Name: ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: למדו כיצד לזהות ולנתח את אספקת ננו-חלקיקי HerDox ממוקדי גידול באמצעות הדמיה אופטית רב-מצבית. שיטה זו מאפשרת הערכת מיקוד וחדירה לתאי גידול בטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקים לLKM-K מהמוסד הלאומי לבריאות / מכון הלאומי לסרטן (R01CA129822 וR01CA140995). ד&quot;ר מדינה-Kauwe מודה ג ריי, מ &#39;M-Kauwe וד Revetto להמשך תמיכה.

1. משלוח מערכתי בvivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מספיק HerDox עם תמיסת מלח סטרילית להשוות 0.2 מ&quot;ל של מינון מ&quot;ג / ק&quot;ג 0.004 של HerDox לכל זריקה למשך 6-8 גידולים בשבוע ישנים נו / נו עכברי נושאים הבילטראליים תת עורי כנף עוקץ xenograft. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר בעדינות את תערובת HerDox לתוך מזרק אינסולין 3/10 סמ&quot;ק המצויד במחט 29G, הימנעות בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה היא מושרה על ידי חשיפת isoflurane קצרה בחדר אינדוקציה מצויד בהדחת מערכת גז (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את התערובת כולה לוריד הזנב של עכבר הרדים (0.2 מ&quot;ל להזרקה). הזרקת IV יכולה גם להתבצע בעכבר מאופק, ללא הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על זריקות באותו העכבר במשך שישה ימים רצופים נוספים, פעם ביום. </li></ol> 2. דימות פלואורסצנטי בvivo ההצטברות של HerDox הקרינה בגידולים יכוליםלהתגלות על ידי ביום האחרון של זריקה (יום 7) באמצעות imager multimode. ההליכים המפורטים להלן כרוכים בשימוש במערכת המאקרו תאורה וזיהוי מותאמת אישית (איור 1) 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Multimode בImager האופטי vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פליטת bandpass מסנן (590 ננומטר ± 30 ננומטר) מתאימה לגילוי הקרינה דוקסורוביצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת ההרדמה ולאחר מכן למקם את עכבר לתוך תא ההרדמה (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך) מצוידות במערכת הדחה גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר מחדר ההרדמה לחדר ההדמיה של Multimode בImager האופטי vivo כאשר העכבר הוא מורדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח nosecone מעל האף של העכבר ולפתוח את הזרימה לנהל anesthe הרציףSIA במהלך רכישת תמונה (שיעורי זרימת חמצן: 0.5-1 ליטר / דקה, ריכוז isoflurane: 2-3% (או נמוכים יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות הקרינה באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד. </li></ol> 3. דימות פלואורסצנטי Ex vivo ניתן הדמיה HerDox הקרינה בגידולים ואיברים ספציפיים (כולל כבד, כליות, טחול, לב, ושרירי שלד) נבצרו מעכברים מורדמים ב24 שעות לאחר ההזרקה (יום 7) הסופית של HerDox. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Multimode בImager האופטי vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פליטת bandpass מסנן (580 ננומטר ± 20 ננומטר) לגילוי הקרינה דוקסורוביצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולי מקום ואיברים ספציפיים מסודרים על צלחת פטרי להדמיה הקאמרית OF Multimode בImager האופטי vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות הקרינה של רקמות באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות. דוגמה לרכישת תמונת הקרינה ראשונית שמוצגת באיור 2 א. חזור על אותו באמצעות צלחת פטרי ריקה, שישמש כרקע (איור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד. דוגמה לתמונה תיקן מוצגת באיור 2 ג, וכתוצאה מחיסור של איור 2b מהאיור 2a. </li></ol> 4. בConfocal ההדמיה באתרו של גידולים בהדמית confocal אתר מאפשר זיהוי וניתוח של הצטברות גידול HerDox ברמה התאית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ לייקה confocal SPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אור לייזר ננומטר 488 לעירור של אורכי גל דוקסורוביצין ופליטה (560-620 ננומטר) לדוקסורוביציןגילוי הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אובייקטיבי 40X או 63X וטיפת שמן טבילה בעדשה האובייקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ גידולים טריים מעכברים שקיבלו בעבר מורדמים טיפולי HerDox ומדומים, כמתואר בהליך 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולים מניחים על צלחת פטרי על קרח, כדי למנוע השפלה רקמות, ולאחר מכן להעביר את הגידולים לתא דלתא T להדמית confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות confocal של גידולים בעומקי מוקדים רציפים (גודל צעד: 1 מיקרומטר, עובי: 20 מיקרומטר). דוגמה של רצף תמונות-נרכשו לאורך ציר Z-מוצגת באיור 3, פנל שמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע העצמה מקסימלית Z-הקרנה של תמונות. הקרנת העצמה המרבית של Z-מוערם תמונות מוצגת באיור 3, פנל ימני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מתכוון עוצמות הקרינה של העצמה מקסימלית Z - הקרנת תמונות. ממוצעת עוצמות הקרינה של תמונות מעל השדה הכללי של תצוגה היו לחשבד באמצעות ImageJ. </li></ol> 5. דימות ספקטרלי רציומטרי וניתוח הדמיה רפאים רציומטרי וניתוח מאפשר אפליה בין Dox הקרינה וautofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח בסריקת לייזר מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכוש 15 תמונות של גידולי HerDox שטופלו ומטופל בעומק שצוין בטווח של 510-650 הרפאים ננומטר, עם גודל צעד של 10 ננומטר, ועירור ב 488 ננומטר אור באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מיקרומטר 100 של דוקסורוביצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה רפאים של פתרון דוקסורוביצין מיקרומטר 100 כדי להשיג את החתימה הספקטרלית הטהורה של Dox הקרינה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר). תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את החתימה הספקטרלית autofluorescence מג תמונהאופה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר) שהושגה על ידי הדמיה רפאים של גידולים שלא טופלו. תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר ארבע חתימות רפאים התייחסות (autofluorescence הטהור, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescence, 0.2. דוקסורוביצין 0.8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescence) באמצעות התכנית שפיתחנו 9. עקומה טיפוסית מראה ארבע חתימות רפאים התייחסות מוצגת באיור 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סיווג ספקטרלי של תמונות כפי שהוגדר על ידי החתימה ספקטראלית התייחסות דרך למדוד מרחק אוקלידי באמצעות התכנית שפיתחנו בעבר 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע unmixing רפאים ליניארית של דימויים אלה באמצעות תכנית רפאים unmixing (Plug-in בImageJ) פיתחנו 7, 10, לשם השוואה להדמית הרפאים ratiometric והניתוח. דוארxample של הפרדת הקרינה HerDox מautofluorescence ידי unmixing הרפאים יניארי מוצג באיור 7. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
<li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujimoto%2C+JG+%22Biomedical+Optical+Imaging%22">Biomedical Optical Imaging</a>. , Oxford University Press. New York. (2009).</li>
<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

המחבר, דניאל פרקש, הוא יו&quot;ר של הדמיה מולקולרית ספקטרלי. יש החוקרים שנותרו ללא אינטרסים מתחרים.

DOX הקרינה ניתן להבחין בvivo באמצעות imager multimode כאשר גידולים תת עורית. עם זאת, המינון טיפולי היעיל של HerDox (0.004 מ&quot;ג / ק&quot;ג) הוא מתחת לסף הגילוי לאחר מנה אחת. לעומת זאת, לאחר 7 זריקות יומיות (1x/day למשך 7 ימים), הצטברות הגידול והשימור של החלקיקים מספיק כדי לאפשר הדמיה של הקרינה Dox. זה קריטי כשעובדים עם Dox או כל fluorophore אחר בתחום ההדמיה vivo כי הוא השתמש בטכניקה ...

גידול במיקוד של כימותרפיה יש את הפוטנציאל לחסל את התאים סרטניים במינון נמוך יותר בהשוואה לתרופות לא ממוקדות, כי יותר מהטיפול יכול לצבור נמסר ליעד, ולא להפיץ לרקמה שאינה סרטנית. ככל שהמצב זה האחרון הייתי לדלל את היעילות של התרופה ולכן דורש מינונים גבוהים יותר כדי להיות יעילים, מיקוד גידול יש שני יתרונות טיפוליים ובטיחות מעל טיפול שאינו ממוקד סטנדרטי. מיקוד כימותרפיה ידי אנקפסולציה בחלקיקים עצמי התאספו מאפשר התרופה להישאר ללא שינוי כימי בניגוד לתרופות שמקושרות קוולנטית למולקולות מיקוד. כהצמדה כזו יש הפוטנציאל לשנות את הפעילות של שניהם בסמים ומיקוד המולקולה; הרכבה שאינה קוולנטיים מאפשרת עוצמה תרופה להישמר. הראינו בעבר שהרומן של שלוש מרכיב, מורכב עצמי התאספו, HerDox, מטרות HER2 + גידולים <em&gt; In vivo ומעורר אבלציה גידול בצמיחה תוך חוסך רקמה נורמלית, כולל הלב 1. HerDox נוצר דרך אינטראקציות שאינן קוולנטיים בין חלבון קולט מחייב תא החדירה, HerPBK10, והסוכן כימותרפיות, דוקסורוביצין (DOX), באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. HerPBK10 נקשר לקולטן גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (שלה) ומעורר אנדוציטוזה קולטן בתיווך 2-4, תוך חדירת קרום endosomal נעשה באמצעות שילוב של אדנווירוס-נגזר פנטון בסיס חלבון capsid 4-6. תחום טעון חיובי בחלבון מאפשר לחומצת גרעין 4 מחייב, 5, שדרכו Dox-DNA intercalated יכול להיות מועבר למשלוח ממוקד. Electrophilic, עיבור, ואולי אינטראקציות oligomerization חלבון להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים כי הם יציבים בדם ומתחת לאחסון ממושך בטמפרטורות שונות 1. העדפת מיקוד אליה2 + תאים סרטניים הוא הקל על ידי זיקת יגנד המשופרת כאשר HER2 הוא גבוה. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי המשלוח מערכתי של הצטברות מועדפת HerDox תשואות בגידולים מעל הרקמה שאינה סרטנית ולא ממוקדים, בהשוואה ל1 Dox, וחדירה לתאי גידול in vivo 7. יש לנו ציינו שמשחרר HerDox Dox לאחר כניסת תא גידול, ומאפשר הצטברות Dox לתוך הגרעין 1. גידולים הצטברות מופיעה לתאם עם רמת הקולטן, כמו גידולים המבטאים-HER2 נמוכים יחסית לצבור פחות HerDox בהשוואה לאלו עם רמות גבוהות יותר יחסית 1 HER2. יתר על כן, ריכוז המוות של התאים היעיל מציג מתאם הפוך עם HER2 תצוגה בשורות תאים סרטניים המבטאות תא שטח שונה HER2 רמות 1. HerDox מפגין יתרון טיפולי ובטיחות מעל Dox לא ממוקד, לא כהריגת גידול מתרחשת במינון מעל 10 פעמים נמוכות יותר בהשוואה לuntarסמים וgeted מניב שום השפעה לרעה על גילוי לב (אקו וזוהה על ידי כתם היסטולוגית) או כבד (זוהה על ידי Tunel כתם) רקמה, בניגוד לDox לא ממוקד 1. למרות גזירתו מחלבון הקופסית נגיפית, HerPBK10 מפגין שום immunogenicity להבחין ברמות טיפוליות 2. ואילו נוגדנים קיימים מראש לכל אדנווירוס יכולים לזהות HerPBK10, הם לא הצליחו למנוע תא מחייב 2. נפח גידול נמדד לאורך הזמן הוא שיטה סטנדרטית של הערכת יעילות טיפולית של תרופות ממוקדות, וכבר מועסק להערכת היעילות הטיפולית של HerDox. להשלים עם גישה זו in vivo ההדמיה עוצמת הקרינה vivo לשעבר אפשר לנו להעריך טוב יותר את יעילות מיקוד 7. יש לנו משולב באופן ספציפי בתחום ההדמיה confocal באתרו של גידולים ניכרים עם ניתוח ספקטרלי של Dox הקרינה כדי לוודא שאין HerDoxלא נצבר רק בגידולי in vivo אבל חדרו לתוך תאים סרטניים וDOX מועבר לתוך הציטופלסמה לבין הגרעין 7. ניתוח ספקטרלי כמו כן אפשר לנו להבחין בין הקרינה Dox מautofluorescence 7. כאן אנו מדגימים בפירוט רב יותר את הגישה שלנו להערכת HerDox in vivo לאחר משלוח מערכתי, והכי חשוב, להערכת מיקוד באמצעות שיטות הדמיה multimode וניתוחים.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><<tr><td>em>In Vivo הדמיה אופטית</td><td>הדמיה מולקולרית ספקטרלית</td><td>מולטימוד In Vivo הדמיה</td><td></td>אופטית</tr><tr><td>Doxorubicin-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>עכבר עירום (NU/NU), נקבה, 6-8 שבועות</td><td>קוד זן נהר צ'ארלס</td><td>088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 תאי גידול HER2+ אנושיים</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD מאגר גידול/קו תאים</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין 3/10 סמ"ק U-100 עם מחט 29G x 1/2 אינץ' Ultra-FineIV מחוברת לצמיתות</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>תא Delta T </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לher2 + גידולים

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Nanoparticle HER2 + גידול הממוקד, HerDox, מציג הצטברות גידול מועדפת ואבלציה גידול בצמיחה במודל חיה של סרטן HER2 +. HerDox נוצר על ידי הרכבה עצמית שאינם קוולנטיים של חלבון חדירת תאי גידול ממוקד עם סוכן כימותרפיה, דוקסורוביצין, באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. שילוב של electrophilic, עיבור, ואינטראקציות oligomerization להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים. HerDox מציג יציבות בדם, כמו גם באחסון ממושך בטמפרטורות שונות. משלוח מערכתי של HerDox בתוצאות נושאות גידולים בעכברים במוות תאי גידול ללא תופעות לוואי לגילוי לרקמה שאינה סרטנית, כוללים לב והכבד (שעובר נזק מסומן על ידי דוקסורוביצין לא ממוקד). HER2 גובה מאפשר מיקוד לתאים המבטא את הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס האנושי, ומכאן גידולים HER2 רמות גבוהות מוצגות תערוכת הצטברות גדולה יותר של HerDox לעומת ביטויי תאיםלשיר רמות נמוכות יותר, הן במבחנה ובחי. הדמיה עוצמת הקרינה בשילוב עם ניתוח ספקטרלי confocal ואתרו אפשרה לנו לאמת בגידול vivo מיקוד וחדירה של תאי גידול של HerDox לאחר משלוח מערכתי. כאן אנו פירוט השיטות להערכתנו גידול מיקוד באמצעות ההדמיה multimode לאחר משלוח מערכתי.

איור 1 מציג את אב טיפוס בimager האופטי vivo, שנבנה לצורך רכישת תמונה תחת שיטות מרובות, כולל עוצמת הקרינה, רפאים, כל החיים, confocal 2 פוטונים, התוך חיוני, והדמיה פליטת אור. בנוסף, המצלמה מקוררת גבוהה רגישה וקווי לייזר בהספק גבוהים שולבו במערכת זו תשואות גבוהות יותר בהשוואה תמונות הקרינה בניגוד למערכות הדמיה אופטיות מסחריות 11, במיוחד עבור באיתור vivo של הקרינה דוקסורוביצין. לפיכך, מערכת זו הייתה קריטית לשימוש במחקר הנוכחי כדי ...

מאמר זה מפרט את הנהלים לניתוח הדמיה אופטי של nanoparticle גידול הממוקד, HerDox. בפרט, שימוש מפורט של מכשיר ההדמיה multimode לאיתור גידול מיקוד והערכת חדירת גידול מתואר כאן.

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולנתח את ההובלה המערכתית in vivo של הננו-חלקיק HeroX המכוון לגידול באמצעות דימוי אופטי רב-מודאלי. ראשית, הננו-חלקיק מוזרק לווריד הזנב של עכבר הנושא גידול, ותמונות פלואורסצנציה נרכשות באמצעות מערכת דימוי אופטי רב-מודאלית. לאחר ההמתה, הגידול והאיברים נאספים ומדומיינים שוב כדי לזהות חלקיקים פלואורסצנטיים בתוך תאי הגידול.לאחר מכן מבצעים דימוי קונפוקאלי in situ. ניתוח התמונות שהתקבלו מדגים התמקדות וחדירה כמותית של ה-her docs אל תוך גידולים לאחר הזרקה סיסטמית. יתרון מרכזי של טכניקות דימוי רב-מודאליות על פני טכניקות קיימות, כגון מצב דימוי בודד, הוא אספקת מידע מרובה ומשלים שיכול לשפר את הניתוח ואת הכימות של המסירה אל הגידול.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הולכת התרופות, כגון השאלה האם תרופה ממוקדת לא רק מגיעה לגידולים אלא חודרת בפועל אל תוך תאי הגידול. את הפרוצדורה ידגימו ד"ר J Yun Wang, עמית פוסט-דוקטורט לשעבר במעבדתי, ו-Janet Markman, סטודנטית לתואר שני כיום, בפרוטוקול זה. בני שישה עד שמונה שבועות.נעשה שימוש בעכברים חדשים הנושאים גידולים קסנוגרפטיים תת-עוריים דו-צדדיים בשפתיים. הכין את התמיסה להזרקה סיסטמית על ידי ערבוב של כמות מספקת של HeroX עם סליין סטרילי כדי להגיע לנפח של 0.2 מיליליטרים עבור מינון של 0.004 מיליגרם לקילו של HeroX לכל הזרקה. שאב בעדינות 0.2 מיליליטרים מתערובת ה-HeroX למזרק אינסולין של 3/10 סס"מ המצויד במחט בכישור 29.הקפידו לוודא שאין בועות אוויר לאחר ההרדמה. הזרקו את תערובת המזלג כולה לווריד הזנב לאחר ההזרקה. לחצו על הזנב כדי למנוע איבוד דם מאתר ההזרקה.לאחר הפסקת הדימום, נקה את אתר ההזרקה באמצעות מטבון סטרילי והחזר את העכבר לכלוב. חזור על ההזרקה באותו עכבר במשך שישה ימים רצופים נוספים. פעם ביום, ניתן לזהות את הצטברות הפלואורסצנציה של HeroX בגידולים עד ליום ההזרקה האחרון.יום שבע, שימוש במדמיימר רב-מצבים. הפרוצדורות כאן עושות שימוש במערכת דימוי אופטית בעלת יכולות של עוצמת פלואורסצנציה, פלואורסצנציה ספקטרלית, זמן חיים ודימוי קונפוקאלי תוך-חי (intra vital).המצלמה מקוררת בעלת הרגישות הגבוהה וקווי הלייזר בעלי ההספק הגבוה המשולבים במערכת זו מספקים תמונות פלואורסצנציה בניגודיות גבוהה יותר בהשוואה למערכות דימוי אופטיות מסחריות, במיוחד עבור זיהוי in vivo של פלואורסצנציית doxorubicin. הפעל את מצב ה-multimode של מכשיר הדימוי האופטי in vivo בתוכנה. בחר מסנן מעביר פס (band pass filter) של פליטה המתאים לזיהוי פלואורסצנציית doxorubicin.הפעל את הלייזר והצב מסנן פס-מעבר (band pass filter) לעירור בנתיב האופטי של הלייזר. לאחר הרדמת עכבר בתא הרדמה באמצעות איזופלורן, העבר אותו לתא הדמיя של המדמה האופטי הרב-מצבי למקרה חי (multimode in vivo optical imager). הנח קונו אף על אפו של העכבר ופתח את הזרימה כדי להעניק הרדמה רציפה.במהלך רכישת הדמויות, רכשו דמויות פלואורסצנציה באמצעות זמן חשיפה של חמישה עד 15 שניות. ניתן לדמות את הפלואורסצנציה של Her doc בגידולים ובאיברים ספציפיים, כולל הכבד, הכליות, הטחול, הלב ושריר שלד שנלקחו מעכברים שהורדמו 24 שעות לאחר יום ההזרקה האחרון. הפעילו את המדמה האופטי הרב-מצב עבור in vivo.כפי שנעשה קודם לכן, הניחו את הגידולים ואיברים ספציפיים מסודרים עלה צלחת פטרי. בתוך תא הדמיה של מדמיה אופטי רב-מצבים למסוים (multimode in vivo optical imager), רכשו תמונות פלואורסצנציה של הרקמות תוך שימוש בזמן חשיפה של 5 עד 15 שניות. לאחר מכן, חזרו על אותן רכישות תוך שימוש בצלחת פטרי ריקה, שתשמש כרקע לאחר הרכישה.בצע ניתוח ועיבוד תמונה, כולל תיקון רקע או התאמת ניגודיות (contrast). דימות קונפוקאלי in situ מאפשר זיהוי וניתוח של הצטברות הגידול של ה-herd ברמה התאית. השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי.בחר באור לייזר באורך גל של 488 nanometer לעירור של doxorubicin ובאורכי גל פליטה של 560 nanometer עד 620 nanometer. לצורך זיהוי פלואורסצנציה של doxorubicin, בחר בעדשה אובייקטיבית של 40x או 63x והנח עליה טיפה של שמן אימרסיה. הנח את הגידולים מהעכבר שהורג בשיטה הומנית על צלחת פטרי כדי למנוע דגרדציה של הרקמה.לאחר מכן, העבירו את הגידולים לתא delta T לצורך דימות קונפוקאלי. רכשו תמונות קונפוקאליות של הגידולים בעומקי מיקוד רצופים, עם גודל צעד של 1 מיקרון ועובי של 20 מיקרון. דוגמה לתמונות שנרכשו ברצף לאורך ציר Z מוצגת כאן.צור היטל Z בעוצמה מקסימלית (maximum intensity Z projections) של התמונות. לאחר מכן, באמצעות ImageJ או תוכנה דומה, חשב את עוצמות הפלואורסצנציה הממוצעות של תמונות היטל ה-Z בעוצמה מקסימלית עבור יחס שדה הראייה הכולל. דימות ואנליזה ספקטרליים מטריים מאפשרים הבחנה בין דוקסורוביצין, פלואורסצנציה ואוטופלואורסצנציה.בעזרת מיקרוסקופ קונפוקאלי פלואורסצנטי עם סריקת לייזר, רכשו 15 תמונות של הגידולים שעברו טיפול ב-HeroX ואלו שלא טופלו, בעומק מוגדר, בטווח ספקטרלי של 510 עד 650 nanometers עם גודל צעד של 10 nanometers ועירור באור של 488 nanometer, תוך שימוש במיקרוסקופ קונפוקאלי Leica SPE. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 100 micromolar של doxorubicin במי מלח. בצעו דימוי ספקטרלי של תמיסת ה-doxorubicin בריכוז 100 micromolar.כדי להשיג את החתימה הספקטרלית הטהורה של פלואורסצנציית דוקסורוביצין. רכוש את החתימה הספקטרלית של האוטופלואורסצנציה מקוביית התמונה על ידי דימות של גידולים שלא טופלו. לאחר איסוף כל הנתונים, צור חתימות ספקטרליות של ייחוס, בצע סיווג ספקטרלי של התמונות ובצע הפרדה ספקטרלית לינארית (linear spectral unmixing) של תמונות אלו כדי להשיג הערכה כמותית של הצטברות הדוקסורוביצין בגידולים.תמונות פלואורסצנציה קונפוקאליות התקבלו בעומקי מיקוד שונים in situ, ולאחריהן בוצע Z projection של עוצמה מרבית לתמונות ונמדדה עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של התמונה שהושלכה. הפלואורסצנציה הגבוהה בגידול המוצגת בתמונה זו היא טיפוסית לאחר מתן סיסטמי של her docs ומעידה על התמיקה המועדפת של החומר בגידול. הפלואורסצנציה שזוהתה בשריר השלד אינה טיפוסית ועשויה לנבוע מחריגות בהליך ההזרקה.מבחינה איכותית, בתמונה זו הרקע נמוך. לצורך ניתוח כמותי, מבוצע תיקון רקע באמצעות צלחת ריקה כפי שמוצג כאן. בתמונה המתוקנת לרקע שנוצרה, ישנו אות רקע גבוה יותר בשולי התמונה בהשוואה למקור, כיוון שתמונת הרקע בעלת עוצמות נמוכות יותר בשולי התמונה.התמונות המערבדות המוצגות משמאל הן מייצגות של סריקות קונפוקליות של רקמת גידול שהושגו בעומקים עוקבים של מיקרון אחד. התמונה מימין מציגה את השילוב של התמונות המערבדות משמאל. תמונת השילוב מכילה את מידע הצבירה של HeroX על פני עומקי ה-Z המצוינים בכל פיקסל, ולכן הממוצע של עוצמות הפלואורסצנציה משקף כמותית את הצבירות הכללית של herd doc בגידולים בעומקים שונים.כדי להבדיל בין הפלואורסצנציה של doxorubicin לבין אוטופלואורסצנציה בגידולים, ולהבחין ביניהן כמותית באמצעות מדדי יחסי ספציפיות גבוהים, מבוצעים דימות ואנליזה ספקטרליים. תמונה זו מציגה את החתימות הספקטרליות הטהורות של doxorubicin.עוצמת הפלואורסצנציה של האזור המקווקו שסומן באורכי גל הפליטה המצוינים יוצרת היסטוגרמה המראה את הפרופיל של doxorubicin על פני ספקטרום אורכי גל של 510 עד 650 ננומטר. כאן מוצגות החתימות הספקטרליות הטהורות של autofluorescence. הפלואורסצנציה שנפלטה מגידול שלא טופל באורכי גל הפליטה המצוינים יוצרת שיפוע המייצג את פרופיל פליטת ה-autofluorescence.Reference.חתימות ספקטרליות נוצרו גם על ידי ערבוב של יחסים שונים של החתימות הספקטרליות הטהורות. באמצעות התוכנה, פיתחנו כל רפרנס. חתימה ספקטרלית מייצגת כאן פלואורסצנציה יחסית של ה-docks שהצטברו בגידולים ביחס לאוטופלואורסצנציה.לאחר השגת החתימות הספקטרליות של ה-docks וההפערה העצמית (autofluorescence), אותות ה-docks מופרדים באמצעות פירוק ספקטרלי ליניארי (linear spectral unmixing). האיור מציג את התמונה המעורבבת של ההפערה העצמית וה-her docs לפני הפירוק הספקטרלי, ואת תמונת ה-her docs המופרדת לאחר הפירוק הספקטרלי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לשלב עצימות פלואורסצנציה, comfort car ומודליות של דימות ספקטרלי כדי לשפר את הניתוח והכימות של אספקת גידולים.אל תשכחו שעבודה עם doxorubicin עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות כפולות והחלפת כפפות תכופה במהלך ביצוע פרוצדורה זו.

analysis-targeted-viral-protein-nanoparticles-delivered-to-her2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת"ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

דוגמא של תרופה הננו על בסיס חומצת polymalic מוצגת לקראת תכנון רציונלים של רפואה אישית כי הוא ישים לסרטן. הוא מתאר את הסינתזה של תרופת ננו לטיפול בסרטן השד אנושי מסוג HER2 חיובי בעכבר בעירום.

Biopolymers מבוסס חומצת Polymalic ננו עבור מיקוד של גידול סמנים מרובים: הזדמנות לרפואה מותאמת אישית?

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic עם מומנט מגנטי חזק וספיג חזק קרוב אינפרא אדום (NIR). הפרוטוקול כולל גם נטיית נוגדן לחלקיקים דרך מחצית Fc עבור יישומים ביו שונים הדורשים מיקוד ספציפי מולקולרי.

Nanoclusters סינתזה של Immunotargeted מגנטתי plasmonic

פפטידים ויראלי-derived מצמידים נוגדן-conjugates (ACs) היא גישה צובר תאוצה בשל הפוטנציאל להעברת מטענים מולקולרית עם הצטברות תאי הגידול מוגברת. ניצול שיטות נפוצות כדי להעריך את ההטיה פפטיד, AC הצטברות תאיים המטען ואת הגידול מיקוד, פרוטוקול זה מסייע החוקרים במהלך שלבי הפיתוח מפתח.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

מאמר זה נועד לספק פרוטוקול לבידוד ותרבות של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן שד טריפל שלילי ויישומה למחקר פרה-אקליני של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את המיקרו-סביבה של הגידול.

בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן השד לחקר חלקיקים ממוקדים

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לאספקה in vivo של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטיים הנושאים אוליגומרים של RNA לסרטן שד גרורתי במודלים של בעלי חיים, ומספקים גישה בת קיימא מבחינה קלינית להשתקה טיפולית של חומצות גרעין אונקוגניות.

ניטור הצטברות ננו-תרופות בגרורות סרטן השד בעכברים

מחסום הדם-מוח הוא משוכה משמעותית במתן טיפולים לגליובלסטומה, מחלה שאין לה תרופה. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמת ננו טיפולית של תחמוצת ברזל מונחית תמונה in vivo שיכולה לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר בגידול.

העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה

למדו כיצד לזהות ולנתח את אספקת ננו-חלקיקי HerDox ממוקדי גידול באמצעות הדמיה אופטית רב-מצבית. שיטה זו מאפשרת הערכת מיקוד וחדירה לתאי גידול בטיפול בסרטן.

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים

גלה סרטונים נוספים