Name: יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: חקור את השיטה ליישום קלאמפ דינמי עם מוליכויות סינפטיות בתאי עכבר גנגליון רשתית. טכניקה זו מאפשרת חקירת השפעות קלטים מעוררים ומעכבים על פעילות הנוירונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המועצה למחקר האוסטרלית (ARC DP0988227) וחקר המדעים ביו גרנט היוזמה מהדיסציפלינה של המדע ביו, אוניברסיטת סידני. מגבר הצמד תיקון ציוד EPC 8 מומן על ידי קרן האתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. מערכת ציוד InstruTECH LIH 8 8 נתונים הרכישה נרכשה בכספים מרבקה ל &#39;קופר קרן וקרן אתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. ברצוננו להודות לסוקרים אנונימיים לקבלת ההצעות והערות תובנה שלהם.

1. הגדרה כללית והכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העכבר בחושך במשך 30 דקות (במטרה להפחית את רמת המתח שלה). בזמן ההמתנה, להכין 1 ליטר של פתרון תאי. הראשון לפזר 1.9 גרם של סודה לשתייה בחץ ליטר המים מילי-Q. ה-pH שלו נשמר על ידי 7.4 מבעבעים עם 95% O 2 ו 5% CO 2. חמש דקות לאחר מכן, לפזר 8.8 גרם של איימס בינוני ב100 מ&quot;ל של מים מילי-Q, להוסיף לפתרון סודיום ביקרבונט, עליון עד 1 ליטר עם מים מילי-Q ומערבבים היטב. שמור פתרון זה carboxygenated לשארית של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 250 מ&quot;ל של איימס בינוני carboxygenated ולהגדיר את המערכת בנוזל reperfusion אלקטרו ההגדרה. שמור את פתרון carboxygenated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחיד למרוח שכבה דקה של שומן ואקום על החלק התחתון של חדר זלוף. לאטום אותו עם פיסת כיסוי ולוודא שהוא אוויר חזק. קח כמות קטנה של שומן (~ 2 מ&quot;מ קוטר) ולמקם אותו בחלק העליון ומסתיים תחתון של החדר. הכדורים האלה יחזיקו את הרשת (מסגרת פלטינה מתוחה עם חוט דנטלי) במקום ולמנוע אותה לחיצה חזקה מדי על הרשתית. תקן את התא על גבי פלטפורמה וליישר את שני הפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים הוא מורדמים ראשון עם Isoflurane למשך 2 דקות, ולאחר מכן הקריבו על ידי נקע בצוואר רחם. להסיר במהירות את העיניים עם זוג מספריים קטנים (להבים מעוגלים), לשטוף ביסודיות עם נוזל חוץ תאי carboxygenated בכוס קטנה, ולאחר מכן למקם בצלחת פטרי מלאה בנוזל חוץ תאי carboxygenated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חור כניסה בקרנית (~ 2 מ&quot;מ מהקצה) באמצעות מחט מד 19. חזור לעין השנייה. צעד חשוב זה צריך להיות מהיר כדי לאפשר חמצון של שניהם הרשתיות. הסר קרנית אחד עם מספריים קטנים קשתית על ידי חיתוך במקביל לקצה שלה. בשלב הבא, להסיר את הקשתית ועדשה עם זוג מלקחיים בסדר. חזור לעין השנייה. העבר את כוס עין אחת לתוך כוס המכילהcarboxygenated פתרון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם להב סכין מנתחים, לחתוך כוס עין אחת לשתיים, כדי שתוכל לשטח את כל ההר, וכדי לקבל שני שלם mounts לרשתית. להפריד בזהירות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט באמצעות בדיקה לנתח בוטה או על ידי משייכתו בעדינות אותו. פעם אחת מנותק, הרשתית היא די שקופה. שימו לב למשטח הקמור הוא הצד הקולטני האור. המשטח הקעור הוא צד תאי גנגליון והוא עשוי להיצמד לעצמו בשל נוכחותם של הומור זגוגית דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים בסדר, להחזיק את הקצה של רקמת הרשתית המנותקת הקרובה לserrata האורה ולתפוס את serrata האורה עם זוג נוסף של מלקחיים עדינים, מושך אותו לכיוון מרכז הרשתית. זהו תהליך עדין ועלולים לקחת כמה ניסיונות. אם יצליח, serrata אורה, גוף הריסים והומור זגוגית יוסרו על ידי תהליך זה, והעקמומיות של הרשתית מצטמצמת (כלומר להחמיא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הקצוות, ולאחר מכן להעביר אותו לכלקאמרי איחוי עם תאי הגנגליון פונים כלפי מעלה. החזק את הרקמות במקום על ידי הצבת הרשת על גבי כדורי הגריז. הנח את הרקמה שנותרה עם כוס העין השנייה לשימוש מאוחר יותר. נהלים דומים לנתיחת רשתית מתוארים במידלטון וProtti 16 וPottek et al. 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חדר ההקלטה תחת מיקרוסקופ זקוף. מייד הקים זלוף המתמשך של הרשתית עם פתרון carboxygenated תאי (35.5 מעלות צלזיוס) בשיעור של 3 - 5 מ&quot;ל / דקה. ודא אלקטרודה ההארקה נמצאת במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצורף למיקרוסקופ הוא מצלמה דיגיטלית המאפשרת הדמיה של הרקמות. כל הסט עד יושב מעל שולחן אוויר (ספיגת זעזועים) ובתוך כלוב פאראדיי (שדות סטטיים ואינם סטטית חיצוניים בלוקים חשמליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור האור (אינפרא אדום,&gt; 850 ננומטר) ועם מטרת 40X, להביא את המיקוד שלה על גופי התא של תאי הגנגליון. מצא את האזור המרכזי של כל ההר לrecorדינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון קפוא של K + פתרון מבוסס תאי (300 μl, pH = 7.4) המכיל (מ&quot;מ) K-גלוקונאט: 140, חומצת HEPES: 10, MgCl 2: 4.6, ה-ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 וEGTA: 10. כל חומרים כימיים שנרכשו מסיגמה אולדריץ. </li></ol> 2. גופי תא תיקון של תאי הגנגליון ברשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש ראשונה ללטש את הקצוות של צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט, ולאחר מכן למשוך אותם עם חולץ microelectrode זכוכית עם שני שלבי חימום (התנגדות: 5 - 8 MΩ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של צהוב לוציפר (ריכוז סופי של 0.2%) לפתרון תאי, ומערבב היטב, וצנטריפוגות זה. בשלב הבא, להעביר את 85% העליון של הפתרון לתוך מזרק 1 מ&quot;ל, לחבר אותו ליחידת ilter F מיקרומטר 0.22, ולאחר מכן למחט מזרק לשימוש חוזר 30-G. שומר במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את פיפטה הזכוכית, בגודל קצה דומה לאלה המשמשים להקלטות, במחזיק בו ולהעביר אותו תחת מיקרוסקופ באמצעות micromanipulaטור. תחת מטרת 40X, לאט לאט להוריד את פיפטה עד שהוא עושה גומה קטנה על פני השטח של קרום הגבלה הפנימי. להתקדם בזהירות פיפטה קדימה עד שתופס כמות קטנה של רקמות, ולאחר מכן להעביר אותו כלפי מעלה ו / או לצדדים לקרוע חור קטן כדי לחשוף את גופי התא של תאי הגנגליון. קטן החור, גבוה יותר את מידת היושרה של רשת הרשתית נשמר. אם תרצה, sulforhodamine 101 (SR101; 0.5 - 1 מיקרומטר) ניתן להוסיף למדיום תאי לתייג תאי עצב שניזוקו על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את פיפטה נקיות עם 8 - 10 μl של פתרון תאי. הכנס אותו לבעל המצורף לבמה את ראשו של המגבר ולוודא את האלקטרודה כלוריד כסף כלור היא שקועה. בטל אם לכלוך ו / או בועות אוויר היא / הם הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל הציוד. אנחנו השתמשנו מגבר מהדק תיקון 8 EPC הנשלט על ידי PatchMaster להשיג כל תא הקלטות בקון מהדק מתחפיגורציה. שימו לב שיכולים לשמש גם מגברים אחרים המאפשרים הקלטות מהדק הנוכחיות במצב במהירות. להחיל ולשמור על לחץ חיובי בפתרון פיפטה. בחר תא בגוף תא גדול כל כך סביר להניח שזה תא גנגליון במקום תא amacrine עקור או תא גליה. לאט לאט להוריד את קצה פיפטה כך שזה עושה גומה קטנה על פני השטח של הקרום, לעצור, ולשחרר את הלחץ. מייד להוריד את פוטנציאל ההחזקה ל-- 60 mV. ברגע שgigaseal (GΩ) מושגת ביניהם, בעדינות למצוץ לשבור את הקרום כדי להשיג תצורת מהדק תיקון כל תא. הליך זה הוא צעד עדין, אם לחץ שלילי יותר מדי מוחל, אז החיבור הופך דולף, אם מעט מדי, הקרום נשאר שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך זמן, לוציפר צהוב ימלא את התא, ומאפשר הדמיה של המורפולוגיה של התא. אם יציב, הגדרה זו צריכה להימשך 30 דקות או יותר. </li></ol> 3. הקלטות של תאי הגנגליון שימוש Dynamiג קלאמפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, בדיקה נוכחית במתח (מ - 75 עד 35 + mV כל 10 mV) מבוצע באמצעות PatchMaster. המשך לבדיקות מאוחרות יותר רק אם Na גדול + נוכחי (&gt; 1 Na) הוא הווה. יצוין, כי באירוע הנדיר שבו תא amacrine העקורים הוא תוקנו, במקרה זה, לא יגיב עם רכבות של פוטנציאל פעולה לזריקות שוטפות לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LabVIEW הפתוח ולבצע את תכנית Neuroakuma נכתב המותאמת אישית, ולאחר מכן לטעון את גל מוליכות שונים. להגדיר מספר חוזר עד 8 (6 - 8 למטרה סטטיסטית). הגדר פוטנציאלי היפוך של conductances המעוררות והמעכב וב0 - 75 mV בהתאמה. בחר זוג תואם אחד conductances המעוררות והמעכב לבדיקה. עקבות מוליכות מעוררות (בירוק) ועקבות מוליכות מעכבות (באדום) יופיעו בפנל התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לPatchMaster, בחר מצב מהדק נוכחי, ולעבור באופן מיידי למצב מגבר המהדק הנוכחי &quot;CC + תקשורת מהירה&quot;. מצב זה מאפשר לACCurately בצע שינויים מהירים בפוטנציאל הממברנה. אם איטום טוב בין הקרום ופיפטה נשמר, / אין צורך בפיצוי קטן, אחרת ההקלטה לא תימשך זמן רב. בNeuroakuma, לחץ על הכפתור &quot;הרשומה&quot;. התגובה התאית (בדרך כלל עם פרץ phasic של פוטנציאל פעולה, איור 1 א) תופיע בפנל העליון. הזרק נוכחי לתוך התא עם דרוג נמוך של conductances הראשונה, אם מעט / אין תגובה הוא ציין, להגדיל במרווחים קטנים עד שהוא מייצר תגובה חזקה. הזרקה נוכחית מוגזמת יכולה להרוג את התא. בדיקות לאחר השלמה, בחר זוג חדש של צורות גל מוליכות, חזור מעל לכל הזוגות של conductances הפיזיולוגי והמלאכותית. הזרמים הפיסיולוגיים (אני) הוזרקו בזמן אמת המבוססים על: אני (לא) = G exc (t) x (V מ &#39;(t) - V exc) + G INH (t) x (V מ&#39; (t) - V INH) </li></ol> מוליכות (G בNS) יכולה להיות סאיnaptic או מלאכותי. מניסויים קודמים שבוצעו על ידי Protti, די מרקו, הואנג, Vonhoff, נגויין וסולומון (תוצאות לא פורסמו) בתגובה לגירויים חזותיים שונים בתנאי בקרה ובנוכחות של צורות גל tetrodotoxin מוליכות הסינפטי מעוררות ומעכבות נאספו (TTX, 1 מיקרומטר) . גל מוליכות מלאכותי היה מודל באמצעות פונקצית אלפא. V מ &#39;(בmV) הוא פוטנציאל הממברנה המוקלט. G ו-G exc INH מייצגים conductances המעוררות והמעכב בהתאמה תוך exc V ו-V INH מייצגים את פוטנציאלי ההיפוך של conductances המעוררות והמעכב, בהתאמה. זמן הוא לא בטרשת נפוצה. קצב דגימה הוא 40 קילוהרץ. אני S = אני 0 (ט / α) דואר αt המשוואה לעיל היא פונקצית אלפא (אני 0 = זרם מרבי; 1 / α = זמן השיא (שניות -1) של נוכחי). זמן העלייה וזמן דעיכה של הסינפטינוכחי מוכתב על ידי α 4. המוליכות מעוררות נותרות ללא שינוי בזמן ההשהיה של מוליכות מעכבות שונה, הפחתת העיכוב ביחס להתפרצות של עירור (איור 2 ד). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטה, לחזור בו בזהירות פיפטה כך גוף התא נשאר ללא פגע. מייד לתקן רקמות בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות, ואחרי שלוש דקות עם 10 שוטף 0.1 מ &#39;של חיץ פוספט. מכניס למקרר ולבצע נוגדנים מכתימים את היום שלמחרת או בתוך שבוע. </li></ol> 4. מכתים נוגדן נגד תאי רשתית גנגליון וציפר צהובים מלאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים נוגדן נגד תאי וציפר צהובים מלא הגנגליון בטמפרטורת חדר (העיקרי נגד לוציפר ארנב IgG הצהוב (= דילול 1:10,000) לחמישה ימים; ביום השישי, מכתים הלילה עם שני עיזים נגד ארנב IgG (= דילול 1:500 )). הרטב לעלות רשתית במדיה שימור פלורסנט. כיסוי להחליק ולאטום עם המסמר עמ &#39;olish. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות confocal של המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal Spec-השני לייקה (איור 1). נוכחותו של האקסון מאפשרת אישור לתאי גנגליון. </li></ol>

<ol><li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Johnson, D., Wu, S. M. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+D+%22Foundations+of+cellular+neurophysiology%22">Foundations of cellular neurophysiology</a>. , The MIT Press. London. (1995).</li>
<li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li>
<li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li>
<li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li>
<li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons%3A+a+dynamic+clamp+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li>
<li>Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButera%2C+R+%22Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series%3A+Springer+Series+in+Computational+Neuroscience%22">Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience</a>. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).</li>
<li>Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+technique%3A+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+N%3A+Journal+of+Nanoengineering+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li>
<li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).</li>
</ol>

כל ההליכים אושרו תחילה על ידי ועדת האתיקה של הטיפול בבעלי החיים באוניברסיטה של ​​סידני, ולאחר מכן בוצעו בהתאם להנחיות של הקוד האוסטרלי של אימון לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה ).

כאן אנו מציגים את השימוש במהדק דינמי כדי להעריך את ההשפעה של היחס והתזמון יחסי של עירור ועיכוב בתפוקת תא הגנגליון ברשתית. מהדק דינמי עושה שימוש בסימולציות מחשב כדי להציג את conductances סינפטיים פיזיולוגית מוקלט או מלאכותי לנוירונים חיים. מתודולוגיה זו מספקת כלי אינטראקטיביים שבאמצעותו ניתן לשנות conductances ומוזרק לתוך נוירונים לחישוב השפעתם על תגובות עצביות. ניתן לקבל צורות גל מוליכות מניסויים שבהם גירויים חזותיים המשמשים להפעלה קולטנית אור בתנאי בקרה ובנוכחות של סוכנים תרופתיי...

הרשתית היא רקמה עצבית כמעט שקופה המצפה את החלק האחורי של העין. מחקרים רבים משתמשים ברשתית כמודל כדי לחקור את צעדיו הראשונים בעיבוד חזותי ומנגנונים של איתות הסינפטי. מאז רשת הרשתית בהכנה כל ההר נשארה שלמה לאחר נתיחה, הוא מייצג מערכת אידיאלית ללמוד אינטראקציות הסינפטי כתגובות הפיזיולוגיות שלו דומות מאוד לתנאים בvivo. כך, באמצעות רשתית מבודדת את המאפיינים של תאי העצב שלו ניתן ללמוד תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון (לביקורות על הטכניקה, ראה 6,9,13). זיהוי התרומה של מעגלים ומוליכים עצביים לתגובת תא גנגליון הספציפיים המדויקת, לעומת זאת, בדרך כלל הפריע כסוכנים תרופתיים לפעול באתרים שונים. תגובות פיסיולוגיות של תאי עצב ברשתית לאור, הגירוי הטבעי, ניתן להקליט עם pipettes זכוכית מלא בנוזל תוך תאי. באמצעות תיקון CLטכניקות מגבר, תגובות עצביות לגירוי אור ניתן להקליט כמו תנודות פוטנציאל הממברנה (מהדק נוכחי) או כזרמים (מהדק מתח). על ידי החזקת פוטנציאל הממברנה במתחים שונים וביישום ניתוח מוליכות בדיעבד, אפשר לבודד את תשומות סינפטיים מעכבות ומעוררות 5,12. סוג זה של ניסויים יכול להתבצע במדיום רחצה רגיל ובנוכחותם של סוכנים תרופתיים שונים כדי לבודד את תרומתו של נוירוטרנסמיטורים ואת הקולטנים לתגובות עצביות שונים. שפע של מחקרים ממעבדות רבות אפיין את התלות של תפוקה ותשומות spiking מעוררות ומעכבות על נכסי תמריצים כגון גודל, בניגוד, תדרי מרחב ובזמן, כיוון, כוונה ומשתנים גירוי אחר. אם כי אלה גישות ניסיוניות לספק מידע על הקשר בין התפוקה ותשומות ספייק סינפטיים כפונקציה של מאפייני גירוי,הפרשנות של התרומה של סוגי תאים מסוימים והתשומות סינפטיים לרגישות תא היא לא פשוטה. זאת בשל העובדה שהן בדרך כלל תשומות מעוררות ומעכבות להשתנות עם מאפייני גירוי ולכן, לא ניתן להעריך את ההשפעה המדויקת ששינויים בכל אחד מתשומות אלה יש בspiking העצבי. גישה חלופית כדי לעקוף מגבלות אלו היא לבצע הקלטות מהדק דינמיות, המאפשרות הערכה ביקורתית של התרומה של תשומות סינפטיים בודדות לspiking פלט. טכניקת המהדק הדינמית מאפשרת הזרקה ישירה של זרם לתוך התא ואת כמות המוזרקת נוכחי בזמן נתון תלויה בפוטנציאל הקרום נרשם באותה תקופה 1,2,3 (לסקירה, ראה 7,14). זוהי הגדרת מהדק נוכחי שונה שבו אינטראקציה משוב בזמן אמת, במהירות בין התא מתחת להקלטה והציוד הכולל חומרה מיוחדת, התוכנהומחשב מושגת. כמות המוזרקת הנוכחי לתוך התא מחושבת בהתאם. לפיכך, היתרון של שיטה זו הוא שהתא יכול להיות מגורה עם שילובים של צורות גל מוליכות שונות, והתגובה שלה תהיה לחקות את ההפעלה של קולטנים שמתווכים תשומות סינפטיים. לדוגמה, השוואה בין התגובה להזרקה של conductances המעוררות והמעכב לנקודה קטנה עם התגובה להזרקה של מוליכות הגירוי לנקודה קטנה מספקת מידע לגבי ההשפעה של עיכוב בתגובת תא בלבד. כמו כן, שילובים אחרים של conductances נרשם פיסיולוגיים יכולים להיות שותף הזריק לחשוף כיצד גירוי תלוי שינויים בconductances המעוררות ו / או מעכבות משפיעים על התפוקה בספייק. במחקר שלנו, נעשתה שימוש בטכניקת המהדק הדינמית כדי להדגים את ההשפעה של המשרעת והעיתוי של תשומות סינפטיים על מאפייני הירי של תאי הגנגליון ברשתית היחסי. conductances השוניםהמתקבל מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחות של סוכנים תרופתיים הועסקו כתשומות. בנוסף, conductances מלאכותי המבוסס על פונקציות אלפא שמשו גם כדי לחקור כיצד תשומות סינפטיים משולבות על ידי תאי עצב. לכן זו היא טכניקה צדדי המאפשרת סוגים שונים של מוליכות נוצרו גם מבחינה פיזיולוגית, פרמקולוגית או המחשוב להיות מוזרקים לתוך אותו תא גנגליון, ולכן השוואה של תגובות לתשומות אלה יכול להתבצע.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנט</חזק></td></tr><tr><td>אינהלציה איזופלורן, חומר הרדמה</td><td>Pharmachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ames Medium עם L-גלוטמט (אבקה)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>אשלגן גלוקונאט, סיגמא-אלדריץ' HEPES נטול מים,</td><td></td> מלח נתרן סיגמא-אולדריץ<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>תמיסת מגנזיום כלוריד ( 4.9 מול/ליטר)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP) מלח דיסודיום הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5'-טריפוספט מלח נתרן הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמין&#8211; thylether)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית</td> אבקת <td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>פרפורמלדהיד, 95%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 מ"ג/מ"ל)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עיזים נגד ארנב IgG (H+L) 2 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Conservation</td><td>Media BioFX מעבדות בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>צינורות זכוכית נימיים עם קצוות מלוטשים להבה (OD = 1.50 מ"מ, ID = 0.86 מ"מ, אורך = 15 ס"מ)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0794</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית חד שלבית זכוכית Micror&#8211; Lectrode Puller</td><td>Narishinge יפן</td><td>דגם PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 2</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 0.22 &mu; m Filter יחידה</td><td>Millipore Corporation</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock לשימוש חוזר מחט היפודרמית: 30 G</td><td>אחיין סמית '(אוסטרליה)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מחמם פתרון מוטבע יחיד</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>דגם SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה אוטומטי כפול</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס סטריאומיקרוסקופ SZ61</td><td>אולימפוס תאגיד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס מיקרוסקופ BX50WI: עם 40X אובייקטיבי</td><td>אולימפוס תאגיד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-30 V 2.5 A DC ספק כוח</td><td>דיק סמית אלקטרוניקה</td><td>Q1770</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה מיקרוסקופית דיגיטלית ProgResMF מגניב</td><td>Jenoptik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור MP-225</td><td>סאטר מכשיר חברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תיקון מהדק מגבר EPC 8</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8 מערכת רכישת נתונים</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחשב: DELL</td><td>Dell Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יישום קלאמפ דינמי עם conductances synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

תאי הגנגליון הם תאי עצב הפלט של הרשתית ופעילותם משקפת את האינטגרציה של קלטים סינפטיים מרובים הנובעים ממעגלים עצביים ספציפיים. טכניקות תיקון מהדק, מהדק מתח ובתצורות מהדק הנוכחי, משמשות בדרך כלל כדי ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של תאי עצב ולאפיין התשומות סינפטיים שלהם. למרות היישום של טכניקות אלה הוא אינפורמטיבי מאוד, הם מציבים מגבלות שונות. לדוגמה, קשה לכמת את האופן שבו האינטראקציות המדויקות של תשומות מעוררות ומעכבות לקבוע פלט תגובה. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בטכניקה שונה נוכחית מהדק, מהדק דינמי, המכונית גם מוליכות 1 מהדק, 2, 3 ובדקנו את ההשפעה של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות על רגישות עצבית. טכניקה זו דורשת הזרקה של זרם לתוך התא ותלוי במשוב בזמן אמת של פוטנציאל הקרום שלה באותו זמן. Injecteד הנוכחי מחושב מראש conductances מעוררים והמעכב, הפוטנציאלים סינפטיים היפוכם ואת הפוטנציאל המיידי הקרום של התא. פירוט השיטה הניסיוני, תיקון הידוק תאים כדי להשיג תצורה כל תא ותעסוקה של טכניקת המהדק הדינמית באות לידי ביטוי במאמר זה וידאו. כאן, אנו מציגים את התגובות של תאי הגנגליון ברשתית עכבר לצורות גל מוליכות שונות המתקבלות מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחותו של סמים. יתר על כן, אנו מציגים את השימוש בconductances מעוררים והמעכב המלאכותיים שנוצר באמצעות פונקציות אלפא לחקור את התגובות של התאים.

תרומתם של מקורות תשומות מעכבות לתגובות תא הגנגליון שונים באה לידי ביטוי באמצעות היישום של צורות גל מוליכות שונות. גל אלה התקבלו עם גירויים שונה של בהירות בתנאים רגילים ובנוכחותו של TTX, + חוסם מתח מגודרת Na ערוץ ש2A פעולת לוקי דור פוטנציאלי היחידה בקבוצת משנה של interneurons רשתית מעכב. איור מראה תגובה להזרקה של נציג גל מוליכות מעורר ומעכב שנרשם בתגובה לגירוי עם נקודה שחורה קטנה על רקע אפור בתנאים נורמלים. כשגל המוליכות הושג עם נקודה שח...

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעות של שינויים ביחס ובתזמון היחסי של קלטים סינפטיים מעוררים ומעכבים על פעילות הפריקה (spiking activity) של נוירונים, תוך שימוש בתאי גנגליון של הרשתית כנוירוני מודל. דבר זה מושג על ידי ביצוע patch לגוף התא של תא גנגליון ברשתית שלמה (whole mount retina), באמצעות פיפט זכוכית מלא בתמיסה תוך-תאית הדומית להרכב היוני הפיזיולוגי, ושימוש ב-Lucifer yellow כדי לזהות מורפולוגית את סוג התא. בשלב שני, באמצעות dynamic clamp, מוזרקות לגוף התא סדרות של גלי מוליכות מעוררים ומעכבים, אשר מייצרים שינוי בפוטנציאל הממברנה כתגובה. לאחר מכן, גלי מוליכות שונים שהתקבלו מניסויים פיזיולוגיים בתנאי ביקורת, או בנוכחות של תרופות, מוזרקים לגוף התא כדי לקבל את התגובות הנוירונליות התואמות.התוצאות מראות את ההשפעות של שינויים ביחס בין עירור לעכבה על פעילות הפריקה (spiking activity) של תאי גנגליון ברשתית, בהתבסס על הזרקת זרמים המורכבים ממוליכויות מעוררות ומעכבות באמצעות הקלטות clamp דינמי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון current clamp או voltage clamp, הוא שהיא מספקת כלי אינטראקטיבי שבאמצעותו ניתן להזריק לנוירונים את היחס ואת התזמון היחסי של מוליכויות סינפטיות מעוררות ומעכבות כדי לבחון את השפעתם על התגובות התאיות. מתודולוגיה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפקוד של מעגלי רשתית, כמו גם של רשתות נוירונליות אחרות במערכת העצבים המרכזית.התחילו את הפרוצדורה על ידי הגדרת מערכת הרפירפוזיה עם 250 milliliters של תווך aims מחמצן בקרבוקסי במערך האלקטרופיזיולוגי. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של גריז ואקום באופן אחיד על תחתית תא הפרפוזיה. אטמו אותו באמצעות מכסה זכוכית (cover slip) וודאו שהאיטום הוא הרמטי.לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של גריז בקצות העליונה והתחתונה של התא. הגריז יקבע את הסריג במקומו וימנע ממנו ללחוץ חזק מדי על הרשתית. כעת קבעו את התא על הפלטפורמה ויישרו את שני הפתחים לאחר מכן.יש להקריב את בעל החיים באמצעות פריקה צווארית לאחר הרדמה ב-isof fluorine. יש להוציא במהירות את העיניים באמצעות מספריים קטנים ומעוקלים. שטוף אותן היטב בתוך כלי כימי קטן המכיל נוזל חוץ-תאי מחומצן של קרביד, והנח אותן בצלחת פטרי המלאה בנוזל חוץ-תאי מחומצן של קרביד.תחת מיקרוסקופ דיסקציה, צרו חור הכנסה באמצעות מחט gauge 19 בקרנית, במרחק של כשני מילימטרים מהקצה בשתי העיניים. שלב חשוב זה צריך להתבצע במהירות כדי לאפשר חמצון של שתיהן. לאחר מכן, הסירו קרנית אחת בעזרת מספרי איריס קטנים על ידי חיתוך במקביל לקצה שלה.בשלב הבא, הסירו את הקשתית ואת העדשה באמצעות פינצטה עדינה וחזרו על הפרוצדורות עבור העין השנייה. העבירו כוס עין אחת לכלי ביקר המכיל את התמיסה החוץ-תאית מחומצנת בקרבוקס. בעזרת להב סכין המנתח, חתכו כס עין אחת לשניים והפרידו בעדינות את הרשתית מהאפיתליום הפיגמנטי באמצעות גשש ניתוח קהה או על ידי משיכה עדינה.לאחר מכן, החזיקו את קצה רקמת הרשתית שהופרדה קרוב ל-aura Serta באמצעות זוג פינצטות עדינות, ואחזו ב-aura serta עם זוג פינצטות עדינות נוסף. משכו אותה לעבר מרכז הרשתית. זהו תהליך עדין שעלול לדרוש מספר ניסיונות.אם הפעולה הצליחה, הגוף הריסני והזגוגית יוסרו ועקמומיות הרשתית תקטן. לאחר מכן, יש לקצץ את הקצוות ולהעביר את הרשתית לתא הפרפוזיה כאשר תאי הגנגליון פונים כלפי מעלה. יש לקבע את הרקמה במקומה על ידי הנחת הרשת על כדורי הגריז.שמור את הרקמה שנותרה עם גביע העין השני בתוך תמיסה חוץ-תאית מחומצנת מסוג carbox לשימוש מאוחר יותר, והצמד את תא ההקלטה תחת מיקרוסקופ זקוף. כוונן מיד את הפופוזיה הרציפה של הרשתית עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת מסוג carbox בקצב של 3-5 mL לדקה בטמפרטורה של 35.5 °C, וודא כי אלקטרודת ההארקה במקומה. כעת הדלק את מקור האור של המיקרוסקופ ומקז את המבט על גופי התאים של תאי הגנגליון באמצעות עדשה אובייקטיבית של 40x.אתר את מרכז התקן החור לצורך ההקלטה. בשלב זה, קבע פפיטת זכוכית בעלת התנגדות של 5 עד 8 mega ohms במחזיק שלה והזז אותה מתחת למיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מניפולטור תחת עדשה של 40 x. הורד את הפפיטה באיטיות עד שתיצור שקע קטן על פני השטח של הקרום המגביל הפנימי.הסב את הפיפטה קדימה בזהירות עד שהיא תלוכד כמות קטנה של רקמה, ואז העבר אותה למעלה ו/או הצידה כדי לקרוע חור קטן שיחשוף את גופי התאים של תאי הגנגליון. כעת מלא פיפטה נקייה ב-8 עד 10 µL של תמיסה תוך-תאית מבוססת אשלגן עם Lucifer yellow. הכנס אותה למחזיק המחובר לשלב הראש (head stage) של המגבר, וודא שאלקטרודת הכסף-כלוריד (chlorinated silver chloride) טבולה.בחרו תא בעל גוף תא גדול. הורידו לאט את קצה הפיפטה תוך הפעלת לחץ חיובי כדי ליצור שקע קטן על פני השטח של הממברנה. לאחר מכן, הפסיקו ושחררו את הלחץ כדי להשיג giga seal.לאחר השגת giga seal, יש להפעיל בעדינות לחץ שלילי כדי לשבור את הממברנה במטרה להגיע לקונפיגורציית whole cell patch clamp. הליך זה הוא שלב עדין. הפעלת לחץ שלילי מוגבר מדי תגרום לדליפה בחיבור.אם הכמות קטנה מדי, הממברנה תישאר שלמה. עם הזמן, לוסיפר צהוב (Lucifer yellow) ימלא את התא, מה שיאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיית התא אם זו יציבה. הגדרה זו צריכה להחזיק מעמד 30 דקות או יותר.כעת בצעו בדיקת זרם-מתח מ-75- מיליוולט ועד 35+ מיליוולט בכל 10 מיליוולט באמצעות Patch Master והמשיכו לבדיקות הבאות, אך זאת רק אם קיים זרם נתרן הגדול מ-1 ננו-אמפר. לאחר מכן, פתחו את LabVIEW והפעילו את תוכנת Neuro Acuma שנכתבה במיוחד.הגדירו את מספר החזרות לשמונה. לאחר מכן, הגדירו את פוטנציאלי ההיפוך של מוליכויות עירור ועיכוב לאפס ולמינוס 75 millivolts בהתאמה. בחרו זוג תואם אחד של מוליכויות עירור ועיכוב לבדיקה, ואז יופיעו הפס עירור הירוק והפס עיכוב האדום בפנל התחתון.לאחר מכן, חזור ל-patch master ובחר במצב current clamp. העבר מיד את המגבר למצב current clamp ב-neuro acuma. לחץ על כפתור ההקלטה.התגובה התאית עם פרצי פוטנציאלי פעולה אפזיים תופיע בפאנל העליון. לאחר מכן, הזרק זרם לתא בעל מוליכות נמוכה. ראשית, אם נצפתה תגובה מועטה או שאינה נצפית תגובה כלל, הגדל את הזרם במרווחים קטנים עד שתי produced תגובה חזקה.הזרקת זרם מופרזת עלולה להרוג את התא. לאחר השלמת הבדיקות, בחרו זוג חדש של גלי מוליכות וחזרו על הפרוצדורות עבור כל הזוגות של מוליכויות פיזיולוגיות ומלאכותיות.לאחר ההקלטה, משוך את הפפטה בזהירות כדי שגוף התא יישאר שלם. לאחר מכן, קבע מיד את הרקמה ב-4%para formaldehyde למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצע שלושה שטיפות של 10 דקות עם phosphate buffer בריכוז 0.1 molar, קירר במקרר ובצע את סמיגת הנוגדנים ביום למחרת או בתוך שבוע כאשר תהיה מוכן. סמן את תאי הגנגליון הממולאים ב-Lucifer yellow בטמפרטורת החדר באמצעות נוגדן ראשוני anti Lucifer yellow rabbit IgG בדילול של 1:10,000 למשך חמישה ימים.לאחר מכן, ביום השישי, לאחר השהייה ללילה עם נוגדן משני עיז ה-anti rabbit IgG, הוסיפו דילול של 1:500. בסיום, הניחו את הרשתית להכנה רטובה (wet mount) במדיה משמרת פלואורסצנטית. הניחו זכוכית כיסויה ואטמו עם לק ציפורניים. צלמו תמונות קונפוקאליות של מורפולוגיית התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי Leica SPECT two.להלן התגובות של תא גנגליוני להזרקה של גלי מוליכות מעוררים ומעכבים, שהתקבלו בניסויי הביקורת ומסומנים בירוק ובאדום בהתאמה. וכאן מוצגות התגובות להזרקה של גלי מוליכות שהוקלטו לאחר הוספת טטרודוטוקסין לאמבט. להלן התגובות של תא גנגליוני אחר לזוגות שונים של גלי מוליכות.היחסים בין המוליכות המעוררת למוליכות המעכבת שונו מאחד לאפס, ולאחר מכן מאחד לשניים. ככל שמידת העכבה עלתה, תגובת התא פחתה; כאן מוצגות התגובות של תא גנגליוני לאותה רמה של עירור, כאשר מועד תחילת העכבה השתנה. Delta T מייצג את הפרש הזמנים בין תחילת המוליכויות המעכבת והמעוררת.ככל שעיכוב העיכוב פחת, תגובת התא הפכה לחלשה יותר. הליך זה הוא טכניקה רבת עוצמה המסייעת בחשיפת האינטראקציות בין קלט סינפטי מעורר לעיכוב המייצרות פלט נוירונלי.

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להחיל המוליכות לתוך נוירון דופאמין רשמה בתצורת תא שלם פרוסות המוח עכברוש. טכניקה זו נקראת מהדק דינמי.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

סרטון זה מדגים טכניקת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה. פיפטת זכוכית דקה עם אלקטרודה משמשת להתקרבות לתאים אמקריניים מתפוצצים בכוכבים (SACs) בתוך הרשתית. לאחר יצירת חותם, היניקה מוחלת כדי לקרוע את הממברנה וליצור את תצורת מהדק טלאי התא כולו. לבסוף, זרימת היונים דרך קולטני SAC סינפטיים נמדדת באמצעות התצורה.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

פרוטוקולי לולאה סגורה הופכים נפוצים יותר ויותר באלקטרופיזיולוגיה המודרנית. אנו מציגים דרך פשוטה, רב-תכליתית וזולה לביצוע פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים מורכבים בנוירונים פירמידליים בקליפת המוח במבחנה, באמצעות מחשב שולחני ולוח רכישה דיגיטלי.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

אנו מסכמים זרימת עבודה כדי ליצור מודלים חישוביים של התנהגויות של נוירון רשתית בתגובה לגירוי חשמלי. המודל החישובי הוא רב-תכליתי וכולל שלבי אוטומציה שימושיים בהדמיית מגוון תרחישים פיזיולוגיים ובחיזוי התוצאות של מחקרי in vivo/in vitro עתידיים.

מידול חישובי של נוירוני רשתית לחקר תותבות חזותיות - גישות בסיסיות

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי יכולה לבסס קשרים סיבתיים בין ליקויים בירי עצבי לתפקוד לקוי של תעלת יונים. אנו מתארים שיטות ופרוטוקולים של מהדק דינמי בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן של העכבר, תוך ציון משאבים שימושיים ושיקולים טכניים. במחקר מייצג, אנו מוסיפים מוליכות נתרן מעוצבת לנוירונים Tsc1-/- Purkinje כדי להציל ירי חוזר.

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם

חקור את השיטה ליישום קלאמפ דינמי עם מוליכויות סינפטיות בתאי עכבר גנגליון רשתית. טכניקה זו מאפשרת חקירת השפעות קלטים מעוררים ומעכבים על פעילות הנוירונים.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

גלה סרטונים נוספים