Nephrectomy 5/6th בשילוב עם דיאטת מלח גבוהה ועיכוב תחמוצת החנקן synthase כדי לגרום למחלת כליות כרונית בחולדת לואיס
3 ביולי 2013
שיטת שני שלבים להקמת מחלת כליות כרוניות (CKD) בחולדת לואיס על ידי ניתוח להסרת הכליה 5/6th מסה מתוארת. שילוב של ההליך כירורגי, NOS-עיכוב ותזונה עתיר מלח מביאים למודל דומה למחלת כליות כרוניות אנושית, המאפשרים מחקר ופיתוח של מנגנונים של התערבויות טיפוליות חדשניות סיבתיים.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשרות מחלת כליות כרונית בחולדה מסוג Lewis. דבר זה מושג תחילה על ידי מתן חוסם חמצן חנקני (nitric oxide blocker), NG Nitro, L arginine או LNNA, למשך תקופה של ארבעה שבועות. לאחר מכן, הכליה הימנית כולה מוסרת.
לאחר שבוע, מוסרת שתי שלישים הכליה השמאלית. לבסוף, תוך כדי טיפול ב-LNNA ותזונה עשירה במלח, עוקבים לאורך זמן אחר התפתחות של אי-ספיקת כליות בחולדה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המעידות על מחלה כרונית מבוססת של הכליות באמצעות איסוף שתן למדידת חלבון, ומדידת hematocrit ו-UIA בדם, בפלזמה ו/או בשתן, וכן מדידת לחץ דם סיסטולי.
תפקוד הכליות נקבע בסופו של דבר על ידי סביבתו של אינולין וקצב הפינוי של פארה-אמינו-היפוראט, או PAH clearance. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנפרולוגיה, כגון הבנה טובה יותר של הפתולוגיה של CKD, וניתן להשתמש בה לבחינת ההשפעה של התערבויות טיפוליות. ארבעה שבועות לפני הליך הנפרקטומי הראשוני, התחל במתן של 20 milligrams per liter של מעכב nitric oxide synthase בשם LNNA במי השתייה של החולדה.
בהתאם ללוח זמנים זה. לפני תחילת הפרוצדורה, השתמש ב-70% alcohol כדי לחטא את השולחן. כדי להתכונן לניתוח, התחל בסטריליזציה של המכשירים הבאים: שמיכה אחת, פינצטת רקמה סטודנט אחת באורך 12 סנטימטר עם שן אחת עד שתיים, פינצטת סטודנט סטנדרטית אחת, שתי פינצטות סימקין, מספרי מאיו אחד, מספרי איריס סטודנט אחד ומחזיק מחטיםה של אולסון הגר עם מספריים.
לאחר מכן, הכינו את הרשימה הבאה של הציוד והחומרים. שולחן ניתוח עם פד חימום ומנורה, חמצן ואיסופלורן, רצועות נייר. מכשיר גילוח, מכשירים כירורגיים סטריליים, גזות סטריליות בגדלים 5x5 ו-10x10, אלכוהול 70%, תמיסת סודיום כלוריד 0.9%, מזרק של 1 מיליליטר, מחטים במידה 25 gauge, פדי ג'ל-פום (gel foam), תפרי Vicryl במידות 4.0 ו-5.0, בופרנורפין במינון 0.03 מיליגרם לקילוגרם, וכלוב נקי עבור החולדות לאחר הניתוח.
לאחר השראת הרדמה בתא השראה עם 4% isoflurane ומתן אלגזיה מקדימה, העבירו במידת הצורך את החולדה אל משטח החימום על שכיבה על צדה השמאלי על השולחן, והנשימו אותה באמצעות קונוס לאף עם תערובת של 2% isoflurane וליטר אחד של חמצן. גלחו את צד הבטן של החולדה והשתמשו באלכוהול לחיטוי אזור הניתוח.
מאחר שהניתוח מתבצע בסביבה חצי סטרילית, אנו מחטאים את העור האדום באלכוהול בלבד להכנה סטרילית יותר. ניתן להשתמש בקרצוף עם Betadine; יש לחבוש כיסוי ראש ומסכה, ולאחר מכן לשטוף ולחטא את הידיים לפני לבישת כפפות כירורגיות סטריליות. לאחר מכן, באמצעות פינצטה אנטומית ומספריים קהים, בצעו חתך של 1 עד 1.5 סנטימטר במקביל לצלעות.
לאחר מכן, באמצעות דיסקציה קהה של שרירי הגב, חשפו את הכליה הימנית. ברגע שהקטב התחתון של הכליה נראה, השתמשו בפינצטה קהה קטנה כדי לתפוס בזהירות את רקמת השומן הפרי-רנאלית (perirenal fat). לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי למשוך בעדינות את השומן הפרי-רנאלי, תוך הקפדה לא להפריע לבלוטת האדרנל, והוציאו את הכליה החוצה כדי להפרידה מבלוטת האדרנל.
מקמו פינצטה באתר המדיאלי ברקמת השומן והזיזו בעדינות את הרקמה כלפי מעלה בין בלוטת האדרנל לבין הכליה. הניחו בעדינות את הכליה על גזה ונקו אותה משומן ומרקמת חיבור היקפית. זהו את העורק והוריד הרנלי וסמנו אותם באופן רפוי.
הנח תפיסה (ligature) עם קשר בודד מסביב לכלי הדם כדי למנוע מהתפיסה להחליק. לאחר החיתוך, הזז בעדינות את הקשר המשוחרר לאורך כלי הדם לכיוון האורטה, למרחק של כ-0.5 סנטימטרים, כדי ליצור מרווח בין הכליה לקשר. לאחר מכן, קשור שני קשרי כפול ללא חיתוך של קצות התפיסה.
אם חסום את זרימת הדם בהצלחה, צבע הכליה יהפוך מיד לחום. לאחר מכן, חתכו את כלי הדם הרנליים קרוב לכליה והוציאו אותה. משכו בעדינות את הקצוות הארוכים של הליגטורה כדי לבדוק אם יש דימום מכלי הדם הרנליים.
הליגטורה צריכה להישאר במקומה על הכלי. יש לחתוך את הקצוות הארוכים של הליגטורה. שאריות כלי הדם הכליתיים יסוגו אל תוך חלל הבטן.
השתמשו מיד בתפרי רצף 5.0 Vicryl לסגירת השריר השלדי בגפה האחורית. מזריקו תוך-שרירית 0.03 milligrams per kilogram של buprenorphine. לאחר מכן, השתמשו בתפרי 4.0 Vicryl תוך-עוריים לסגירת העור.
בשלב הבא, ייבשו בעדינות את הכליה שהוצאה באמצעות נייר סופג ושקלו אותה. אפשרו לחולדה להתאושש בכלוב נפרד ונקי, המוצב למחציתו על פד חימום עם גישה למזון ומים, ועקבו אחריה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. שבעה ימים לאחר מכן.
כהכנה לניתוח שני, חשב את המשקל של כשני שלישים מהכליה הימנית והכן חתיכות קטנות של ג'ל-ספוג (gel foam). חזור על הפרוצדורה שהודגמה כדי לחשוף את הכליה השמאלית ולהפריד ממנה את בלוטת העל-כלית. הנח מספריים חדות מסביב לקוטב העליון של הכליה השמאלית והסר את הקוטב העליון במכה אחת; כסה מיד בחתיכת ג'ל-ספוג והפעיל לחץ קל בעזרת גזה סטרילית.
לאחר מכן, בצעו כריתה של הקוטב התחתון של הכליה וכסו אותו באופן דומה כדי למנוע קרישה על העור. הרימו את הכליה והשתמשו בגזה סטרילית כדי להפעיל לחץ קל על שתי רפידות ה-gel foam עד להפסקת הדימום. אם הדימום נמשך ברפידת ספוג אחרת, החזירו את שארית הכליה עם רפידות ה-gel foam הדבוקות אליה אל תוך הבטן וסגרו את השריר ואת העור.
פעלו לפי אותו הליך שתואר קודם לכן כדי לנטר את ההתאוששות ולשכן את החולדה. לאחר כריתת כליה חלקית, נשאר כשישית מהמסה הכלית הכוללת. איור זה מציג את האחוז המחושב של המסה הכלית שהוסרה מהכליה הימנית, כולל ממוצע וסטיית תקן.
בניסויים הקודמים שלנו, בשבוע שלאחר מכן, מתרחשת היפרטרופיה של הכליה השמאלית בעקבות נפרקטומיה חד-צדדית, מה שמוביל להערכה חסרה קלה של כמות רקמת הכליה המועדפת להסרה, אשר התבססה על המשקל המחושב של הכליה הימנית. עם זאת, מכיוון שלא ניתן לקבוע את משקלה של הכליה השמאלית, זוהי הדרך המדויקת ביותר להסיר כחמישית עד שישית ממסת הכליה. התקדמות האי-ספיקה הכלית נמעקבת באמצעות איסוף שתן למדידת חלבון וקריאטינין, דם לבדיקת Urea וקריאטינין בפלזמה, ומדידת לחץ דם סיסטולי.
ניתן לחשב את ס clearance של קריאטינין, אך הוא נוטה להמעיט בערך הירידה ב-GFR עקב הפרשה טובולרית נרחבת של קריאטינין בחולדות, מה שמדגיש את חשיבות שיטת תו התקן (gold standard) לקביעת תפקוד כלייתי באמצעות ס clearance של אינולין ו-PAH, כפי שתיארו Conners ואחרים בפרוצדורה המלאה. ס clearance של אינולין ו-PAH מחושבים על סמך ריכוזם בדגימת השתן, קצב זרימת השתן וריכוזם בפלסמה. עם הזמן, חולדות עם מחלת כליות כרונית או CKD מפתחות יתר לחץ דם, אנמיה, פרוטאינוריה, ירידה משמעותית בשיעור הסינון הגלומרולרי ובזרימה האפקטיבית של פלסמה כלייתית.
לאחר ששה שבועות התפתחה מחלה כלית כרונית (CKD) מבוססת, המהווה נקודת זמן מתאימה לבחינת התערבויות להצלה; נצפתה התקדמות חזקה של יתר לחץ דם והפרת חלבונים בשתן (protein urea) עם הגעת הזמן, בעוד שההמטוקריט והתפקוד הכליתי מראים הידרדרות קלה. תסמינים אחרים שלא היו מוקד ניסויינו כוללים שיבושים במטבוליזם של סידן-פוספאט וליפידים, ורבים אחרים התלויים בזן החולדות. התפתחות ה-CKD עשויה להשתנות באופן ניכר בחולדת לואיס ששימשה כאן.
תזונה עתירת מלח וחוסם תחמוצת חנקן הוספו כדי להשרות יתר לחץ דם ותפקוד לקוי של האנדותל. זהו שלב קטן. ניתן לבצע טכניקה זו בכ-20 עד 50 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות מחלה כלית כרונית בעכברים מסוג loose reds באמצעות ביצוע כריתת כליה חלקית בשלבים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה דו-שלבית להשראת מחלה כלית כרונית (CKD) בחולדה מסוג Lewis. הגישה משלבת הסרה כירורגית של מסה כלית, עיכוב של תחמוצות חנקן (nitric oxide) ותזונה עשירה במלח, כדי ליצור מודל המדמה CKD בבני אדם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נפרולוגיה
- מודלים של בעלי חיים
- מחקר על מחלות כליות כרוניות
רקע
- מחלה כלית כרונית היא בעיה בריאותית משמעותית.
- מודלים של בעלי חיים חיוניים לחקר המכניזמים של CKD.
- חולדת לואיס היא מודל מתאים למחקרים מסוג זה.
- השראה של CKD יכולה לסייע בבחינת התערבויות טיפוליות חדשות.
מטרת המחקר
- לבסס מודל מהימן של CKD בחולדות לואיס.
- לחקור את המנגנונים הסיבתיים של CKD.
- לסייע בפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מתן חוסם תחמוצת חנקן (LNNA) למשך ארבעה שבועות.
- הסרה כירורגית של הכליה הימנית כולה.
- הסרה עוקבת של שני שלישים מהכליה השמאלית שבוע לאחר מכן.
- ניטור של אי-ספיקת כליות באמצעות אנליזה של שתן ודם.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של CKD במודל חולדות לואיס.
- מדידה של רמות חלבון והמטוקריט בשתן.
- הערכה של פלזמה מדם ושתן עבור UIA.
- מעקב אחר שינויים בלחץ הדם הסיסטולי לאורך זמן.
מסקנות
- המודל מדמה ביעילות CKD אנושי.
- הוא מספק תובנות לגבי המכניזמים של אי-ספיקת כליות.
- פוטנציאל לבדיקה של התערבויות טיפוליות חדשות עבור CKD.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מודל נפרקטומיה של 5/6 בכנשכי לואיס, בשילוב עם תזונה עשירה במלח ומעכבי סינטז של תחמוצת החנקן, מספק מערכת פרה-קלינית חזקה לחקר התקדמות מחלה כלית כרונית (CKD) והתערבות טיפולית. מודל אינטגרטיבי זה מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית וביטחון חזוי עבור מחקר תרגומי המכוון ל-CKD. התוצאות הכמותיות ומאפייני המחלה הרלוונטיים תומכים בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח מותאמי סיכונים בשלבי גילוי מוקדמים ובמסלולים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של הפתופיזיולוגיה של CKD ותיקוף של היפותזות מכניסטיות בסביבת in vivo מבוקרת.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול של פגיעה גלומרולרית וטובולו-אינטרסטיציאלית פרוגרסיבית הרלוונטית למחלה בבני אדם.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי לבחירת מטרות וסריקה של מסלולים הקשורים ל-CKD.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מודל חיהי מוכח להערכת התערבויות פוטנציאליות והשפעתן על התפקוד הכליתי.
- מספק מדדים כמותיים סטנדרטיים, כגון סקרנס של inulin ו-PAH, חלבון בשתן ולחץ דם.
- מאפשר הערכה הדירה של יעילות תרכובות בהקשר רלוונטי למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מאפייני CKD בבני אדם, ובכך תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים ובתיקוף פרה-קליני.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לבדיקות פרה-קליניות באמצעות מידול של תפקוד כליות פגום ויתר לחץ דם פרוגרסיביים.
- מספק מידע לקבלת החלטות מותאמות סיכון לגבי קידום תוכניות טיפוליות ל-CKD.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מודל זה ממויעד לשלבים החל מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לאישור פרה-קליני למחקר של CKD.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על מנגנוני CKD ומעורבות של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת תרכובות ובדיקת מוכנות של המערך (assay).
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של GFR, ERPF, proteinuria ולחץ דם לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים באמצעות נקודות סיום רלוונטיות למחלה והתאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבדיקות חוזרות של התערבויות ב-CKD ומחקרי מנגנונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של CKD.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של נהלים ותפוקות כמותיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון באמצעות מידול של התקדמות CKD הרלוונטית לבני אדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של מועמדים לטיפולים ב-CKD.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנפרקטומיה כירורגית ובניהול מודלים של בעלי חיים.
- מחייב גישה לתשתית אנליטית למדידות ס clearance של אינולין ו-PAH.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים כירורגיים ואנליטיים.
- ייתכן שם צורך בהתאמה עבור זני חולדות שונים או תתי-סוגים של CKD.
- יש להתחשב בשונות המודל ובתגובות ספציפיות לזן בתכנון המחקר.
