 2 לתוך מים 1 מ&quot;ל); לשמור על קרח ומוגן מפני אור על ידי עטיפה בנייר אלומיניום. השתמש אך ורק לכ 1-2 שעות לאחר הכנה בשל דעיכה ספונטנית. מניית מי חמצן היא באופן דומה בכפוף להתמוטטות, שעשויים להשתפר באופן חלקי על ידי אחסון נאות (בחושך, על 4 מעלות צלזיוס). בדיקות תקופתיות של ריכוז המניות על ידי מדידת 240 OD מומלצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי aliquot של מטוהר DPS במהירות באמבט מים בטמפרטורת חדר, ולשמור על קרח. צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 4000 XG בpicocentrifuge בראש טבלה למצרפי משקע. למדוד את הריכוז לאחר centrifuging באמצעות ספקטרופוטומטר (OD 280 = 1.547 מציין ריכוז של 100 DPS מונומר מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל DNA ליניארי מ- ריכוז גבוה מניות באמצעות מאגר התגובה 12x (1M-מגבים KOH pH 7.0, 1 M NaCl) בריכוז של 100 ng / μl. ה-DNA לינארי משמש כדי להפוך את הכימות קל יותר, אבל פלסמיד דנ&quot;א עשוי לשמש גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 1 של תערובת ה-DNA החיץ לתוך צינור ה-PCR. הוסף מספיק מים לתגובה, כך שנפח התגובה הסופי (מינוס SDS) יהיה 12 μl. סכום זה צריך להיות מחושב מראש באמצעות טבלת pipetting. הוסף DPS לריכוז dodecamer סופי של 3 מיקרומטר. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר לעקורים להיקשר ל-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק פתרון 2 מ&quot;מ FeSO 4 כדי להגיע לריכוז הרצוי. ניסוי טיפוסי משתמש במגוון של ריכוזים מ -0 עד 1 מ&quot;מ FeSO 4. ריכוזים גבוהים יותר יגרמו לפירוק ה-DNA נרחב יותר, אלא גם עשויים להוביל להיווצרות של הברזל שוקע בתערובת התגובה. להוסיף במהירות של 1 μl פתרון 100 מ&quot;מ H 2 O 2 (לריכוז סופי 10 מ&quot;מ), ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות על מנת לאפשר לפנטוןתגובה בתיווך השפלה להתקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.8 μl של 20% SDS (נתרן גופרתי dodecyl). לערבב ולדגור על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לשבש את מתחמי DPS-DNA. SDS מערער מורכב DPS-DNA ומונע משמרות ג&#39;ל לא רצויות עבור ה-DNA, אשר משפרת את הקלות של כימות. צעד אופציונלי הוא לעצור את התגובה על ידי מי חמצן catalytically המשפיל למוצרים שאינם רעילים. לתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, בשלב זה אין צורך להשיג מגוון רחב של השפלה ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח במשך דקות 1, להוסיף טעינת צבע, ולטעון על ג&#39;ל agarose. הרץ את הג&#39;ל, וכתם לדנ&quot;א באמצעות ethidium ברומיד. ג&#39;ל צריך להיות לאחר אלקטרופורזה מוכתמת ולא לפני אלקטרופורזה, כדי למנוע SDS מלהתערב בחלוקת רומיד ethidium בג&#39;ל. </li></ol>

<ol><li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li>
<li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions%3A+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li>
<li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li>
<li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li>
<li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li>
<li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li>
<li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+Dps%2C+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li>
<li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li>
<li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li>
<li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li>
<li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+%28DNA-binding+protein+from+starved+cells%29%3A+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li>
<li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage%3A+x-ray+crystal+structure%2C+iron+binding%2C+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li>
<li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation%2C+detoxification%2C+and+DNA+protection+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li>
<li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopharmacology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li>
<li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+scavenging%2C+DNA+protection%2C+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins%3A+FurB+%28All2473%29+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li>
<li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li>
<li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+iron+determination+using+ferene+triazine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

תהליך הטיהור של העקורים כפי שתואר במאמר זה הוא מאוד חזק. טוהר היה גבוה באופן עקבי (&gt; 99%); אין חלבונים אחרים מופיעים בג&#39;לי-SDS כמו להקות נראות לעין. למרות זאת, נראות כמה קבוצות של DPS המטוהר יש פעילות nuclease, כפי שמעידים השפלה DNA חלקית כאשר טופחו עם ריכוזים גבוהים מאוד של DPS. זה עשוי להעיד על הנוכחות של DNases מאוד פעיל בריכוז נמוך שלא הצליחו להסיר באמצעות טיהור. עם זאת, ה-DNA השפלה זו נצפתה רק בריכוזים שאינם משמשים בדרך כלל למבחני חוץ גופית, כך שזה בדרך כלל לא...

יצורים אירוביים כל הזמן צריכים להתמודד עם מיני חמצן תגובתי שיכול לגרום נזק DNA שלהם, כמו גם מולקולות ביולוגיות חיוניות אחרות. כלי רב עוצמה אחד כדי לנטרל את ההשפעות הרעילות של נזק חמצוני הוא חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS). מאז גילויו בשנת 1992 מא &#39;המורעבת coli תרבות 1, DPS זוהה יותר מ -300 מינים של חיידקים ו2 archaebacteria. upregulation המסיבי של DPS בשלב נייח הופך אותו לחלבון nucleoid הקשורים הגבוהה ביותר בא לידי ביטוי של א &#39; coli בתנאים רעב 3, 4. בנוסף, DPS הוכח גם לשמר יכולת קיום חיידקים ויושרה DNA במהלך רבים לחצים שונים, כולל הרעבה, ריכוז ברזל גבוה, חשיפה לאור UV, הלם חום, וסטרס חמצוני 5, 6. מבחינה מבנית, DPS עצמי מקורבים לקומפלקס הומו-oligomeric יציב של 12 מונומרים, Which להרכיב לתוך קליפה חלולה כדורית. החלל הפנימי ~ 4.5 ננומטר הרחב נגיש לחוץ הממס דרך נקבוביות המאפשרים מעבר של מולקולות קטנות 7, והוא יכול לעקל מתכות mineralized כגון ברזל 8. ההשפעה המגנה של DPS נובעת ממספר הפעילויות ביוכימיות, הכוללות לא ספציפי DNA 1 מחייב, פעילות ferroxidase, ואחסון ברזל 8. מחקר מפורט של פעילויות ביוכימיות המיטיבות של DPS דורש הטיהור הראשון שלה. טיהור DPS היא הליך מורכב, שיש להפריד DPS לא רק מחלבונים אחרים, אלא גם מכל ה-DNA מאוגד 7. תהליך הטיהור האופטימלי שלנו משתמש בטכניקות נפוצות רבות, בהיקף של שתי עמודות החלפת יונים וצעד ממטרים אמוניום סולפט. חילופי חיץ כמה יש צורך, כעקורים מרוכזים מאוד יכולים לזרז את הפתרון בתנאי מלח נמוך. ברגע שהחלבון DPS כבר מטוהר, זה עשוי להיות מיושם למבחנים שמודדים ישירות את פעילותה ferroxidase 8, stoichiometry-DNA מחייב 9, ומנגנונים של ברזל מחייב 10. DPS המטוהר יש גם יישומים פוטנציאליים אחרים. המבנה הכדורי החלול היציב של DPS שימש כפיגומים לאחסון חלקיקים הידרופובי בתוך חלל החלבון 11 ואפילו כתא תגובה לסנתז חלקיקים מגנטיים רומן 12. היכולת המגנה של DPS לתווך נזק עקב מיני חמצן תגובתי יכולה להיות ברורה וישירה הפגינה באמצעות assay-DNA הגנת 13, 14. בהליך זה במבחנה, מינים רדיקליים מיוצרים כאשר הברזל מזרז השפלה H 2 O 2 דרך הכימיה פנטון. רדיקלים אלו באופן ישיר לפגוע בהווה DNA בתגובה ויכולים להשפיל אותו לחלוטין בריכוזים גבוהים. שתי פעילויות מרכזיות עשויות DPS הן במישרין לנטרל את ההשפעות של Fentייצור רדיקלי בתיווך. DPS מוריד את ריכוז ברזל קטליטי באמצעות מינרליזציה, צורך את חמצן זמין בתהליך. בנוסף, ל-DNA מחייב DPS פוטנציאלי עלול להגן עליו מפני נזק פיזי קיצוני ומתעבה אותו לתוך נפח קטן יותר עם שטח פנים פחות תגובתי. שילוב של שני מאפיינים אלה הופך את הגנת ה-DNA assay גם מתאים לצורך מדידת פעילות DPS מגן. Assay הגנת ה-DNA הוא צדדי למדי ויכול לשמש למגוון רחב של יישומים מעבר לאפיון DPS. ניזק של רדיקלים הוא צורה נפוצה של מתח בתאים, וחלבונים רבים ושונים וכימיקלים המשמשים כדי לנטרל אותו. העיקרון הכללי של assay, תוך שימוש בשלמות הדנ&quot;א כסמן לנזק של רדיקלים, ניתן להשתמש בו בשילוב עם כמעט כל תגובה קיצונית לייצור או סוכן מנטרל. בין יתר, assay כבר השתמש בהצלחה כדי לקבוע תכונות אנטי חמצונישל ק תמצית paniculata לשימוש בתעשיית מזון 15, כדי לאפיין את ההשפעות של חומצת שתן בגישור נזק הידרוקסיל 16, ולהשיג תובנות חדשות על תפקודם של חלבוני רגולטור 17 תעתיק פרווה. למרות שימושים רבים של assay במסמכים שפורסמו, מצאנו כי אופטימיזציה רבות וצעדים לפתרון בעיות נדרשו, מה שהופך את הקמת assay בפעם הראשונה תהליך מייגע שלא לצורך לחוקרים רבים. הפרוטוקול אנו מציגים במאמר זה מטרתו להסיר את המכשול הזה לכניסה.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS תאים מוכשרים</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB אבקת מרק</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>סט קוקטיילים מעכב פרוטאז III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 עמודי התפלה</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. מסנן (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>ברזל סולפט הפטהידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>חממה סטטית</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול </td><td>ניו ברונסוויק Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>בקמן קולטר</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Cell Disrupter</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC מטהר</td><td>ג'נרל אלקטריק</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים אטומים</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>מחטי מזרק</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; assay הגנת ה-dna כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון dps

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

סטרס חמצונים הוא תוצר לוואי בלתי נמנע של חיים אירוביים. חמצן מולקולרי הוא חיוני לחילוף חומרים יבשתיים, אבל זה גם לוקח חלק במספר רב של תגובות מזיקות בתוך אורגניזמים חיים. שילוב של חילוף חומרים אירוביים וברזל, שהוא תרכובת חיונית אחרת לכל חיים, זה מספיק כדי לייצר רדיקלים דרך הכימיה פנטון ולבזות מרכיבים תאיים. השפלה ה-DNA היא לטעון את התהליך המזיק ביותר מעורב רדיקלים תאיים, כתיקון DNA הוא רחוק מלהיות טריוויאלי. Assay שהוצג במאמר זה מציע שיטה כמותית למדידה ולהמחיש את ההשפעה של מולקולות ואנזימים בניזק לדנ&quot;א רדיקלי בתיווך. Assay הגנת ה-DNA הוא כלי פשוט, מהיר, וחזק לאפיון במבחנה של מאפייני ההגנה של חלבונים או חומרים כימיים. זה כרוך בחשיפת DNA לתגובת חמצון מזיקה והוספת ריכוזים שונים של המתחם של עניין. הצמצום או הגדלה של נזק לדנ&quot;א כפונקציה של ריכוז תרכובת אז דמיין באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה. במאמר זה אנו מדגימים את הטכניקה של assay הגנת ה-DNA על ידי מדידת התכונות המגנות של חלבון ה-DNA המחייב מהתאים מורעבים (DPS). DPS הוא מיני פריטין כי הוא מנוצל על ידי יותר מ -300 מיני חיידקים כדי להילחם בעוצמה גורמי לחץ סביבתי. כאן אנו מציגים פרוטוקול טיהור DPS ואת התנאים האופטימליים להערכת assay הגנת ה-DNA על ידי DPS.

תהליך הטיהור לעקורים שתוארו כאן הוא מאוד לשחזור. DPS טיהור על פי הפרוטוקול המתואר, באמצעות 2 ליטר של א &#39; תרבות coli כנקודת התחלה, בדרך כלל תניב 2.5 מ&quot;ל של חלבון המכיל 12 DPS בריכוזים שבין 5 ו -12 מיקרומטר. זמני אינדוקציה ארוכים יותר (4 שעות) נראים להפחית השונות הזאת. טוהר חלבון הוא באופן עקבי מעל 99%, כפי שמעיד על ידי-SDS ג&#39;ל (איור 1). רמת זיהום ה-DNA היא זניחה באופן עקבי, כפי שמעיד הן על ידי ג&#39;ל agarose מוכתם עבור ה-D...

חלבון ה-DNA מחייב מהתאים מורעבים (DPS) ממלא תפקיד מכריע במאבק נגד לחץ חיידקים. מאמר זה עוסק בטיהור<em&gt; א coli</em&gt; DPS והפרוטוקול<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מדגים הגנת DPS בתיווך של ה-DNA מפירוק על ידי מיני חמצן תגובתי.

יישום של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay הגנת ה-DNA כדי להמחיש את מאפייני גישור לחץ של חלבון DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון in vitro את ההשפעה המגנה של חלבון ה-DPS על ידי ויזואליזציה של ההפחתה בנזקי DNA המתווכים על ידי רדיקלים כתוצאה מפעילות ה-DPS. דבר זה מושג תחילה על ידי ניקוי DPS מתאי e coli, תוך שימוש במספר עמודי חילוף יונים ושיקוע באמוניום סולפייט. בשלב שני, DPS מנוקה מתווסף ל-DNA, מה שמאפשר היווצרות של קומפלקס A-D-P-S-D-N-A בשל תכונות הקישור הבלתי ספציפי של החלבון ל-DNA. לאחר מכן, תמיסות של ברזל ומי חמצן מתווספות לתגובה כדי לייצר רדיקלי הידרוקסיל באמצעות כימיית פנטון (Fenton chemistry) ובכך לגרום נזק ל-DNA.התוצאות שהתקבלו מראות הפחתה בנזק ל-DNA עקב נוכחות של DPS, בהתבסס על כימות פסיי DNA שאינם פגומים בג'לים של אגרוז לאחר אלקטרופורזה. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בהכנת הריאגנטים. דבר זה גורם לתגובות לוואי לא רצויות, כגון היווצרות משקעים של ברזל פרי ה (ferric iron) או פירוק ספונטני של מימן פרוקסיד.למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי הפעילות המגנה של DPS מפני עקה חמצונית, ניתן ליישמה גם כדי לכמת את ההשפעות של חלבונים וכימיקלים אחרים על פירוק DNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הכימיה החמצונית, כגון קביעת התכונות הנוגדות חמצון של תמציות תאיות לשימוש בתעשיית המזון. שלב ראשון חיוני עבור בדיקת הגנת ה-DNA הוא השגת חלבון DPS ברמת טהרה גבוהה.כדי להתחיל את ההליך לביטוי וניקוי של DPS, בצע טרנספורמציה לזן של e coli חסר פרוטאז בעזרת וקטור pet שבו שובשה רצף הקידוד של חלבון ה-DPS. זרע שני בקבוקים של ליטר אחד של מצע LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם 10 מיליליטר מכל תרבית לילה שגודלה מקולוניה בודדת של תאים שעברו טרנספורמציה. גדל את התרביות ב-37 degrees Celsius תוך ניעור עד להגעה ל-OD 600 של כ-0.6.כאשר התאים מגיעים ל-od הרצוי, גרו את הביטוי של DPS על ידי הוספת IPTG לריכוז של 0.3 millimolar. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות תוך כדי ניעור, ואספו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-6,000 Gs למשך 15 דקות. השעה את משקעי התאים ב-7.5 milliliters של באפר DEAE, לכל ליטר של תרבית תאים שעברה השראה. הוסיפו תערובת של מעכבי פרוטאז לסספנסיית התאים המאובדת. כדי למנוע פירוק של TPS שהועבר ביטוי ייתר, הכינו תמצית נטולת תאים באמצעות French press prime.העבירו את הדגימה ב-French press עם 20 milliliters של DEAE buffer A ולאחר מכן בצעו ליסיס של הדגימה פעמיים ב-20 KPSI. סובבו את הליזט בצנטריפוגה במהירות של 30, 000 GS למשך 35 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר חלקיקים בלתי מסיסים, שמרו את הסופרנאטנט, טענו את התמצית נטולית התאים לעמודת DEAE SRO SEAL six B של 30 milliliters שהושרתה ב-DEAE buffer A, והתחילו באיסוף של השבירה (flow through). ברגע שערך ה-OD 280 מתחיל לעלות מעל קו הבסיס, שטפו את העמודה עם DEAE buffer A עד שערך ה-OD 280 חוזר לקו הבסיס, תוך איסוף רציף של השבירה.השבירה (flow through). צריכה להכיל את מרבית חלבון ה-DPS ללא DNA קשור; שטפו את העמודה ב-100% buffer B. אלואט זה מכיל קומפלקסים של D-P-S-D-N-A וכן חלבונים אחרים וניתן להשליכו. השלב הבא הוא הסרת חלבונים מזהמים נוספים באמצעות שיקוע באמוניום סולפט, והוא מבוצע בדרך כלל בחדר הקירור.לאחר קביעת הנפח של ה-pooled flow through, הוסף לאט ammonium sulfate גרגירי קטן עד לרוויה של 62% לאורך 10 עד 20 דקות בטמפרטורה של 4°C תוך כדי ערבוב. הסר את החלבונים השקעים על ידי סנטריפוגציה ב-20,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. שמור את העלייה (supernatant) באיטיות.הוסיפו 227 מיליגרם נוספים של ammonium sulfate לכל מיליליטר של supernatant כדי להגיע לרוויה של 94% וערבבו במשך 20 עד 30 דקות. כדי להבטיח שיושג שיווי משקל מלא וש-TPS ישקע בריכוז מלח גבוה זה, אספו את ה-DPS באמצעות סנטריפוגציה ב-20,000 GS למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השעיו מחדש את המשקע המכיל DPS ב-Resus suspension Buffer והביאו את נפח הדגימה ל-2.5 מיליליטר.הסר את האמוניום סולפט באמצעות החלפת בופר (buffer exchange) בעזרת עמודת סינון ג'ל מסוג PD 10, שמיטת הג'ל שלה הושוותה עם 25 milliliters של Resus suspension Buffer. טפטף 2.5 milliliters של דגימת DPS לחלק העליון של עמודת ה-PD 10 והמתן לספיגתה; השליך את הנוזל שעבר דרך העמודה (flow through). אסוף את ה-DPS על ידי אלואציה עם 3.5 milliliters של Resus suspension buffer followed by centrifuge.ביצעו החלפת בופר לדגימה ב-16,000 GS למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר רכיבים בלתי מסיסים, דללו את הדגימה עם 6 עד 10 מיליליטר של בופר דילול כדי להבטיח שריכוז המלח נמוך מספיק עבור DPS. כדי לבצע קישור לעמודת SP SPHEROS, טענו את הדגימה לעמודת SP spheros fast flow בנפח של 30 מיליליטר שהועשרה מראש בבופר SP.שטפו עם באפר SP A עד שה-OD 280 חוזר לקו הבסיס והשליכו את התוצר ששטף החוצה. הריצו גרדיאנט ליניארי של 150 מיליליטר מאפס עד 100% באפר B תוך איסוף פרקציות של 2 מיליליטר. DPS יבוא באליוציה בשיא חד בסביבות 50%B, אם כי סטייה של 10% היא אפשרית.בדקו את פראקציוני האלוציה (elucian fractions) לאיתור זיהום ב-DNA על ידי מדידת היחס בין OD 260 ל-OD 280. באמצעות ספקטרופוטומטר, היחס אמור להיות בדרך כלל סביב 0.7 כאשר פראקציוני האלוציה מורצים על ג'ל SDS-PAGE בריכוז 15%. הג'ל אמור להראות פס אחד בלבד באזור 19 kilodaltons.יש לאחד את פракציות ה-DPS המטוהרות לאחר ריכוז והחלפת ה-DPS לתמיפת אחסון. באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית, יש לחלק את ה-DPS המטוהר למנובות ולהקפיא בחנקן נוזלי לאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. בדיקת ההגנה הגנטית מורכבת ממספר ריאגנטים ומסכימות פתוגנים מורכבות.הכנה קפידה של הריאגנטים ותזמון מדויק הם תנאי הכרחי להשגת הדירות (reproducibility). מומלץ להשתמש בטבלת פיפטור כדי לעקוב אחר השלבים והנפחים במהלך פרוצדורה זו. מדדו 30 milliliters של מים לתוך מבחנה אטומה לאוויר כדי להסיר חמצן מהתמיסה.שטפו את המים בחנקן למשך 10 דקות באמצעות שתי מחטי מזריק, אחת בתוך הנוזל ואחת מעליו. הוסיפו 0.0168 גרם של ferrous sulfate hepta hydrate למים כדי לקבל תמיסת סטוק בריכוז של 2 millimolar. אטמו את הבקבוקון ושטפו בחנקן למשך חמש דקות נוספות.לאחר מכן ערבבו. התמיסה חייבת להיות צלולה; אם ניתן להבחין ברמז של צבע צהוב, הכינו תמיסת ברזל חדשה. הכינו תמיסת מי חמצן בריכוז 100 millimolar, שמרו אותה על קרח והגנו עליה מפני אור בשל פירוק ספונטני.השתמשו בתמיסת מימן פחמונית זו רק במשך כשעה עד שעתיים לאחר ההכנה. בצעו eloqua של DPS מטוהר במהירות באמבט מים בטמפרטורת החדר ושמרו בנצחון על קרח למשך 10 שניות ב-4,000 GS בצנטריפוגת שולחן pico כדי להשקיף אגרגטים לאחר הצנטריפוגה. מדדו את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר, לאחר מכן דללו DNA ליניארי ממאגר בריכוז גבוה באמצעות בופר תגובה 12x כדי להגיע לריכוז של 100 nanograms per microliter; פפטו מספיק מים לשפופרות ה-PCR כך שנפח התגובה הסופי יהיה 12 microliters.בשלב הבא, הכינו דגימת מלאי של DNA מעורב עם DPS כך שהריכוז הסופי של ה-DPS יהיה 3 µM. העבירו בעזרת פיפט את תערובת ה-DNA-DPS למבחנות ה-PCR. למבחנות הביקורת יש להוסיף DNA בלבד. הדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ל-DPS להיקשר ל-DNA. הוסיפו תמיסת ferrous sulfate בריכוז 2 mM בכמות המספיקה להגעה לריכוז הרצוי; הוסיפו במהירות 1 µL של תמיסת hydrogen peroxide בריכוז 100 mM עד לריכוז סופי של 10 mM, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.כדי לאפשר לתגובת הפירוק המתווכת על ידי פנטון (Fenton) להתרחש, הוסף 1 µL של תערובת 20% SDS והדגר בטמפרטורה של 85 °C למשך חמש דקות כדי לפרק את קומפלקסי ה-D-P-S-D-N-A; ה-SDS דסטביליז את קומפלקס ה-DPS DNA ומונע הסטות ג'ל לא רצויות של ה-DNA, מה שמשפר את קלות הכימות. כעת הדגר על קרח למשך דקה אחת, ולאחר מכן הוסף צבע טעינה וטען על ג'ל אגרוז לאלקטרופורזה; צבע את ה-DNA באמצעות אתידיום ברומיד לאחר האלקטרופורזה במקום לפנייה. פעולה זו מונעת מה-SDS להפריע להתפלגות האתידיום ברומיד בג'ל.שלבי הביניים של טיהור ה-DPS כפי שנותחו באמצעות SDS page מוצגים כאן. נתיב one הוא תמצית נטולת תאים. נתיב two הוא ה-flow through של עמודת ה-DEAE SPHEROS.נתיב שלוש הוא ה-EIT של עמודת ה-DEAE. נתיב ארבע הוא העל-נתיב (supernatant) של השקיעה ב-60% ammonium sulfate. נתיב חמש הוא דגימת ה-DPS לאחר שקיעה ב-90% ammonium sulfate והחלפת חוצץ באמצעות עמודת PD 10.ונתיב שש מכיל את תתי-הסינונים המרוכזים של DPS טהור. לאחר הפרדה בעמודת SP spheros של חלבונים. סמני משקל מולקולרי נמצאים בנתיב שבע.האחוזים בתחתית כל נתיב מציינים את טוהר ה-DPS כפי שנקבע באמצעות תוכנה לכימות תמונות. תהליך הטיהור של DPS המוצג כאן הוא בעל הדירות גבוהה מאוד וטוהר החלבון עומד באופן עקבי על מעל 99%. שום חלבונים אחרים אינם מופיעים על ג'לי SDS-PAGE כפסים נראים לעין. ניתן להשתמש ב-DPS מנוקה בבדיקת הגנה על DNA, שבה ברזל מקטלין פירוק של מימן פראוקסיד באמצעות כימיית פנטון ומייצר מיני רדיקלים הפוגעים ישירות ב-DNA הנוכח בתגובה; תוצאות מייצגות מוצגות באיור זה.כל הנתיבים מכילים 100 nanograms של DNA ליניארי בגודל five kilobase; נתיב אחד מכיל DNA בלבד, ונתיב שני מכיל DNA עם one millimolar hydrogen peroxide; נתיב שלושה מכיל DNA עם one millimolar hydrogen peroxide ו-166 micromolar ferrous sulfate, אך ה-DNA עבר דגראדציה. נתיבים ארבעה עד שמונה מכילים DNA עם three micromolar DPSD demer, one millimolar hydrogen peroxide, וריכוזי ברזל עולים משמאל לימין.העובדה ש-DPS מתווך הגנה על DNA מפני פירוק חמצוני ניכרת מההשוואה בין נתיבים שלושה וחמישה. כמו כן, נראה כי קיימת עלייה כללית בפירוק ה-DNA עם עליית ריכוז הברזל. ניתן לכמת את התוצאות שהתקבלו באמצעות בדיקת הגנת ה-DNA בעזרת תוכנה לעיבוד תמונות כגון image quant.גרף זה מציג את תוצאות הכימות הממוצעות לאורך שלושה ניסויים. פסי השגיאה מצביעים על רמת השחזור הגבוהה שהושגה. לאחר רכישת מיומנות בשיטה.ניתן לבצע טכניקה זו בערך בארבע שעות עבור עד 40 דגימות, מה שמאפשר לאפיין תנאים שונים רבים במקביל. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין את הריאגנטים במדויק ולתזמן כל שלב בדיוק רב ככל האפשר. מכיוון שהבדיקה רגישה למשכי הדגירה, לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק חלבון DPS בדרגת טוהר גבוהה ולאפיין אותו בבדיקה in vitro כדי לקבוע את פעילותו בהגנה על DNA מפני פירוק על ידי מיני חמצן רעילים.

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף...

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

התנגדות מתח היא אחד מסימני ההיכר לאריכות ימים, והוא ידוע להיות נשלטת גנטי. כאן, פיתחנו שיטת תפוקה גבוהה משוחדת למסך למוטציות המעניקות התנגדות מתח בתאי גזע עובריים שבה לפתח מודלים של עכברים ללימודי אריכות ימים.

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

Msh2-MSH6 אחראית ליזום תיקון של טעויות שכפול ה-DNA. כאן אנו מציגים גישה קינטיקה חולף לקראת הבנה איך זה עובד חלבון קריטי. הדו"ח ממחיש הפסיקה זרימת ניסויים למדידת מחייב DNA מצמידים ו קינטיקה ATPase הבסיסית Msh2-MSH6 מנגנון הפעולה של תיקון דנ"א.

יישום הופסק זרימה שיטות קינטיקס לחקור את מנגנון הפעולה של חלבון תיקון DNA

למדו לטהר את חלבון Dps מ-E. coli ולהעריך את יכולתו להגן על DNA מפני נזק חמצוני באמצעות אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני הישרדות חיידקיים תחת לחץ.

יישום של

גלה סרטונים נוספים