כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

המטרה הכללית של הליך זה היא לספק תיאור מפורט של טכניקות למחקר תפקודי ומבני של השפעת ליפידים על חלבונים ממברנתיים. זאת מושג תחילה באמצעות ביטוי וטיהור של תעלת אשלגן תלוית-מתח, ולאחר מכן על ידי רקונסטיטוציה של תעלת היונים.

בשלב הבא, מתבצעת הקלטה חשמלית של תעלות היונים בשכבות ליפידיות כדומיות (lipid bilayers) לצורך חקר התפקוד של תעלות היונים. השלב הסופי הוא גבישה של תעלות היונים בממברנה לצורך קביעת המבנה. בסופו של דבר, נעשה שימוש בבדיקות ביוכימיות, בשיטה אלקטרופיזיולוגית ובמחקר קריסטלוגרפי אלקטרוני כדי לבחון את השפעות הליפידים על תנועת חיישן המתח של תעלות היונים.

בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקשו בשל פרטים טכניים רבים בשחזור חלבונים ובהקלטות ביולוגיות. אנו מקווים כי סרט זה, והתהליך המוצג בו, יעזרו לכם לעבור את כל הפרוצדורה ולהצליח. הדגמה של הפרוצדורה השלמה תבוצע על ידי ד"ר Hui Jim מהמעבדה שלי.

לפני הכנת הליפידים הוכנו מבחנה מזכוכית בעל שימוש חד-פעמי בנפח 14 מיליליטר, מבחנת זכוכית עם פקק הברגה ומזרק זכוכית בנפח 250 מיקרוליטר עם כלורופורם. לאחר מכן, העבירו 10 מיליליטר של כלורופורם אל המבחנה. להכנת ליפוזומים של POPE ו-POPG, העבירו 3.75 מיליגרם של POPE ו-1.25 מיליגרם של POPG בתוך כלורופורם אל מבחנת הזכוכית עם פקק ההברגה.

ייבשו את הליפידים תחת זרם רציף של גז ארגון עד להסרה מלאה של הכלורופורם הנראה לעין. ייבשו את הליפידים באופן נוסף תחת ואקום בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 440 µL של בופר עם ריכוז מלח נמוך או מים אל תוך שערבול הליפידים המיובשים.

המבחנה להידרציה של הליפידים. תרחיף הליפידים צריך להיראות לבנבן ועכור. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לתרחיף הליפידים באמבט קר מאוד של קרח, עד שתמיסת הוזיקולות תהפוך לשקופה.

לאחר מכן, הוסיפו לתערובת 50 µL של potassium chloride בריכוז 3 M ו-10 µL של 0.5 M DM, כך שסספנסיון הליפיד הסופי יכיל 300 mM potassium chloride ו-10 mM DM. דגרו את התמיסה ברוטטור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות של תאי ליפיד-דטרגנט מעורבבים. לאחר הדגירה, הסספנסיון אמור להפוך לעכור מעט עקב היתוך של וסיקולות ELLA קטנות המושרה על ידי הדטרגנט. כאשר החלבון מרוכז מעל 2 mg/mL, הוסיפו את הרכיבים המפורטים ואת תערובת הליפיד-דטרגנט כדי להגיע לנפח סופי של 1 mL.

לאחר מכן, דגרו את תערובת החלבון, הליפידים והדטרגנט בתוך המבחנה מזכוכית ברוטטור למשך שעתיים נוספות. הכנת ה-KVAP בתערובת עם DTaP או DOGS מומסים בדטרגנט דומה להכנת הליפידים עבור וזיקולות P-O-P-E-P-O-P-G. עם זאת, הסוניקציה של ליפידים מהוהים לוזיקולות קטנות ללא ליפידים (unli) אורכת זמן רב יותר מאשר עבור ליפידים מסוג P-O-P-E-P-O-P-G; וזיקולות DOGS עשויות להתמזג לאט זו עם זו וליצור טיפות שמן קטנות כדי להמיס את ה-dote או את ה-DOGS באופן מלא.

מערבבים את הוסיקולות שעברו סוניקציה עם 10 millimolar DM ו-40 millimolar beta og. דוגר את תערובת הליפידים והדטרגנט למשך לילה בטמפרטורת החדר; התערובת צריכה להיות שקופה למדי וללא חלקיקים קטנים או טיפות. לאחר מכן, מערבבים את חלבון ה-KVAP עם ה-DTaP או ה-DOGS המומסים בדטרגנט ביחס של חלבון לליפיד שקטן או שווה ל-1 ל-10.

את תערובת החלבון, הדטרגנט והליפיד מדגירים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עד שלוש שעות בסיבוב אורביטלי רציף. כדי להוכיח את ההסרה האיטית של דטרגנטים בעלי CMC גבוה יחסית, כגון DM ו-Beta og, הכינו תחילה שני ליטר של בופר דיאליזה עבור כל מיליליטר של תערובת.

לאחר מכן, גזרו אורך מתאים של צינור דיאליזה ושטפו אותו במים מזוקקים (DI water) כדי לבדוק ולוודא שאין דליפות בצינור. בשלב הבא, העבירו את תערובת החלבון, השומן והדטרגנט לתוך צינור הדיאליזה. סגרו את שני קצות הצינור בעזרת תפסנים, כך שיישאר מרחב מינימלי מעל התמיסה.

הניחו את הפרוטובוס (tubing) הטעון על פלטת ערבוב בתוך תמיסת הדיאליזה, כך שהפרוטובוס יסתובב לאט בתוך התמיסה. החליפו את תמיסת הדיאליזה אחת לכל שמונה שעות. כעת הכינו את חרוזי הפוליסטירן להסרה של דטרגנטים בעלי CMC נמוך על ידי שקילה של 0.5 grams של חרוזים יבשים.

לאחר מכן, העבירו אותם למבחנה של Corning בנפח 50 milliliter והוסיפו 20 milliliters של methanol. בצעו סוניקציה לתמיסה באמבט סוניקציה למשך חמש דקות כדי להסיר בועות כלואות, וסבבו את החרוזים ב-5,000 RP למשך חמש דקות. לאחר מכן, שפכו את ה-methanol לחלוטין וחזרו על השטיפה עם ethanol ומים מזוקקים (milli Q water). לאחר מכן, אחסנו את החרוזים השטופים ב-20% ethanol בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, והחליפו אותם בבופר ללא דטרגנט לפני השימוש. העריכו את כמות הדטרגנטים בתערובת חלבון-ליפיד-דטרגנט המיועדת לטיפול, וחשבו את כמות החרוזים הדרושה להסרת הדטרגנטים.

שקלו את החרוזיים הרטובים ללא עודפי מים והוסיפו אותם ישירות לתערובת החלבון; המתינו לפחות 15 עד 20 דקות עד שהחרוזיים יהיו יעילים במלואם. כדי להסיר 8.7 milligrams של DDM במיליליטר אחד של תמיסה, מחלקים סך כולל של 87 milligrams של חרוזי פוליסטירן, כגון bio beads, SM two, לחמישה חלקים שווים. ערבבו את תערובת החלבון, הליפידים והדטרגנט עם כל חלק למשך 20 עד 30 דקות, תוך סיבוב מתמיד מסביב לציר (end over end rotation) בטמפרטורת החדר.

סובבו את החרוזים בצנטריפוגה להשקיעה, לאחר מכן העבירו את הנוזל העליון למנת החרוזים הבאה וחזרו על הפעולה עד לסיום. בשלב זה, התחילו בניקוי של מבחנה מזכוכית, בקבוק ענבר עם פקק הברגה בעל ציפוי טפלון וסט של מזרקים מזכוכית באמצעות כלורופורם. לאחר מכן, ייבשו את בקבוק הענבר תחת זרם של גז ארגון.

בשלב הבא, העבירו 0.75 milligrams של POPE ו-0.25 milligrams של POPG בתוך כלורופורם אל תוך המבחנה המעמירה והסעיפו את הכלורופורם באמצעות גז ארגון. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 0.2 milliliters של פנטאן כדי להמיס את הליפידים המיובשים, וייבשו לחלוטין כדי להסיר שאריות כלורופורם. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 50 microliters של דקאן כדי להמיס את הליפיד המיובש.

כעת, מרחו את השפתיים על החור העגול שעל פני השטח הגליליים של כוס השכבה הכפולה, โดย להימנע מהחדרת תמיסת שפתיים לתוך החור. המתינו דקה אחת עד שתיים עד שהדסולובן יתאדה לחלוטין, כדי לבצע הקלטות חשמליות מערוצי KVAP בשכבות שפתיים כפולות. הכניסו את הכוס לתא ההקלטה, הניחו את גשרי המלח וחברו את האלקטרודות לשני צדדיו של כוס ההקלטה.

הוסיפו את תמיסת הציסטות לחורי האלקטרודות ואת תמיסאות ה-CYS וה-trans לכוסות החיצוניות והפנימיות בתא. לאחר מכן, כוונו את היסט הפוטנציאל (potential offset) בין שני צדי הכוס לפחות משני מיליוולט, ואז מרחו ליפיד על פני החור במכסה. המתינו עד שהממברנה תדלל ותהיה יציבה יחסית.

ברגע שהממברנה הופכת ליציבה, יש להזריק 0.5 עד 1 µL מהתעלה המכילה וזיקולות על ידי מיקום הקצה הדק של טיפ פ pipette P2 בדיוק מעל החור. הוזיקולות ינפלו דרך החור לתחתית הכוס.

בדיקת תעלולי ה-KVAP בשכבה הכפולה. פולס קצר של 80 millivolts מוענק מפוטנציאל החזקה של מינוס 80 millivolts; בשל אינאקטיבציה מהירה והתאוששות איטית מאקטיבציה, ניתן מרווח ארוך של כ-120 שניות בין שני פולסים עבור תעלולים בממברנות PEPG. ברגע שגודל הזרם נראה תקין, יש לאזן את ריכוזי היונים בתמיסות משני צידי הממברנה על ידי הוספת מלחים יוניים נוספים לצד בעל הריכוז הנמוך.

כאן מוצגת תמונה של גביש דו-ממדי בצביעה שלילית, משלב האופטימיזציה של הגבישים. הגבישים נצבעו ב-6% ammonium moate, pH 6.4 בתוספת 0.5% triose, וזאת בשל העובדה שהסוכר מנע מהם לעיתים להיערם זה על זה. תיבת הריבוע השחורה מסמנת כאן אזור היוצר את תבנית הדיפרקציה עם נקודות הדיפרקציה.

ברזולוציה של כ-20 אנגסטרם, זוהי תמונת cryo EM של גביש דו-ממדי מדגימה הדומה לזו שהוצגה קודם לכן. הדגימה עורבבה עם 3% TLOs, הוקפאה בשיטת plonging ישיר וצולמה תחת cryo EM ב-50,000 decks. ניכר כי היו פגמים מקומיים באריזה הגבישית.

להלן תמונת cryo-EM נוספת של גביש שעבר אופטימיזציה נוספת. הדגימה הוטמעה ב-0.75% tannin וב-10% tree hellos, והתמונה צולמה בהגדלה של 50,000 x. הקווים הישרים באריזה הצפופה מעידים כי התעלות היו מסודרות היטב בסוג זה של גבישים, בעוד ששני החצים השחורים מסמנים את הווקטורים הריבועיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שתקבלו מושג טוב על האופן שבו יש לטפל בליפידים ובחלבונים כראוי, וכי סרטון זה יעזור לכם לחקור את השפעתם של ליפידים וחלבונים על הפעילות בממברנה בצורה יעילה יותר.