דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגזור קרדיומיוציטים אנושיים מתאי IPS אנושיים שגודלו בתנאים ללא תאי מאכילה (feeder free). דבר זה מושג תחילה על ידי זריעת תאי IPS בצלחות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment plates) ליצירת גופי עובר (embryo bodies). השלב השני של הפרוצדורה הוא העברה של גופי העובר שנוצרו לצלחות מצופות ג'לטין.

כאשר מופיעים אזורים מתכווצים, הם מבודלים ידנית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומועברים למנות בצלחות מצופות פיברונקטין. להמשך הגבייה, השלב הסופי הוא השגת קרדיומיוציטים בודדים באמצעות עיכול אנזימטי של צבירי התאים המתכווצים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות התמיינות של תאים דמויי קרדיומיוציטים המבטאים סממנים מבניים טיפוסיים, כגון cardiac troponin, באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הקרדיווסקולרית, כגון, מהם המנגנוים המניעים את הדיפרנציאציה וההפרעה התפקודית הקרדיאלית במהלך ההתפתחות והמחלות של הלב ברמת התא השרירי של הלב (cardiomyocyte) האנושי. זוהי טכניקה מעניינת מאוד כיוון שהיא מאפשרת יצירת cardiomyocytes in vitro ממטופלים ובני אדם. ובנוסף, היא מאפשרת שחזור של המחלה במבחנה, כך שניתן יהיה לבחון תרופות חדשות in vitro לפני המעבר ל-in vivo.

תחילת הניסוי עם תרביות תאי IPS בצפיפות (confluent) שגודלו על צלחות של 35 מילימטר מצופות ב-matrigel. החליפו את מצע הגידול ב-1 מיליליטר של PBS המכיל מיליגרם אחד של diss. בחנו את התאים באמצעות פיפטות זכוכית משופופות.

הסר אזורים עם תאים מובחנים (differentiated cells) כגון מבנים דמויי מכתש או מבנים ציסטיים במרכז המושבות. כמו כן, הסר כל אזור שבו התאים נפרדו, הפכו שטוחים ונראים כנודדים כלפי חוץ. כעת דגור את התאים הנותרים בטמפרטורה של 37 °C תחת מנדף תרביות עד ששולי המושבה יהפכו בהירים יותר ויתחילו להיפרד.

פעולה זו אורכת בדרך כלל בין חמש לשבע דקות. בשלב זה, הסר את תמיסת ה-dispa ושטוף את התאים עם 1 mL של HESM. לאחר מכן, השלך את תמיסת השטיפה.

במיליליטר טרי של HESM, השתמש במלקט תאים (cell lifter) כדי לאסוף את המושבות. העבר את המושבות למבחנה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שטוף את התאים במיליליטר נוסף של HESM וסבב אותם בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך ארבע דקות.

לאחר מכן, המשיכו בזריעת התאים על matrigel והחליפו את המצע מדי יום במהלך הטיפוח. התחילו באיסוף מושבות IPS לא מבדלות כפי שמתואר בסעיף הקודם. לאחר בידוד האוכלוסיות הלא מבדלות, השעיו אותן בעדינות ב-1 mL של EBM 20.

בעזרת פיפט של שני מיליליטר, הימנעו מפירוק יתר של גשמי התאים. הגבילו את הפעולה לשני או שלושה שאיבות. בדקו את גודל המושבות תחת הסטראוסקופ בין השאיבות.

כאשר המושבות הן בערך באותו גודל, אין צורך בערבוב נוסף. כעת זרעו את התאים בצלחות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment), כאשר ממלאים צלחת אחת של שישה בארות עבור כל צלחת של תאים שנאספו. אל תשכחו לשטוף את המבחנה עם 1 mL של EBM 20 ולהעביר את נוזל השטיפה לצלחת.

לאחר היום השלישי של הדגירה, החליפו את המצע תוך שימוש במיקרוסקופ כדי למנוע הסרה של גופי העוברים. החזיקו את הפפיטה קרוב לקצה הצלחת. ביום השביעי, העבירו את גופי העוברים לצלחות מצופות ב-0.1% Gelatin שחוממו ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות.

הוסיפו בין 35 ל-40 גופי עוברים לכל צלחת של 35 millimeter בשני milliliters של מצע גידול. במהלך התרבית, החליפו את המצע באופן סדיר פעמיים בשבוע.

בדקו את גופי העוברים לאיתור אזורי פעימה וסמנו את מיקומם של אזורי הפעימה. בחלק העליון של מכסה הצלחת צריכים להופיע אזורי התכווצות לאחר כ-10 עד 20 ימים. כאשר מופיעים אזורים עם התכווצות ספונטנית, העבירו את המצע שלהם ל-EBM two. לאחר הופעת אזורי ההתכווצות, המשיכו בתרבית ובניטור של אזורים אחרים בצלחת למשך עד חודש.

בסך הכל. ב-EBM, ליקוי בתהליך הדיפרנציאציה תלוי מאוד במספר גורמים, שהקריטיים שבהם הם קווי התאים הספציפיים ואומת הסרום המשמשים להשראת דיפרנציאציה קרדיוגנית. כדי להשיג את היעילות הגבוהה ביותר, יש לבחון מספר קווים לבדיקת הפוטנציאל הקרדיוגני ואומתים שונים של סרום. התחל בציפוי 12.

פלטות בארות עם 5 µg לסמ"ר של פיברונקטין ב-PBS בריכוז 300 µl לבערה אמורות לכסות לחלוטין את פני השטח של כל בארה. יש להניח לפלטות להתייבש ללא כיסוי במנדף תרביות תאים. כדי להסיר את אזור החריזה של תרבית התאים, השתמשו בפ pipette מזכוכית משוכה ובסכין מנתח.

לאחר מכן, באמצעות פיפט של 1 ml, העבירו ארבעה עד חמישה קלמפים לכל באער של פלטה מצופה בפיברונקטין. לאחר השלמת כל האיסופים, הוסיפו 1 ml של EBM 2 לבאערים הטעונים בפלטת האיסוף וסמנו את האזורים מהם הוסרו תאים. לאחר מכן, החליפו את המצע והחזירו את הפלטה למנדף התרבית.

אם נדרשים גושים פועמים קטנים יותר תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, העבירו את האזורים שהוצאו (explanted) דרך פיפטה. פעולה זו יוצרת צבירים קטנים המכילים מספר תאים פועמים בתרבית.

יש להחליף את המצע פעמיים בשבוע עד שהם מוכנים לאניליזה. ראשית, יש להכין למסחים בעלי שני תאים בגודל של ארבעה סנטימטרים רבוע על ידי ציפוי שלהם ב-20 µg של fibronectin המדולל ב-PBS בכמות מספקת לכיסוי הפני השטח. אם נעשה שימוש בתמיכת זכוכית, יש להוסיף 20 µg נוספים של laminin.

בודד את אזור תרבית החרו지를 כפי שתואר בעבר. באמצעות פיפט של 1 מיליליטר, העבר את התאים למבחנה של 15 מיליליטר המכילה 500 µL של קולגנאז. דגור את התאים למשך 15 דקות ונער את המבחנה פעם אחת במהלך הדגירה.

לאחר 15 דקות, העבירו את התאים באמצעות פיפט של 200 microliter כדי להסיר גושים, במידה ונותרו כאלה. העבירו את התאים ל-collagenase two טרי וחזרו על האינקובציה כאשר לא נותרו גושים גדולים. סיימו את העיכול על ידי הוספת שלושה milliliters של EBM two ללא as soic acid כפי שהם מוכנים.

אחסן את המבחנות במעמד מחומם תחת המנדף, ולאחר מכן סבב אותן בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, הכן תרחיף של פראקציות התאים מאותה דגימה ראשונית בתוך מיליליטר אחד של 0.25%trypsin EDTA ב-PBS. לאחר מכן, דגור את התרחיף למשך חמש דקות בבלוק מחומם, ובטל את פעילות ה-trypsin באמצעות ארבעה מיליליטרים של E BM two ללא as soic acid.

בשלב הבא, העבירו את התאים דרך מחט בכיול 18 gauge במזרק של 2.5 milliliter עד שבע פעמים, עד שלא ייראו גושים גדולים תחת המיקרוסקופ. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך ארבע דקות. כעת, השביו את משקע התאים (pellet) ב-E BM two והעבירו אותם למסליידים עם תאי בישול בני שני תאים (two well chamber slides).

התאים יהיו מוכנים לאנליזות לאחר יומיים עד שלושה ימים של דגירה. CMS הופקו ממספר קווי תאי IPS. קווים אלו הופקו בתחילה על שכבת מזינה של meth והועברו מיד ל-matrigel תוך שימוש במצע מוגדר.

התאים הראו מורפולוגיה דמוית תאי ESC אנושיים, עם שוליים בהירים במיקרוסקופ פאזה וגרעינים בולטים. ניתוח אימונופלואורסצנציה הראה כי תאי ה-IPS ביטאו נכונה את גורם השעתוק T four וביטאו את האנטיגן שעל פני השטח TRA one 60. ניתוח ציטומטרי פלואורסצנטי אישר את הביטוי של אנטיגנים טיפוסיים של פלוריפוטנציות על פני השטח, SS EEA four ו-TRA one 60.

אסטרטגיית ה-gating מוצגת בפיזור השמאלי. כמו כן, בוצע ניתוח קריוטייפ לתאי IP FS שגודלו על matrix gel. השראת ההתמיינות לשושלת לבבית הופעלה על ידי אגרגציה של תאי ה-IPS לגושים של ebs, יחד עם תרבית בנוכחות סוג ספציפי של סרום.

מאחר שאזורים המתכווצים תחת השפעת חומצה סורבית היוו 20% עד 35% מסך התרבית, בהתאם לקו התאים שנעשה בו שימוש, CMS מתכווצים בודדו מאזורים אלה באמצעות עיכול אנזימטי ונבדקו לבדיקת ביטוי חלבונים. בדיקת R-T-P-C-R העלתה ביטוי של תעלות יונים ספציפיות ללב בתאים הפועים שהופקו מ-IPS, אך לא בתאים שאינם פועים.

תעלות אלו כללו תעלת alpha one, תת-יחידה של תעלת סידן תלוית-מתח, תת-יחידה alpha של תעלת נתרן תלוית-מתח מסוג five, תעלת אשלגן תלוית-מתח ממשפחת ה-KQT, ושני סוגי המיוזין. ניתוח אימונופלואורסצנציה של שרשראות כבדות גילה כי קרדיומיוציטים בודדים המופקים מ-IPS ביטאו את החלבונים המבניים, alpha sarcomeric, actin, cardiac troponin I, ואת חלבון החיבור הספציפי ללב, conexion 43. בסופו של דבר, טכניקה זו סללה את הדרך למידול של מחלות שריר הלב in vitro ומאפשרת בחינה של תרופות בהקשר אנושי מבלי להזריק את התרופה לגוף האדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי השמירה על תאי IPS בתנאי תרבית ללא תומך (free free conditions) והגאלתם לתאי שריר לב (cardiomyocytes) באמצעות שיטה המבוססת על אגרגציה של גופי עובר (embryo bodies).