Name: הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין Elegans Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למד שיטת LC-MS/MS לזיהוי וכימות פרוסטגלנדינים ואייקוזנואידים ב-Caenorhabditis elegans. השיטה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר מטכניקות מסורתיות לחקר מטבוליזם ליפידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לmetabolomics UAB ממוקד ומעבדת פרוטאומיקה, אשר כבר נתמך בחלקו על ידי המרכז לחקר מחלות עור UAB (P30 AR050948 לג Elmets), מרכז UAB-UCSD אובריאן אקוטי בכליות הפציעה (P30 DK079337 לא Agarwal ) והמרכז לבריאות ריאות UAB (R01 HL114439, R01 HL110950 לי&quot;א Blalock). תמיכה בספקטרומטר המסה הייתה מNCRR משותף מכשור מענק (S10 RR19261 ס &#39;ארנס). אנו מודים גם ריי מור לקבלת תמיכה טכנית. ג זני elegans נמסרו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01GM085105 לMAM, כולל תוספת מנהלית ערה).

הפרוטוקול כפי שיתואר להלן מחולק לשלושה חלקים: תרבות תולעת, חילוץ פרוסטגלנדין, וניתוח פרוסטגלנדין. כאמור, יש מספר רב של נקודות, כאשר דגימות ניתן לאחסן באופן זמני ב -80 ° C או -20 ° C. 1. תרבות תולעת אנו ממליצים כ -6 גרם של תולעים בשלב מעורבים לLC-MS/MS המקיף. זה אמור לספק מספיק חומר לגילוי לפחות שש זריקות נפרדות. לכימות של PGs הידוע על ידי MRM בזריקה אחת או שתיים, 1-2 גרם מספיקים. ניתוח של תמציות מתרבויות מסונכרנות בהיקף של שלב מסוים הוא גם אפשרי. ניתן לגדל עד 4 זנים שונים בו זמנית. לדוגמה, סוג בר שליטה ושלושה זנים מוטנטים שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 65 צלחות NGM-X גדולים (16 ס&quot;מ) וחיידקים מרוכזים להאכלה משלימה. השתמש NA22 חיידקים לזריעה. כדי להפוך את החיידקים מרוכזים להזנה משלימה, Groלפחות ארבעה ליטרים של w NA22 במדיום LB ל16-24 שעות. ספין למטה, להסיר את supernatant, resuspend וחיידקים ל -100 מ&quot;ל של חיץ M9. 200 עד 400 מ&quot;ל של תמיסת חיידקים מרוכזת זו עשויה להידרש לכל זן תולעת. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תרבויות תולעת על 5 צלחות ה-X גדולים. תולעים לגדול לכ -3 עד 4 דורות עד שצלחות מלאים במבוגרים הרה להולדת. יש להוסיף לחיידקים מרוכזים צלחות כדי למנוע רעב, במידת צורך (~ מ&quot;ל / 1 צלחת ולתת להתייבש לחלוטין לפני חזרת המכסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף הרמפרודיטים הרה להולדת מצלחות עם חיץ M9 ולאסוף את התולעים בצינור פוליפרופילן חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הרמפרודיטים הרה להולדת להתיישב לתחתית (בדרך כלל כ 3-5 דקות). הסר supernatant, כולל חיידקים, ביצים, ותולעי שלב זחל. Resuspend ב15 מיליליטר חיץ M9 ולערבב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 μl של השעיה תולעת לכל אחד מ60 צלחות NGM זרע. לפזר תולעים בצלחות. שמור על פתרון תולעת מעורבתגם עד שכל הצלחות היו זורעים על מנת להבטיח שהם מקבלים מספרים שווים של תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים עם חיידקים מרוכזים לפי צורך (~ 24 ml/plate/12 לתקופת שעה 1) כדי למנוע רעב. לאפשר צלחות לייבוש באוויר לפני החלפת מכסים. לגדול תולעים במשך 2-4 דורות, בהתאם למספר המקורי של תולעי זרע, או עד צלחות מלאים במבוגרים הרה להולדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תולעת קציר זן אחד בכל פעם. לשטוף את תולעי הצלחות עם חיץ M9 ולאסוף בצינורות 50 מ&quot;ל פוליפרופילן (למשל 6 צינורות). השתמש חיץ M9 לשטוף את צלחת, ולאחר מכן להעביר את המאגר מלא תולעת לצלחת הבאה. לאחר שטיפת מספר (לדוגמה. ה -10) של צלחות, להעביר את המאגר מלא לתולעת צינור 50 מ&quot;ל. מלא את הצינור לחלק העליון עם חיץ M9. חזור על לשטוף לשאר צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו המבוגרים הרה להולדת ליישב לתחתית ב5-6 דקות, להסיר את supernatant (~ 35 מ&quot;ל) ולאחד לתוך צינורות אחד או שניים. ממלא את הצינורות ל 50 מ&quot;ל עם frאש M9 החיץ, לתת לעמוד במשך 3-5 דקות, ולהסיר מבוגרים הרה להולדת עוזבים supernatant. חזור 3 פעמים או עד supernatant הוא שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משעמם פיפטה פסטר גדולה, העברה כתולעים רבים ככל האפשר לשני צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל פוליפרופילן. ספין למטה ב 1000 RCF (~ 3,500 סל&quot;ד בCentraSL2) במשך 5 דקות בצנטריפוגה קלינית. הסר supernatant וחזור עד שכל התולעים ומועברים pelleted באותו הצינור. להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר ותולעים בחנות ב -80 ° C. חזור על פעולה עבור כל הזנים. </li></ol> 2. הפקת פרוסטגלנדין החומרים הכימיים הדרושים לחילוץ מוצגים להלן. השיטה היא שונה מזה של Golovko ומרפי 17 וכוללת מיצוי אצטון ואחריו טיהור נוזלית נוזלית, אשר משפרת את רגישות LC-MS/MS. Bullet בלנדר 5 homogenizer משמש בהליך, אם כי ניתן להשיג תוצאות דומות עם homogenizer Dounce. hydroxytolue Butylatedנה (BHT) ואידוי תחת חנקן (N 2) גז נמצא בשימוש כדי למנוע חמצון. כל כלי הזכוכית יש siliconized (Sigmacote) כדי להפחית מחייב שומנים בדם. מיצוי עם ממסים אורגניים יש לבצע במנדף כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל צינור פוליפרופילן חרוטי 50 מ&quot;ל. העבר כ 6.0 גרם של תולעים קפואים מצינור חרוטי 15 מ&quot;ל מאוחסן ב -80 ° C על ידי חיתוך דרך הצינור עם סכין גילוח חם ליד סימן מיליליטר 6.5. מרית מתנול לניקוי יכולה לשמש כדי להסיר את תולעת גלולה קפוא מהחלק התחתון של הצינור. על ידי חיתוך באמצעות גלולה כדי לאחזר את החלק התחתון, תולעי זחל פחות צפופים ושיירי חיידקים מהחלק העליון של גלולה נשארים מאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התולעים קפואים לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל נשקל מראש. אם דוגמאות רבות נמצאים בעיבוד, משתמש באותה הכמות (6.0 גר &#39;) של רקמה למחקרים השוואתיים. כהפשרת תולעים לעיסה, להוסיף או להסיר תולעים עם המרית כדי להשיג מסה הרצויה. אופציונלי: מודעהng ד 1.00 של PGF 2α-D4 סטנדרטי כמו בקרה פנימית ליעילות שאיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 מ&quot;ל של 2:1 קר כקרח אצטון / מלוח עם BHT 0.005% להשעית התולעת ומערבבת היטב על ידי vortexing. לוותר על 1.5 מ&quot;ל של תרחיף תולעת לכל אחד מעשרה 5 צינורות פלסטיק עצמי עומדים מ&quot;ל לשימוש בבלנדר Bullet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.7-0.8 מ&quot;ל של 0.5 מ&quot;מ הקוטר ceria התייצב חרוזים זירקוניום אוקסיד לכל צינור 5 מ&quot;ל. סגור את המכסים היטב ולטעון את 12 צינורות לתוך homogenizer Bullet בלנדר 5. הפעל את הבלנדר במשך 3 דקות במהירות 8-9 ומקום הצינורות על קרח. הקפד לסגור את המכסים באופן הדוק מאוד או התוכן עלול להישפך החוצה. בדקו 10 μl של homogenate מצינור אחד בשקופית באמצעות stereoscope. לא צריך להיות מעט מאוד תולעים שלמים שנותרו. חזור באותה המהירות עוד דקה, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה להעביר את homogenates לארבעה 10 צינורות זכוכית חרוטי מ&quot;ל באמצעות &quot;פיפטה פסטר 9. הימנע מהעברת חרוזים. שטוף את החרוזים משלושה צינורות sequentially עם 1 מ&quot;ל של אצטון 01:02 / BHT המכיל תמיסת מלח. חזור על פעולה עבור צינורות אחרים עד שכל חרוזים נשטפים. מעבירים את הפתרון הנותר (~ 4 מ&quot;ל) ל 10 מ&quot;ל צינורות הזכוכית ולמקם אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 מ&quot;ל צינורות זכוכית על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה קלינית ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. מעבירים את supernatant מצינור לצינור 10 מיליליטר חרוטי זכוכית נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף כימי, מוסיף נפח שווה של הקסאן לכל שפופרת זכוכית 10 מ&quot;ל. לדוגמה, הוסף הקסאן מ&quot;ל 3.5 מ&quot;ל לאצטון / תמיסת מלח 3.5. מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 10 מ&quot;ל צינורות זכוכית על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה קלינית ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. מחק את השלב העליון המכיל הקסאן ושומנים טעונים ניטראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת השלב נמוך יותר ל-pH 3.5 באמצעות 2 חומצה פורמית ז (כ 100 - 150 μl). pH בדיקה באמצעות רצועות pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של כלורופורם לצינור אחד. מערבולת במהירות המרבית למשך 30 שניות וצנטריפוגה הצינורות ב 4 ° C אניצנטריפוגות קליניות נה ב ~ 1000 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק את השלב העליון המימית. הכנס קצה פיפטה דרך כל שלבי ביניים חלביים שיורי לשלב כלורופורם הנמוך, הימנעות ביניים. לאסוף את השלב נמוך יותר מכל אחד 4 הצינורות לצינור זכוכית חרוטי נקי 15 מ&quot;ל. דגירה ב -20 ° C במשך לפחות 24 שעות. בשלב זה, ניתן לאחסן את התמצית ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמצית מהמקפיא וזורקים את השכבה העליונה המימית החלבית שנותרה, אם הוא קיים. מעבירים את שלב כלורופורם לבקבוקון זכוכית ½-דראם כותרת טפלון מרופד באמצעות pipet חדש פסטר. במנדף כימי, תתאדה חלק קטן המסיס בכלורופורם ליובש מתחת לזרימה עדינה של גז N 2. ניתן לאחסן התמצית מיובשת ב -20 ° C עד 2 שבועות. תכנית כוללת המשמשת להפקה וניתוח PG מוצגת באיור 1. </li></ol> 3. ניתוח פרוסטגלנדין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מנייתפתרונות של פרוסטגלנדינים התייחסות בודדים, כגון PGF 2α או PGF 2 α-D4 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במתנול ולדלל עם מתנול: מים (08:02 V / V) כדי להשיג פתרון עובד. הכן סדרה של דילולים (100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng / ml) כדי ליצור עקומה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מתנול μl: מים (08:02 V / V) לג המיובש תמצית elegans שומנים (ים) ומערבבים היטב. אם פחות מ -6 גרם של רקמת תולעת היה שחולץ, התמצית מיובשת יש resuspended בפחות נפח של מתנול: פתרון מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השלב הנייד בהיקף של 0.1% חומצה פורמית במים [] ואצטוניטריל המכיל חומצה פורמית 0.1% [B]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת autosampler על 4 מעלות צלזיוס ומניח את הבקבוקונים מדגם במעמד בקבוקון 1.5 מ&quot;ל 70-ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את עמודת RP-C18 סינרגיה הידרו עם חומצה פורמית 0.1% בקצב זרימה של 0.2 מ&quot;ל / דקה במשך כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק המדגם (20-50 μl) לעמודה. לבצע שיפוע elution התחלהing עם 10% ב &#39;והולך עד 80% B מ 0-11 דק&#39;, ב &#39;80-100% 11-14 דקות, וחוזר חזרה ל10% ב&#39; ב 16 דקות. סה&quot;כ זמן הריצה הוא 20 דקות. זמני השמירה של 13 תקנים אותנטיים מוצגים בטבלה מס &#39;1 לעיון 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את עמודת השפכים לספקטרומטר המסה באמצעות הפעלה ממשק ESI במצב היונים השלילי. חנקן משמש כnebulizer וגז וילון (נוכ = 10). התנגשות הגז, האנרגיה התנגשות, והטמפרטורה נקבעים בגיל 10, ו-35 eV 600 מעלות צלזיוס, בהתאמה. פוטנציאל Declustering (DP), התנגשות אנרגיה (CE), ופוטנציאל יציאת תא (CXP) נקבעים ב-90, -35 ו -10, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור סריקות סקר (סריקות רבעון 1), השתמש במצב יון שלילי בטווח המסה של m / z 315-360 עבור רוב PGs (איור 2). ניתן לשנות את הטווח, בהתאם למסה של המתחם (ים) של עניין. לחלץ יונים מיון נוכחי כולל (עוית) של chromatograms יון LC-MS ולקבוע אם extracיוני טד מתאים ליוני deprotonated או adduct, או ליונים שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסויים של MRM, מעבר המוני מ &#39;/ z 355/311 משמש כדי לזהות את מעמד F1, מ&#39; / z 353/193 משמש לכיתת F2 ו&#39;/ z 351/193 או 351/191 משמש לכיתת F3 (איור 3). MRM משמש גם כדי לזהות את התקן הפנימי (לדוגמה, מ &#39;/ z 357/197 לPGF 2α-D4) ועל מנת ליצור את העקומה הסטנדרטית. ראה מרפי et al. לקבלת מידע נוסף על מעברים המוניים PG 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניסויי MS / MS, השתמש מ &#39;/ z 355 לכיתת F1, F2 כיתת 353for מ&#39; / z, וPGs מ &#39;/ z 351for F3 ייצוגית. ג נתוני elegans MS / MS לPGs F-Series זמין באיור 4 וטבלה 2 3,16. נתונים MS / MS לeicosanoids יונקים זמין <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">בwww.lipidmaps.org.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את נתוני האנליטיות באמצעות analysתוכנה לא (גרסת 1.4.2, יישומי Biosystems). </li></ol>

<ol><li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li>
<li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li>
<li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li>
<li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li>
<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li>
<li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li>
<li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li>
<li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandins+and+leukotrienes%3A+advances+in+eicosanoid+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li>
<li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li>
<li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+prostanoids%3A+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li>
<li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors%3A+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li>
<li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors%3A+studies+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprostanes%3A+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li>
<li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).</li>
<li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+LC-MS%2FMS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li>
<li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li>
<li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li>
<li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biodivers%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li>
<li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
</ol>

יש החוקרים אין ניגודי אינטרסים.

אנו מתארים הליך להפקה וניתוח eicosanoid, תוך התמקדות בPGs F-Series. ישנם כמה חלקים של ההליך שיכול להיות בעייתי. ראשית, זה קריטי, כי תרבויות התולעת לא לגווע ברעב, כמו רעב יכול לשנות את חילוף החומרים PG. להזנה משלימה, NA22 חיידקים מומלצים במקום OP50 חיידקים יותר נפוצה בגלל NA22 מגיע צפיפות גבוהה יותר. עם זאת, מתח NA22 חסר עמידות לאנטיביוטיקה והוא רגיש יותר לזיהום. שנית, תולעים לסנתז איזומרים PG בודדים בשפע נמוך יחסית לרקמות יונקים. זה יכול להיות בגלל בחלקו ליתירות בין איזומרים רבים. אנו ממליצים על 6 גרם של רקמה לניתוח מקיף ואותות חזקים יותר. רקמה פחות (1-2 גרם) יכולה לשמש אם התמצית מיובשת היא resuspended בפחות מתנול: פתרון מים כדי להגדיל את ריכוז PG. עם זאת, יכולות להתבצע רק 01:59 זריקות. גבול הגילוי של מערכת LC-MS/MS שלנו הוא כ -10 PGPGF 2α / מ&quot;ל. מ&quot;ל אחד של תולעים בשלבים מעורבים בצפיפות (כ 1 ז) מניב בערך 25-50 PG של CePGF2. מערכות ספקטרומטריית מסה יותר רגישות יכולות להפחית את כמות רקמת תולעת נדרשת לניתוח. שלישית, הבדלים ביעילות שאיבת PG בין דגימות יכולים לגרום לתוצאות משתנות. מצאנו כי יעילות שאיבה דומה מאוד כאשר רקמות המחולצות במקביל. כדי לקבוע את היעילות, להוסיף 1.0 ננוגרם של PGF 2α-D 4 בצעד homogenization כבקרה פנימית. MRM באמצעות מעבר המוני מ &#39;/ z 357/197 משמש למדידת ריכוז PGF 2α-D4 יחסית לng 1 / מיליליטר פתרון סטנדרטי. כמות PGF 2α-D 4 איבד במהלך החילוץ ולאחר מכן מחושבת. ניתן לשנות את פרמטרי כרומטוגרפיה והמעברים המוניים שכוללים לזהות PGS וeicosanoids אחרים. למרות מאמצים רבים, לא הצליחו לזהות D-סדרה או E-series PGS בתמציות 17. יתר על כן, יש לנו לא זוהה 8-ISO PGF 2α ו8-ISO PGE 2 שאופייניים לחמצון רדיקלי ביוזמת חופשי, אשר יוצר תערובת לא סלקטיבי של PG stereoisomers 19. בין אם תולעים לסנתז סוגי PG אחרים אינו ידוע. Endocannabinoids מטבוליטים אפוקסי והידרוקסי שונים של הארכידונית וחומצות eicosapentaenoic כבר נמצאו בג elegans מחלץ 5,7,20,21. אנו ממליצים על השימוש בשני MRM ו-MS / MS בהשוואה לסטנדרטים אותנטיים לכימות וזיהוי, בהתאמה. לeicosanoids הרומן, צריכים להיות בשילוב עם ניתוחים אלה מחקר השוואתי של מוטציות שומן, שהם חסרים PUFA סינתזה 22 אנזימים, כמו גם assay פונקציונלי, במידת האפשר. אזהרה לניתוח מוטציות שומן היא שהכמויות זעירות של PUFAs בהווה בתולעים מספיקות לסינתזת PG. לדוגמה, בשומן (2 wa17) מוטנטיםיש כמות קטנה של פעילות desaturase D12 (~ 5% מהסוג בר 22) ומוטציות אלה עדיין מייצרים 6 PGs. שומן 3 (wa22) ושומן-4 (wa14) מוטנטים מצליח לסנתז PGs נגזר מהארכידונית וחומצות eicosapentaenoic 16 . אנחנו גם מצאנו כי מוטציות שומן לפצות על האובדן של כיתות PUFA בשיעור של עד ויסות סינתזת PG מכיתות שנותרו. לדוגמה, בשומן 3 (wa22) מוטנטים מצליח לסנתז רוב PGs נגזר מPUFAs 20 פחמן. במקום זאת, הם מופיעים למעלה להסדיר PGs הרומן נגזר מ18 פחמן PUFAs 16. נכון להיום, יש לנו לא זיהינו את ג elegans זן שהוא חסר לחלוטין בסינתזת PG. יתכן כי PGs חיוני לצמיחה או התפתחות.

פרוסטגלנדינים (PGS) הם מעמד חשוב של הורמוני שומנים שנחקרו בהרחבה ומעורבת בויסות רבייה, חסינות, ופיתוח במגוון רחב של אורגניזמים 12-14. PGs מתאים בצורה אידיאלית לניתוחי ביולוגיה מערכות מקיפים משום שהם מהווים סדרה של שומנים שמקורם מבשר נפוצה (ים). נמטודות ג elegans הוא אחד מיצורי המודל הנפוץ ביותר כדי לענות על שאלות בסיסיות בגנטיקה וביולוגיה של מערכות. אנחנו הוכחנו כי ג elegans מסנתז PGs F-Series שמדריך ניעתי זרע לביציות 3,6,16. PGs F-Series נגזר מPUFAs 20 פחמן עם שלוש, ארבע, וחמישה קשרים כפולים, הכוללים את F1, F2, F3 וכיתות, בהתאמה זוהה 3,16. PGs אלה מסונתזים עצמאי של אנזימי cyclooxygenase, עדיין stereoisomers 2α 1α וPGF PGF עדיין generated. עבור ניתוחים איכותיים וכמותיים של ג elegans PGs, LC-MS/MS הוא טכניקה אנליטית חזקה ורגישה. לפני ביצוע ניתוח זה, חשוב לפתח שיטת חילוץ אופטימלית בגלל ביצועים של התהליך האנליטי תלויים בכבדות על איכות התמצית. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה יכולות רק לספק המונית צפוי לחייב את היחס (מ &#39;/ z), כמו גם את הצורה רצויה לשיא וזמן שמירה של יון הורה PG. פרופיל מטבולי של PGs בג elegans הוא משימה מאתגרת הדורשת אסטרטגיות רכישת MS שונות. סריקת סריקה או סקר מלאה LC-MS (סריקת Q1) יש את היתרון של הבטחת PGs ionizable ביותר יגרור תגובת ספקטרומטריה. תוך סריקת הסקר מספקת מידע שימושי על פרופיל כולל של PGs ביחס לפראי סוג ומוטצית ג elegans, גילוי של PGs קטין נפגעת בשל רגישות נמוכה. Nevertheפחות, סריקת סקר LC-MS יכולה לתת ראיה גלובלית של PGS ושימושי במיוחד לניתוח חזו מוטציות משפיעים על חילוף חומרים של אוכלוסיית PG גדולה. יש להציג התעודה מזהה המטבוליט, ניתוח LC-MS/MS של תקני PG מסונתזים כימי מבוצע ראשון לקבל ספקטרום יון המוצר שלהם כתרכובות התייחסות. ספקטרום אלה יכולים להיות בהשוואה לספקטרום של המטבוליט לא ידוע. ניטור מצב תגובה מרובה (MRM) משמש לרגישות וסגוליות משופרים. ניסוי MRM מושגת על ידי ציון המעבר המוני יון יון / מוצר האב של מתחם. אם ידע את המסה והמבנה של analytes היעד, ניתן לחזות מעברי MRM תיאורטיים למטבוליטים רבים לא ידועים. שיטת LC-MS/MS מותאמת לפרופיל PGs isomeric בג elegans לא דווח. כאן אנו מתארים חילוץ וגישת ספקטרומטריית מסה משולבת בהיקף של LC-MS וLC-שיטות MS / MS לאיתור, כימות, וחוקר ג מטבוליטים PG elegans. גישה זו יכולה להיות מיושמת על eicosanoids אחר.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>X-large (16 ס"מ) לוחות</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli זן NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>Acetone, 399.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>Butylated Hydroxytoluene</td><td>MP Biomedicals</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן, חומצה</td> פורמית <td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td>בדרגת HPLC</tr><tr><td>, 399%</td><td>Acros</td><td>AC27048-0010</td><td>זמין דרך Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chloroform, Acros בדרגת HPLC</td><td></td><td>AC26832-0010</td><td>זמין דרך Fisher </td></tr><tr><td>מדעי PGF2<תת>ואלפא; -d4</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman יש מגוון רחב של תקנים זמינים לרכישה</td></tr><tr><td>מכסה בורג סטרילי צינור 5 מ"ל Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-222-651</td><td>לשימוש עם Bullet Blender</td></tr><tr><td>0.5 מ"מ חרוזי תחמוצת זירקוניום</td><td>הבא> > > Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים כבדים מזכוכית</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>זמין דרך Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים מזכוכית</td><td>Corning Pyrex</td><td>8082-15</td><td>זמין דרך Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sigmacote (מגיב סיליקון)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>טפלון מרופד 1/2 בקבוקון זכוכית Dram</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>CentraSL2 צנטריפוגה קלינית</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>בלנדר כדורים 5 הומוגנייזר כחול</td><td>הבא> > > Advance</td><td>BBY5MB</td><td>A 40 מ"ל Dounce הומוגנייזר יכול לשמש כחלופה</td></tr><tr><td>Synergi 4 &mu; m הידרו-RP 80 ו-#197; LC עמוד 250 x 2.0 מ"מ</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>HPLC עמוד</td></tr><tr><td>SecurityGuard מחסניות AQ C18 4 x 2.0 מ"מ</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מחסניות SecurityGuard</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu בולטות HPLC עם דגימה אוטומטית בקירור</td><td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td><td></td><td>כל מערכת HPLC סטנדרטית המחוברת לספקטרומטר מסה משולש מרובע אמורה להספיק</td></tr><tr><td>API 4000 ספקטרומטר מסה משולש מרובע</td><td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2"><מתכון חיץ חזק>M9 (4 ליטר)</חזק></td> </tr> <tr> <td>12 גרם</td> <td> KH2PO4</td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na2HPO4</td> </tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>עד 4 ליטר</td> <td>מים נטולי יונים</td> </tr> <tr> <td colspan="2">Aliquot לשמונה בקבוקי 1 ליטר. חיטוי וקירור.</td> </tr> <tr> <td>0.5 מ"ל/בקבוק</td> <td>1 מ' MgSO4</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; elegans caenorhabditis</em

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

elegans Caenorhabditis מתגלה כמודל חיה רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה של שומני 1-9. פרוסטגלנדינים הם מעמד חשוב של eicosanoids, שהם אותות שומנים שמקורם בחומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFAs) 10-14. מולקולות האיתות הללו הן קשים ללמוד בגלל השפע הנמוך שלהם והאופי תגובתי. התכונה האופיינית של פרוסטגלנדינים היא מבנה טבעת cyclopentane ממוקם בתוך עמוד השדרה חומצות השומן. ביונקים, יכולים להיווצר באמצעות פרוסטגלנדינים cyclooxygenase מסלולים ועצמאיים 10,15 אנזים התלויים. ג elegans מסנתז מגוון רחב של פרוסטגלנדינים עצמאיים של cyclooxygenases 6,16,17. מעמד גדול של פרוסטגלנדינים F-Series זוהה, אבל המחקר של eicosanoids הוא בשלב מוקדם עם מספיק מקום לגילויים חדשים. כאן אנו מתארים הליך להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים וeicosanoids אחרים. שומנים טעוניםים מופק מתרבויות תולעת ההמוניות באמצעות טכניקת מיצוי נוזלית נוזלית ונותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים את electrospray יינון טנדם ספקטרומטריית המסה (LC-ESI-MS/MS). הכללתו של אנלוגים deuterated של פרוסטגלנדינים, כגון PGF 2 α-D 4 כסטנדרט פנימי מומלץ לניתוח כמותי. ניטור תגובה מרובה או MRM יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות סוגי פרוסטגלנדין ספציפיים בין חיות בר מסוג והמוטציה. פירוק מושרה מהתנגשות או MS / MS יכול לשמש כדי לקבל מידע על תכונות מבניות חשובות. כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) סריקות סקר של טווח מסה שנבחר, כגון מ &#39;/ z 315-360 ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים הגלובליים ברמות פרוסטגלנדין. אנו מספקים דוגמאות לכל שלושת הניתוחים. שיטות אלה יספקו לחוקרים עם כלים לגילוי eicosanoids רומן והתוויית המסלולים מטבוליים שלהם.

הכנת מדגם בוצעה על ידי שאיבת נוזל נוזל מותאמת Golovko ומרפי 17. היא סיפק התאוששות מצוינת של התקן הפנימי (PGF 2α-D4). התכנית הכללית להפקת PG מג elegans מוצג באיור 1. תנאים כרומטוגרפי היו מותאמים כדי לספק הפרדה בסיסית של&gt; 30 תקני eicosanoid (טבלה 1 מציגה 13 תקנים). טור הידרו-RP (250 x 2.0 מ&quot;מ id) עם מים ואצטוניטריל המכילים חומצה פורמית 0.1% סיפק את ההפרדה ואת הרגישות הטובה ביותר. סריקות סקר של תמציות מוטציה wild-type ושומן 3 שמוצג ב2 רמות גלובליות מסמכי דמותו של יונים בטווח המסה של 315-360 יחידות מסה אטומיות. שומן 3 (wa22) מוטנטים חסרים PUFAs ביותר של 20 פחמן. כיתת PG F3 מודגשת. באיור 3, ניתוחי MRM של תמצית פראי סוג להראות איזומרים PG מרובים של F1 (איור 3 א </stro<html> ng&gt;), F2 (איור 3), וF3 (האיורים 3C ו3D) כיתות. כיתת F3 יכולה להיות מזוהות עם אחד משני מעברים המוניים, מ &#39;/ z 351/193 או מ&#39; / z 351/191. CePGF2 מורכב בעיקר מenantiomer 2α PGF. CePGF1 צפוי להיות PGF 1α או enantiomer. איור 4 מראה את הפירוק מושרה התנגשות של CePGF2 (RT = 11.8), בהשוואה לPGF2 α הסטנדרטי (RT = 11.8). הבדלים קלים ביוני המוצר צפויים בשל שפע CePGF2 נמוך ותרכובות שיתוף משחררי בתמצית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי של ג elegans PGs חילוץ וניתוחי LC-MS. שים לב שאצטון / מלוח וכלורופורם יש גם BHT 0.005% כדי למזער את חמצון שומנים בדם. מתייחס לטקסט לקבלת פרטים נוספים.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> איור 2. סריקות סקר מ &#39;/ z 315-360 של תמציות מוטציה wild-type ושומן 3 (wa22). זמן שמירת כרומטוגרפיה נוזלי (RT) מוצגת בלוח []. יונים שחולצו ב RT = 11.3 מוצגים לטבע מסוג [b] ושומן 3 (wa22) ג [] תמציות. כיתת PG F3 עם מסת m / z 351 מודגשת. CPS, ספירות / sec; האמו, יחידת מסה אטומית. <img alt="איור 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> תאנהיור 3. ניתוחי MRM של תמציות wild-type. PGS כיתת F1 מזוהים עם מעבר המוני מ &#39;/ z 355/311 [א]. שים לב שמספר תרכובות הידרופוביות (RT&gt; 14 דק &#39;), שאינן צפויים להיות PGs, גם מזוהות עם המעבר הזה. PGs כיתת F2 מזוהים עם מעבר המוני מ &#39;/ z 353/193 [ב&#39;]. PGs כיתת F3 מזוהים גם עם מעבר המוני מ &#39;/ z 351/193 [ג] או מ&#39; / z 351/191 [ד]. שים לב שהתמציות מכילות איזומרים PG מרובים של כל כיתה. מספרים מתאים לPGs מוצג בטבלה 2. הריכוז של CePGF2 הוא 1.8 ng / ml. RT, זמן שמירה; CPS, ספירות / sec. <img alt="איור 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> איור 4. פירוק מושרה מהתנגשות של סינטיסייזר כימיesized PGF 2α וCePGF2. חיצים בפנל [] מצביע יוני מוצר או פיצול משותף בין PGF 2α וCePGF2 (RT = 11.8). את יוני המוצר במ &#39;/ z 309 ו&#39;/ z 193 נוצרים מביקוע אתרים המצוינים (מסומן A ו-B), המתאימים למבנים שמוצגים, ואופייניים לPGs F-Series [B]. CPS, ספירות / שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סטנדרטי </td><td> RT (דקות) </td><td> [MH] - מ &#39;/ z </td><td> יוני מוצר עיקריים ב-MS / MS </td></tr><tr><td> 20-הידרוקסי PGE 2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> Thromboxane ב &#39;2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> 1 PGF - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxin B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271,203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxin 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leukotriene B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HpETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> טבלת מס &#39;1. פעמים שייר ויונים מוצרים עיקריים של 13 תקני eicosanoid משיטת LC-MS/MS 3. למעלה מ -30 תקנים שמשו לפיתוח תכנית LC-MS/MS. זמני שמירת chromatographic (RTS) שונים, גם בקרב PGs דומה מאוד. יוצא מן הכלל הוא 2α 1α וPGF PGF. עם זאת, אלה הם PGs דistinguished ידי המוניהם הוריים יון ([MH] - מ &#39;/ z) והתנגשות המושרה ספקטרום פירוק (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כיתת פרוסטגלנדין </td><td> מס באיור 3 </td><td> [MH] - מ &#39;/ z </td><td> יוני מוצר עיקריים ב-MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> טבלת 2. יוני מוצר פירוק מושרה מהתנגשות עבור מספר ג הגדול elegans F1, F2, F3 וPGs מוצגים באיור 3. MS / MS של איזומרים פחות שפע אחרים אינם מוצג. נתונים אלה הם מן הניתוחים מרובים וכל יוני המוצר לא יכולים להיות גלויים לעין בטווח נתון. בהתחשב במורכבות של התמציות, יוני מוצר פחות שפע מסוימים יכולים לנבוע מיון הורה אחר עם זמן שמירה דומה או כתוצאה מהפרעה. שיא 2 סביר stereoisomer של CePGF1 והשיא 4 עשוי stereoisomer של CePGF2. ראה אדמונדס, et al. (2010) עבור נתונים נוספים 3.

במאמר זה, אנו מתארים הליך אופטימלי להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים ואחרים מeicosanoids<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

נוהל זה נועד לזהות ולמדוד פרוסטגלאנדינים ואייקוזנואידים אחרים בתמציות של sea elegance. ראשית, גדלו את התולעים בתרביות בקנה מידה גדול. לאחר מכן, באמצעות טכניקת מיצוי נוזל-נוזל, מצהו את הליפידים ההידרופיליים מרקמת התולעת, והזריקו את תמציות הליפידים לעמודת HPLC המחוברת לספקטרומטר מסות.לאחר מכן נתח את הנתונים מהכרומטוגרפיה נוזלית עם ספקטרומטריית מסות טנדם. בסופו של דבר, גישת lc MSMS זו לתמציות חמימות מטוהרות יכולה לזהות מטבוליטים חדשים וכן למדוד מטבוליטים ידועים, כגון פרוסטגלנדינים מסדרת S. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תבחיני אימונו-אנזימטיים, הוא שהיא רגישה וספציפית מאוד, ובו בזמן מקיפה וגמישה. את הטכניקה הזו יעגון Hugh Hong, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי, עבור האכלה משלימה של התולעים עם pellet ו-NA 22.סנטריפוגציה של תרבית חיידקים, השלכת הנוזל העליון (supernatant) ותליה מחדש של משקע החיידקים ב-100 milliliters של בופר M9. אחסון של תמיסת החיידקים המרוכזת בטמפרטורה של 4 °C. תחילת גידול תרביות תולעים בחמישה מצעי NGM בגודל extra large.המשיכו להרבית את התולעים במשך שלושה עד ארבעה דורות עד שהצלחות יתמלאו. כדי למנוע הרעבה של הבוגרים, הוסיפו לפי הצורך כ-1 ml של חיידקים מרוכזים לצלחות התולעים. ייבשו באוויר לחלוטין לפני החזרת המכסה.בשלב הבא, שטפו את התולעים ההרמפרודיטיות שנאספו מהצלחות באמצעות תמיסת M9. אספו את התולעים לשפופרת פוליפרופילן קונית בנפח 50 milliliter. לאחר מכן, המתינו עד שהתולעים ישקעו לתחתית.שפכו את הנוזל העליון המכיל ביצי בקטריות ותולעים בשלב הזחל. כעת, השעו את התולעים הנותרות ב-15 milliliters של בופר M9 וערבבו בעדינות. חלקו 200 microliters מתיתDNF תליית התולעים לכל אחת מ-60 צלחות NGM שהוכןו מראש.שמרו על ערבוב טוב של תמיסת התולעים עד להזרעת כל הצלחות, כדי להבטיח שהן יקבלו מספרים שווים בקירוב של תולעים. פזרו את התולעים על פני הצלחות. גדלו את התולעים למשך שני עד ארבעה דורות, תוך הוספה של 1 mL של חיידקים מרוכזים לצלחת בכל תקופה של 12 עד 24 שעות.כאשר הצלחות מלאות בבוגרים של GR, קצרו את התולעים מאבזר אחד בכל פעם. שטפו את התולעים מהצלחות באמצעות תמיסת M nine והעבירו אותן לשישה מבחנות פוליפרופילן של 50 milliliter. מלאו את המבחנות בתמיסת M nine כדי לשטוף את התולעים.כאשר התולעים הבוגרות שוקעות לתחתית, יש להסיר כ-35 milliliters של הנוזל העליון. לאחר מכן, יש להעביר את התולעים לשפופרת אחת או שתיים. יש לחזור על השטיפה ב-M nine שלוש פעמים או עד שהנוזל העליון הופך שקוף, באמצעות פיפטת פסטור רחבה.העבירו כמה שיותר תולעים לשפופרת קונוית מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר. סבבו בצנטריפוגה ב-1000 RCF למשך חמש דקות והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). חזרו על שלבי האיסוף, השטיפה והריכוז עבור השבטים האחרים.יש לאחסן מנות של זני התולעים שנאספו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. סמנו את משקל המבחנה הקוני מפוליפרופילן באמצעות להב תער לוהט. חתכו מבחנת פוליפרופילן קפואה המכילה תולעים שנאספו בקרבת סימון ה-6 ml.בתנאים סטריליים, העבירו כ-6 g של משקע תולעים קפוא לדגימה המיועדת. הוסיפו 1 ng של התקן הפנימי ו-12 mL של תמיסת אצטון-סליין קרה מאוד (בטמפרטורת קרח).בעזרת תערובת BHT, חלק באופן שווה 1.5 מיליליטר של תרחיף התולעים ל-12 מבחנות פלסטיק עומדות בנפח של חמישה מיליליטר לכל מבחנה. הוסף 0.7 מיליליטר של חרוzi זירקוניום אוקסיד מיוצבים. הומוגניז את תרחיף התולעים במידת הצורך.חזור על התהליך למשך דקה נוספת עד לקבלת פחות מ-10% של תולעים שלמות, תוך שימוש בפיפט פסטור של תשעה אינץ'. העבר בזהירות את ההומוגנאט, אך לא את החרו지를, לארבעה מבחנות זכוכית קוניות של 10 מיליליטר. איחד את החרוזים משלוש מבחנות ושטוף אותם במיליליטר אחד של תמיסת סלין-אצטון המכילה BHT.חזרו על שטיפה זו עבור שאר המבחנות המכילות חרוצים. העבירו את תמיסת השטיפה למבחנות זכוכית על קרח. לאחר מכן, סבבו את ההומוגנאט בצנטריפוגה במהירות 1000 Gs למשך 10 דקות.בטמפרטורה של 4 °C, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה למבחנה קונית נקייה מזכוכית בנפח 10 ml. לאחר מכן, בתוך מcomme כימי, הוסיפו לכל מבחנה נפח שווה של hexane וערבבו במערבל וורטקס (vortex) במהירות מרבית למשך 30 שניות. לאחר מכן, בצעו סרצ'פוגה בטמפרטורה של 4 °C במהירות של 1000 Gs למשך 10 דקות.שפכו את הפאזה העליונה המכילה את ה-hexane וליפידים בעלי מטען ניטרלי, והוסיפו formic acid בריכוז של two millimolar כדי להחמיץ את הפאזה המימית התחתונה. בדקו באמצעות נשיר pH שה-pH הוא 3.5. כעת, הוסיפו נפחים שווים של chloroform לכל מבחנה וערבלו במערבל vortex במהירות מקסימלית למשך 30 שניות.סבבו את הדגימות בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C במהירות של כ-1000 ×g למשך 10 דקות. הכניסו קצה של פיפטת זכוכית לשכבת הכלורופורם התחתונה ונסו להימנע מהממשק המוצק על ידי הטיית המבחנה. העבירו את התמציות מארבע מבחנות למבחנה אחת קונוית מזכוכית בנפח של 15 mL.רוקנו את האוויר מהנבובת הזכוכית באמצעות גז חנקן והדגירו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד שבועיים. לאחר הפשרת התמצית, השליכו את השכבה המימית החלבית שנותרה בראש הנבובת, במידה והיא קיימת. השתמשו בפיפטה חדשה.העבר את הכלורופורם לבקבוק זכוכית חצי DRM עם ריפוד טפלון המסומן, בתוך מנדף כימיים. איד את הממס האורגני בזרם עדין של גז חנקן ואחסן את הדגימות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך עד שבועיים. ראשית, הכן תמיסות סטוק של פרוסטגלנדינים רפרנס אינדיבידואליים במתנול.כעת הכינו עקום סטנדרטים באמצעות דילול סדרתי ב-80%methanol. לאחר מכן, המיסו את תמציות הליפידים המיובשות של sea elegance ב-200 microliters של 80%methanol לצורך אנליזה. הזריקו 20 עד 50 microliters מהדגימה לעמודת reverse phase ובצעו אנליזת גרדיאנט כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, תוך שימוש בממשק ESI במצב יונים שלילי.העבירו את תסמיך העמודה אל תוך ספקטרומטר המסות. הגדירו את גז ההתנגשות ל-10 electron volts ואת אנרגיית ההתנגשות ל-minus 35 electron volts.הטמפרטורה היא 600 °C. פוטנציאל ניקוי הרעשים (decluttering potential) של 90- ופוטנציאל יציאת התא של 11- מייצרים עקום סטנדרטי לניתוח המחלקות השונות של פרוסטגלנדינים הנמצאים בדגימות המופקות באמצעות תוכנת analyst. עיבדו את הנתונים כדי לזהות את הפרוסטגלנדינים הנמצאים בתמציות התולעים.סריקות סקר של תמציות תולעים מסוג בר (wild type) ותולעים מוטנטיות מסוג fat three מראות את הרמות הגלובליות של יונים בטווח מסות של 315 עד 360 יחידות מסה אטומית. בהשוואה לתולעי הבר, במוטנטיות fat three חסרים רוב ה-pfas בעלי 20 פחמנים, כפי שמוצג על ידי פרוסטגלאנדין מסוג F three. כאשר יחס מס-מטען של 3 51 מודגש באפור, אנליזות MRM יכולות לזהות את המחלקות השונות של פרוסטגלאנדינים.לדוגמה, פרוסטגלאנדינים מסוג F1 נמצאים בתמציות של טיפוס בר, כמו גם מספר תרכובות הידרופוביות אחרות בעלות זמני שימור ארוכים יותר; שינוי במעבר המסה מאפשר ניתוח נוסף של פרוסטגלאנדינים מסוג F2 ו-F3, מה שמעיד על כך שתמציות התולעים מכילות איזומרים מרובים של פרוסטגלאנדינים מכל סוג. השוואה בין הפירוק המושרה בהתנגשות (collision induced decomposition) של הפרוסטגלאנדין מ-C. elegans לבין פרוסטגלאנדין סטנדרטי יכולה לשמש למיפוי של יוני מוצר מאתרי שבירה צפויים. על מנת למנוע חמצון של ליפידים.זכרו לנקוט באמצעי הזהירות המתאימים. לדוגמה, הוסיפו את הנוגד החמצון VHT לתמיסה המצוינת ונקו את התמצית באמצעות גז חנקן.

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעקבות חשיפה לגורמי לחץ סביבתיים ספציפיים, הנמטודה Caenorhabditis elegans עוברת פלסטיות פנוטיפית נרחבת כדי להיכנס לשלב נעורים 'דאואר' עמיד ללחץ.  אנו מציגים שיטות לאינדוקציה מבוקרת והדמיה של נוירופלסטיות במהלך דאואר.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

זרע חייב לנווט בהצלחה דרך צינור ההטלה כדי להפרות oocyte. כאן אנו מתארים את הבקשה למדידת העברת זרע  בתוך הרחם הדו. הדבר יכול לספק נתונים כמותיים על חלוקת זרע בתוך הרחם לאחר ההזדווגות, כמו גם על מהירות, מהירות כיוונית ותדר היפוך.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis...

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

למד שיטת LC-MS/MS לזיהוי וכימות פרוסטגלנדינים ואייקוזנואידים ב-Caenorhabditis elegans. השיטה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר מטכניקות מסורתיות לחקר מטבוליזם ליפידים.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין

גלה סרטונים נוספים