יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את ההשפעות של שינויים ביחס ובתזמון היחסי של קלטים סינפטיים מעוררים ומעכבים על פעילות הזינוק של נוירונים באמצעות תאי גנגליון ברשתית כתאי עצב מודל. זה מושג על ידי תיקון גוף התא של תא גנגליון ברשתית הר שלמה, באמצעות פיפטה מזכוכית מלאה בתמיסה תוך-תאית הדומה להרכב היוני הפיזיולוגי וצהוב לוציפר כדי לזהות מורפולוגית את סוג התא כשלב שני באמצעות מהדק דינמי, קבוצה של צורות גל מוליכות מעוררות ומעכבות מוזרקות לגוף התא, המייצרים שינוי בפוטנציאל הממברנה כתגובה. לאחר מכן, צורות גל מוליכות שונות המתקבלות מניסויים פיזיולוגיים בתנאי בקרה, או בנוכחות תרופות מוזרקות לגוף התא על מנת להשיג את התגובות העצביות המתאימות.

התוצאות מראות את ההשפעות של שינויים ביחס העירור והעיכוב על פעילות הזינוק של תאי גנגליון ברשתית בהתבסס על הזרקת זרמים המורכבים ממוליכות מעוררות ומעכבות באמצעות הקלטות מהדק דינמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מהדק זרם או מהדק מתח, הוא שהיא מספקת כלי אינטראקטיבי שבאמצעותו ניתן להזריק את היחס והתזמון היחסי של מוליכות סינפטית מעוררת ומעכבת לתאי עצב כדי לחקור את ההשפעה על תגובות תאיות. מתודולוגיה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד מעגלי הרשתית כמו גם של כל רשת עצבית אחרת במערכת העצבים המרכזית.

התחל הליך זה על ידי הגדרת מערכת הרפרפוזיה עם 250 מיליליטר של מדיום המטרות המחומצן הקרבוקסי במערך האלקטרופיזיולוגי. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של שומן ואקום באופן אחיד על תחתית תא הזילוף. אטום אותו עם פתק כיסוי וודא שהוא אטום.

לאחר מכן הניחו כמות קטנה של שומן בקצה העליון והתחתון של החדר. השומן יחזיק את הרשת במקומה וימנע ממנה ללחוץ חזק מדי על הרשתית. כעת תקן את החדר על הרציף ויישר את שני הפתחים לאחר מכן.

להקריב בעל חיים על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר הרדמה עם איזוף פלואור. הסר במהירות את עיניו בעזרת מספריים מעוקלים קטנים. שטפו אותם היטב עם נוזל חוץ-תאי מחומצן לרכב בכוס קטנה, והניחו אותם בצלחת פטרי מלאה בנוזל חוץ-תאי מחומצן לרכב.

מתחת למיקרוסקופ הניתוח, צרו חור החדרה באמצעות מחט בקוטר 19 בקרנית כשני מילימטרים מהקצה בשתי העיניים. צעד חשוב זה צריך להיות מהיר כדי לאפשר חמצון של שני המושכות. לאחר מכן, הסר קרנית אחת עם מספריים קטנות של קשתית על ידי חיתוך מקביל לקצה שלה.

לאחר מכן, הסר את הקשתית והעדשה בעזרת זוג מלקחיים עדינים וחזור על ההליכים עבור העין השנייה. העבירו גביעונית אחת לכוס המכילה את התמיסה החוץ-תאית המחומצנת של הארגון. בעזרת להב האזמל, חתכו עין אחת לשניים והפרידו בעדינות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט באמצעות בדיקה קהה או על ידי משיכה עדינה שלה.

לאחר מכן החזק את קצה רקמת הרשתית המנותקת קרוב להילה סרטה עם זוג מלקחיים עדינים ותפס את ההילה סרטה עם זוג נוסף של מלקחיים עדינים. משוך אותו לכיוון מרכז הרשתית. זהו תהליך עדין ועשוי לקחת כמה ניסיונות.

אם הילה מוצלחת של Serta גוף הריסי וההומור הזגוגי יוסרו והעקמומיות של הרשתית תפחת. לאחר מכן, חתוך את הקצוות ואז העביר את הרשתית לתא הזלוף כשתאי הגנגליון פונים כלפי מעלה. החזק את הטישו במקומו על ידי הנחת הרשת על כדורי השומן.

שמור את הרקמה שנותרה עם העין השנייה בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת לשימוש מאוחר יותר, התקן את תא ההקלטה מתחת למיקרוסקופ זקוף. התאם מיד את הזלוף הרציף של הרשתית עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת בקרבוקס בקצב של שלושה עד חמישה מיליליטר לדקה בטמפרטורה של 35.5 מעלות צלזיוס, ודא שאלקטרודת ההארקה נמצאת במקומה. כעת הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ והביא את המיקוד שלו לגופי התאים של תאי הגנגליון דרך ה-40 x של המטרה.

אתר את מרכז תושבת החור להקלטה. בשלב זה, קבע פיפטת זכוכית של חמישה עד שמונה מגה אוהם במחזיק שלה והעבר אותה מתחת למיקרוסקופ באמצעות מניפולטור מיקרום תחת מטרה של פי 40. הורד לאט את הפיפטה עד שהיא יוצרת גומה קטנה על פני הממברנה המגבילה הפנימית.

קדם בזהירות את הפיפטה קדימה עד שהיא תופסת כמות קטנה של רקמה ואז הזז אותה כלפי מעלה או הצידה כדי לקרוע חור קטן כדי לחשוף את גופי התאים של תאי הגנגליון. כעת מלאו פיפטה נקייה בשמונה עד 10 מיקרוליטר, תמיסה תוך-תאית מבוססת אשלגן בצהוב לוציפר. הכנס אותו למחזיק, מחובר לראש המגבר tagה, וודא שאלקטרודת כלוריד הכסף הכלורית שקועה.

בחר תא עם גוף תא גדול. הורד לאט את קצה הפיפטה בלחץ חיובי כדי ליצור גומה קטנה על פני הממברנה. לאחר מכן עצור ושחרר את הלחץ כדי להשיג חותם ג'יגה.

לאחר השגת איטום ג'יגה, הפעל בעדינות לחץ שלילי כדי לשבור את הממברנה על מנת להשיג תצורת מהדק תיקון תא שלם. הליך זה הוא צעד עדין. אם מופעל לחץ שלילי רב מדי, החיבור הופך לדלוף.

אם מעט מדי, הממברנה נשארת שלמה. עם הזמן, צהוב לוציפר ימלא את התא, ויאפשר הדמיה של המורפולוגיה של התא אם הוא יציב. הגדרה זו אמורה להימשך 30 דקות או יותר.

כעת בצע בדיקת מתח זרם ממינוס 75 מילי-וולט לחיובי 35 מילי-וולט כל 10 מילי-וולט באמצעות Patch Master והמשך לבדיקות מאוחרות יותר. רק אם קיים זרם נתרן גדול מננו אמפר אחד. לאחר מכן, פתח את תצוגת המעבדה והפעל את תוכנית הנוירו-אקומה הכתובה בהתאמה אישית.

הגדר את המספר החוזר לשמונה. לאחר מכן הגדר את פוטנציאל ההיפוך של מוליכות מעוררת ומעכבת באפס ומינוס 75 מילי-וולט בהתאמה. בחר זוג תואם אחד של מוליכות מעוררת ומעכבת לבדיקה ועקבות המוליכות המעוררת הירוקה ועקבות המוליכות המעכבת האדומה יופיעו בפאנל התחתון.

לאחר מכן, חזור לתיקון מאסטר ובחר נוכחי clamp מצב. העבר מיד את המגבר לזרם clamp מצב בנוירו-אקומה. לחץ על כפתור ההקלטה.

התגובה התאית עם פרץ אפזי של פוטנציאל פעולה תופיע בפאנל העליון. ואז להזריק זרם לתא עם מוליכות נמוכה. ראשית, אם נצפתה תגובה מועטה או ללא תגובה, הגדל את הזרם במרווחים קטנים עד שהוא מייצר תגובה חזקה.

הזרקת זרם מוגזמת עלולה להרוג את התא. לאחר השלמת הבדיקות. בחר זוג חדש של צורות גל מוליכות וחזור על ההליכים עבור כל זוגות המוליכות הפיזיולוגיות והמלאכותיות.

לאחר ההקלטה, משוך בזהירות את הפיפטה כך שגוף התא יישאר שלם. לאחר מכן, יש לתקן מיד את הטישו ו-4%para formaldehyde למשך 30 דקות, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 10 דקות עם מאגר פוספט מולארי 0.1, לקרר ולבצע צביעת נוגדנים למחרת או תוך שבוע כשהוא מוכן. כתם נגד תאי גנגליון צהובים של לוציפר בטמפרטורת החדר עם ארנב צהוב ראשוני נגד לוציפר IgG בדילול של 1 עד 10,000 למשך חמישה ימים.

ואז ביום השישי, שהייה של לילה עם העז המשנית נגד ארנב IgG, הוסף דילול של אחד עד 500 בסוף רטוב הרכיב את הרשתית בחומר משמר פלואורסצנטי. הניחו את החלקת הכיסוי ואטמו עם לק. צלם תמונות קונפוקליות של מורפולוגיה של התא באמצעות מיקרוסקופ שני קונפוקלי של Leica SPECT.

להלן התגובות של תא גנגליון להזרקת מוליכות מעוררת ומעכבת צורות גל המתקבלות מניסויי הבקרה המצוינים בירוק ואדום בהתאמה. והנה התגובות להזרקת צורות גל מוליכות שנרשמו לאחר מריחת האמבטיה של טטרודאטוקסין. להלן תגובותיו של תא גנגליון אחר לזוגות שונים של זרועות צורות גל מוליכות.

היחסים בין המוליכות המעוררת למוליכות המעכבת השתנו מאחד לאפס לאחד לשניים. ככל שמידת העיכוב גדלה, תגובת התא פחתה, והנה התגובות של תא גנגליון לאותה רמת עירור שבה הופעת העיכוב הייתה מגוונת. דלתא T מייצג את הפרש הזמן בין הופעת מוליכות מעכבת ומעוררת.

ככל שעיכוב העיכוב פחת, תגובת התא נחלשה. הליך זה הוא טכניקה רבת עוצמה המסייעת לחשוף את האינטראקציות בין אקסי שלוש לקלט סינפ מעכב המייצרים פלט עצבי.