דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבדיל בין קרדיומיוציטים אנושיים לתאי IPS אנושיים שגודלו בתנאים ללא מזין. זה מושג על ידי ציפוי תאי IPS תחילה ללוחות התקשרות נמוכים במיוחד ליצירת גופי עובר. השלב השני של ההליך הוא העברת גופי העובר שנוצרו לכלים מצופים ג'לטין.

כאשר מופיעים אזורי התכווצות, הם מנותחים ידנית תחת מיקרוסקופ הסטריאו ומצופים על כלים מצופים פיברונקטין. לבידול נוסף, השלב האחרון הוא השגת קרדיומיוציטים בודדים על ידי עיכול אנזימטי של אשכולות מתכווצים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות התמיינות של תאים דמויי קרדיומיוציטים המבטאים סמנים מבניים אופייניים, כלומר טרופונין לב באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הביולוגיה הקרדיווסקולרית, כגון, מהם המנגנון המניע התמיינות ותפקוד לקוי של הלב במהלך התפתחות הלב ומחלות ברמת הקרדיומיוציט האנושי. זוהי טכניקה מעניינת מאוד מכיוון שהיא מאפשרת יצירת קרדיומיוציטים במבחנה מחולים אנושיים ומאנשים אנושיים. ובמקרה השני, זה מאפשר לסכם את המחלה במבחנה כך שניתן יהיה להתנסות בתרופות חדשות במבחנה לפני שהן נכנסות ל-vivo.

ניסויים התחל עם תרביות תאי IPS משולבות הגדלות על צלחות מצופות מטריג'ל 35 מילימטר. החלף את מצע הגידול במיליליטר אחד של PBS המכיל מיליגרם של דיס. בדוק את התאים באמצעות פיפטות זכוכית סקר.

הסר אזורים עם תאים מובחנים כגון מבנים דמויי מכתש או ציסטיים במרכז המושבות. הסר גם את כל האזורים שבהם התאים נפרדו, השתטחו ונראה שהם נודדים החוצה. כעת דגרו על התאים הנותרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסה המנוע עד שגבולות המושבה יהפכו בהירים יותר ויתחילו להתנתק.

זה בדרך כלל לוקח בין חמש לשבע דקות. בשלב זה, הסר את תמיסת הדיספה ושטוף את התאים במיליליטר אחד של HESM. ואז השלך את תמיסת הכביסה.

במיליליטר טרי של HESM, השתמש במרים תאים כדי לקצור את המושבות. אוספים את המושבות לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את התאים במיליליטר נוסף של HESM וסובבו אותם ב -1000 פעמים G למשך ארבע דקות.

לאחר מכן המשך בציפוי התאים על מטריג'ל והחלף את המדיה מדי יום במהלך התרבית. התחל בקטיף מושבות IPS לא מובחנות כמתואר בסעיף הקודם. לאחר שהאוכלוסיות הלא מובחנות בודדו, יש להחיות אותן בעדינות במיליליטר אחד של EBM 20.

בעזרת פיפטה של שני מיליליטר, אל תפרק את גושי התאים יותר מדי. הגבל את הפיפטינג לשתיים או שלוש פעימות. בדוק את גודל המושבות תחת הסטריאוסקופ בין משיכות.

כאשר המושבות כולן בערך באותו גודל, הן אינן זקוקות לערבוב נוסף. כעת צלחו את התאים על צלחות חיבור נמוכות במיוחד הממלאות צלחת אחת של שש בארות לכל צלחת תאים שנקטפו. אל תשכח לשטוף את הצינור במיליליטר אחד של EBM 20 ולהפיץ את השטיפה לצלחת.

לאחר היום השלישי של הדגירה, החלף את המדיה באמצעות מיקרוסקופ כדי למנוע הסרת גופי עוברים. שמור את הפיפטה קרוב לקצה הצלחת. ביום השביעי, העבירו את גופי העובר לצלחות מצופות בג'לטין 0.1% שחומם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הוסף 35 עד 40 גופי עובר לכל צלחת של 35 מילימטר בשני מיליליטר בינוני. במהלך התרבות. החלף את המדיום פעמיים בשבוע באופן קבוע.

בדוק את גופי העובר לאיתור אזורים פועמים וסמן היכן נמצאים אזורי החרוזים. בחלק העליון של כיסוי הכלים אזורי התכווצות חרוזים צריכים להופיע לאחר כ-10 עד 20 יום. כאשר מופיעים אזורים עם התכווצות ספונטנית, החליפו את המדיום שלהם ל-EBM 2 לאחר הופעת אזורי ההתכווצות, המשיכו לתרבת ולנטר אזורים אחרים בצלחת עד חודש.

בסך הכל. ב-EBM 2 מחסור בתהליך ההתמיינות תלוי מאוד במספר גורמים, שהקריטיים שבהם הם קווי התאים הספציפיים ואצוות הסרום המשמשת לגרימת התמיינות לב-ריאה. כדי להשיג את היעילות הגבוהה ביותר בדוק מספר קווים עבור הפוטנציאל הקרדיוגני ואצוות שונות של סרום התחל בציפוי 12.

צלחות באר עם חמישה מיקרוגרם לסנטימטר מרובע של פיברונקטין ב- PBS 300 מיקרוליטר לבאר צריכות לכסות לחלוטין את פני השטח של כל באר. הניחו לצלחות להתייבש ללא כיסוי במכסה המנוע של תרבית תאים. כדי להסיר את אזור החרוזים של תרבית התאים, השתמש בפיפטה ואזמל זכוכית משוך.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, העבירו ארבעה עד חמישה מהדקים לכל באר של צלחת מצופה פיברונקטין. לאחר ביצוע כל האוספים, הוסף מיליליטר אחד של EBM שניים לבארות העמוסות על לוחית האיסוף וסמן אזורים שבהם הוסרו תאים. לאחר מכן החלף את המדיום והחזיר את הצלחת למכסה המנוע.

אם נדרשים גושי פעימה קטנים יותר תחת מיקרוסקופ סטריאו, העבירו את האזורים המושתלים דרך פיפטה. זה מייצר אשכולות קטנים המכילים כמה תאים פועמים. בתרבות.

החלף את המדיום פעמיים בשבוע עד שהם מוכנים לניתוח. ראשית, הכינו ארבעה סנטימטרים רבועים של שקופיות דו-תאיות על ידי ציפויים ב-20 מיקרוגרם של פיברונקטין מדולל במספיק PBS כדי לכסות את פני השטח. אם משתמשים בתמיכת זכוכית, הוסיפו 20 מיקרוגרם נוספים של למינין.

בודד את אזור תרבות החרוזים כפי שתואר קודם לכן. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של צינור קולגנאז. דגרו על התאים למשך 15 דקות ונערו את הצינור פעם אחת במהלך הדגירה.

לאחר 15 דקות, העבירו את התאים דרך פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר גושים אם נותרו גושים. העבירו את התאים לקולגנאז טרי 2 וחזרו על הדגירה כאשר לא נותרו גושים גדולים. הפסיקו את העיכול על ידי הוספת שלושה מיליליטר של EBM, שניים ללא חומצה סואית כמו כל אחד מהם.

אחסן את הצינורות ברשת מחוממת מתחת למכסה המנוע, ואז צנטריפוגה אותם ב -1000 פעמים G למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, בצע השעיה של שברי התאים מאותה דגימה ראשונית במיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ב-PBS. לאחר מכן דגרו את המתלה למשך חמש דקות בבלוק המחומם, השביתו את הטריפסין עם ארבעה מיליליטר של E BM שניים ללא חומצה סואית.

לאחר מכן, העבירו את התאים דרך מחט בגודל 18 על מזרק של 2.5 מיליליטר עד שבע פעמים עד שלא נראים גושים גדולים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב 1000 פעמים G למשך ארבע דקות. כעת השעו מחדש את כדור התא ב-E BM שתיים וצלחו אותם על שתי שקופיות תא באר.

התאים יהיו מוכנים לניתוח לאחר יומיים-שלושה של דגירה. CMS נוצר ממספר קווי תאים של IPS. קווים אלה נוצרו בתחילה על שכבת מזין מת' והונחו מיד על מטריג'ל באמצעות מדיום מוגדר.

התאים הראו מורפולוגיה דמוית ESC אנושית עם קצוות בהירים פאזה וגרעינים בולטים. ניתוח אימונופלואורסצנטי הראה שתאי ה-IPS ביטאו נכון את גורם השעתוק T ארבע וביטאו את האנטיגן של TRA 1 60 פני השטח. ניתוח מטרי של ציטו פלואורו אישר את הביטוי של אנטיגנים פלוריפוטנטיים אופייניים על פני השטח, SS EEA ארבע ו-TRA אחד 60.

אסטרטגיית השער מוצגת בפיזור השמאלי. כמו כן בוצע ניתוח קריוטיפ של תאי ה-IP FS הגדלים על ג'ל מטריקס. האינדוקציה לשושלת הלב הופעלה על ידי צבירת תאי ה-IPS ל-ebs, יחד עם תרבית בנוכחות סוג מסוים של סרום.

ומכיוון שאזורי התכווצות חומצה סורבית ייצגו 20 עד 35% מכלל התרבית בהתאם לקו התאים בו נעשה שימוש. CMS מתכווץ בודד מאזורים אלה על ידי עיכול אנזימטי ונותח לביטוי חלבון. R-T-P-C-R מצא ביטוי של תעלות יונים ספציפיות ללב המתבטאות בתאים פועמים שמקורם ב-IPS, אך לא בתאים שאינם פועמים.

ערוצים אלה כללו אלפא, תת-יחידה של תעלת סידן תלויה במתח, תת-יחידת אלפא של תעלת נתרן מגודרת מתח מסוג חמש, תעלה מגודרת מתח אשלגן של ה-KQT, כמו תת-משפחה, ושתי צורות המיוזין. ניתוח אימונופלואורסצנטי של שרשרת כבדה גילה כי קרדיומיוציטים בודדים שמקורם ב-IPS ביטאו את החלבונים המבניים, אלפא סרקומרי, אקטין, טרופונין לב I, והצומת הספציפי ללב, קונקסיון 43. אחרי הכל, טכניקה זו באמת סללה את הדרך למידול של מחלות שריר הלב במבחנה ומאפשרת ניסויים בתרופות בסביבה אנושית מבלי להזריק את התרופה לגוף האדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשמור על תאי IPS בתנאים חופשיים ולהבדיל אותם לקרדיומיוציטים באמצעות שיטה המבוססת על צבירת גופי עובר