הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין חלבונים קשורי-DNA אוליגומריים גדולים, כגון MGM 1 0 1, באמצעות אסטרטגיית תיוג של חלבון קושר-מלטוז (MVP). הדבר משיג על ידי שיבוט ראשוני של מסגרת הקריאה הפתוחה של MGM 1 0 1 במורד ה-MVP בווקטור PMLC two E לצורך ביטוי ב-e coli. חלבון היתוך M-V-P-M-G-M 1 0 1 מופק לאחר מכן מ-e coli באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מסוג AMLO.

לאחר מכן, MGM 1 0 1 משוחרר מ-MVP על ידי פילוח פרוטאוליטי (Proteolytic Cleavage) ומופרד מ-MVP באמצעות כרומטוגרפיית חילוף קטיונים. לבסוף, טבעות ה-MGM 1 0 1 מטהרות לרמה של הומוגניות באמצעות כרומטוגרפיית הדרה על בסיס גודל. התוצאה הסופית היא כ-0.8 milligrams של MGM 1 0 1 ממיס.

ניתן להשתמש בליטר אחד של תרבית חיידקית לאפיון ביוכימי ומבני של חלבון זה, החיוני לתיקון DNA במיטוכונדריה. היתרון המרכזי בשימוש בגרסה של MGM 1 0 1 המסומנת בחלבון קישור מומת (mortal binding protein) הוא שגרסה זו היא פחות רעילה, ממיסה ויציבה יותר מהגרסה שאינה מסומנת. כתוצאה מכך, אנו יכולים להשיג רמת ביטוי גבוהה של חלבון MGM 1 0 1 טבעי ב-e coli.

שלום, שמי שרה ויקי. אני מומחית בכירה לתמיכה במחקר במעבדתו של ד"ר Jji TEN כאן באוניברסיטה הרפואית SUNY Upstate. עמיתי, ואן וונג, ואני נדגים כעת את הביטוי והטיהור של MGM 1 0 1. נתחיל ביצירת חלבון החיסון באמצעות PCR להגברה של רצף הקידוד הבשל של MGM 1 0 1.

אין לכלול את 22 השאריות האמינו-טרמינליות הראשונות של MGM 1 0 1, הידועות ככאלו שעוברות שסוע (cleaved). לאחר הייבוא למיטוכונדריה, MGM 1 0 1 המוגבר ממוקם במורד רצף ה-MAL E, המקודד לחלבון קושר מלטוז או MVP, בגרסה שונה של וקטור הביטוי PM MAL C two E. פעולה זו יוצרת את חלבון היתוך M-V-P-M-G-M 1 0 1 עם מקשר (linker) המכיל אתר שסוע עבור הפרוטאז המדויק (precision protease). הפלסמיד נבנה תחילה על ידי בחירת טרנספורמנטים של e coli ללא שימוש בבחירה כחול-לבן.

את הפלסמיד שהתקבל, PLC two E, MGM 1 0 1, מחדירים לאחר מכן למסלול ה-e coli, BL two one codon plus DE three RIL, ומגדלים אותו על מצעי LB המכילים ampicillin ו-chloramphenicol. התחילו בהחדרה של הטרנספורמנטים של ה-e coli לתוך 10 milliliters של מצע LB טרי ומועשר, והדגירו ב-37 degrees Celsius למשך לילה עם ניעור ב-200 RPM. למחרת, הדגירו שני ליטרים של מצע LB מועשר בעזרת 10 milliliters מהתרבית המוקדמת.

גדלו את התאים בטמפרטורה של 37 °C תוך써 ניעור. כאשר ה-OD 600 מגיע ל-0.5, השרו ביטוי של חלבון היתוך M-B-P-M-G-M 1 0 1 על ידי הוספת IPTG בריכוז סופי של 0.3 Millimolar; גדלו את התאים עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש שעות. לאחר חלוף חמש שעות, העבירו את התרביות לבקבוקי צנטריפוגה של 500 milliliter ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה.

לאחר השלכת הנוזל העליון, הוסף 30 milliliters של בופר ליזיס המכיל מעכבי פרוטאז ותלה מחדש את משקע התאים על ידי שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) באמצעות פפיטה. לאחר מכן, בצע סוניקציה לתליית התאים על קרח למשך 20 שניות. באמצעות מעבד אולטרסוני במחזור עבודה (duty cycle) של 50%, אפשר לתאים להתקרר על קרח למשך 30 שניות.

לאחר מכן, חזרו על שלבי הסוניקציה והקירור פעמיים נוספות. תוך שמירה על הסספנסיות על קרח, הוסיפו 1 mL של תמיסה בריכוז 2 mg/mL.

סבבו את תמיסת המלאי של ה-DNA עם הליזט התאי בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, התאימו את ריכוז המלח הסופי ל-500 millimolar על ידי הוספה של 4 mL של נתרן כלוריד בריכוז 5 molar ל-36 mL של ליזט.

כדי להסיר את שאריות התאים, סבבב במרכז centrifuge במהירות של 10,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. העבר את העליון (supernatant) למבחנה נקייה. בנקודת זו, ניתן להשתמש במכסה (aliquot) של 20 µL כדי לנטר את יעילות הליזיס באמצעות סוניקציה.

על ג'ל SDS-PAGE. לאחר מכן, העתק התאים מועבר בעמודת עמילוז. כדי לטהר את חלבון היתוך MVP MGM 1 0 1, התחילו בהוספה של 1.5 מיליליטר של תמיחת (slurry) AMLO resin בריכוז 50% לפרוכת קונית של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, כדי להביאו למצב שיווי משקל, יש להוסיף 13 milliliters של lysis buffer ולסבב בצנטריפוגה ב-2000 times G למשך חמש דקות. יש לחזור על שטיפה זו ארבע פעמים נוספות, ולאחר מכן להחזיר את השרף לתליה ב-0.75 milliliters של lysis buffer. יש להוסיף את תגליפת ה-AMLO שהגיעה לשיווי משקל לליסאט התאים ולנער בעדינות ב-4 degrees Celsius למשך לילה.

ביום למחרת, טענו את תערובת הליסאט עם שרף האמילוז לתוך עמודת כרומטוגרפיה מסוג econo המותקנת בחדר קר. פתחו את הברז כדי לאפשר לחלבונים שאינם קשורים לעבור לשפופרת איסוף באמצעות סינון בכבידה. לאחר מכן, שטפו את שרף ה-AMLO על ידי הוספת 300 milliliters של בופר שטיפה ראשון.

לאחר שהנוזל עבר את העמודה, חזור על השטיפה עם 150 milliliters של wash buffer two. לאחר הוספת Ellucian buffer ואיסוף ה-EIT כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, קבע את התפוקה והטוהר של M-V-P-M-G-M 1 0 1 על ידי העמסת אליקוויטה של ה-EIT על ג'ל SDS page.

לאחר הרצת הג'ל בצעו צביעה ב-kumasi; אמורה להיות גלויה פס בודדת ומרכזית של כ-70 kilodaltons. הוסיפו 50 units של precision protease ל-M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs והניחו בתוך נבובת דיאליזה עם תמיסור דיאליזה. אפשרו לבקיעה להימשך במהלך הלילה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.

הריצו ג'ל SDS-PAGE כפי שנעשה קודם לכן. כדי להעריך את יעילות השבירה, שבירה מלאה אמורה להניב שני פסים של 42 ו-28 kilodaltons, המתאימים ל-MVP ול-MGM 1 0 1 בהתאמה. טענו את ה-MVP MGM 1 0 1 השבור באמצעות הזרקות מרובות למחליף bio scale mini macro prep high S המחובר למערכת BioRad biologic DUO flow FPLC.

התחילו את כרומטוגרפיית חילוף הקטיונים על ידי החלת מדרגת מלח (step salt gradient) של 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM ו-1000 mM של נתרן כלוריד. מדרגה זו נוצרת על ידי ערבוב של בופר A ובופר B. קבעו את קצב הזרימה ל-0.5 mL לדקה. אספו פרקציות של 2 mL לאספן פרקציות; בדרך כלל MGM 1 0 1 נשטף (elutes) בריכוז מלח של 500 mM.

יש לשלב את הפרקציות עבור שיאו של MGM 1 0 1 ולבדוק את טהרת החלבון על ג'ל SDS-PAGE. שיאו של MGM 1 0 1 אמור להראות פס בודד של כ-28 kilodaltons לאחר שילוב פרקציות החלבון מכרומטוגרפיית חילוף קטיונית ודיאלזה של החלבון בבופר שיווי משקל GF בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. לאחר מכן, יש להעביר את החלבון לעמודת סינון Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter ולסובב במהירות של 3000 ×g בטמפרטורה של 4°C כדי לרכז את החלבון.

לאחר שהנפח הופחת לכ-1 מיליליטר, טענו את MGM 1 0 1 לעמודה מסוג supra six prep grade מכוילת שהושוותה עם בופר הכרומטוגרפיה, והתחילו את הפרדת הגודל (size exclusion) עם בופר הכרומטוגרפיה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. חלבוני אוליגומרים גדולים נשטפים (elute) בפראקציות מוקדמות, בעוד שחלבונים קטנים נשטפים בפראקציות מאוחרות. טבעות MGM 1 0 1 נשטפות בערך ב-400 Kilodaltons.

אספו את הפראקציות של שיאי ה-MGM 1 0 1 המטוהרים באמצעות אספן פראקציות, וטענו מנות מהפראקציות לג'ל 12% SDS-PAGE כדי לבדוק את האיכות הסופית של החלבון. לאחר מכן, רכזו את החלבון באמצעות Aveva. סובבו שש פעמים בצנטריפוגה ב-3000 ×g בטמפרטורה של 4°C.

לאחר מכן, הקפיאו במהירות את המנות של החלבון בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה על ידי טבילתן בחנקן נוזלי למשך שתי דקות. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך שישה עד 12 חודשים. השתמשו בדגימות MGM 1 0 1 לבדיקת קישור של DNA גמיש (single stranded DNA) ולויזואליזציה מבנית באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת.

תוצאות בדיקת השifting של ניידות אלקטרופורטית מעידות כי ל-MGM 1 0 1 המופק יש פעילות קישור חזקה ל-DNA גדילית אחת. ה-DNA הגדילית אחת המשמש כגשש נשמר במידה גוברת בבארות של ג'ל פוליאקרילאמיד טבעי על ידי MGM 1 0 1 האוליגומרי.

כאשר M GM 1 0 1 מתווסף בריכוז גבוה מ-400 nanomolar. מיקרוגרפים אלקטרוניים אלו מראים את הארגון המבני מסדר גבוה של MGM 1 0 1. M GM 1 0 1 שהוכן זה עתה קיים כטבעות נפרדות בעלות קוטר של 20 nanometers, אותן ניתן להמחיש באמצעות מיקרוסקופיית תמסורת עם צביעה שלילית.

לאחר מספר שבועות של אחסון בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, MGM 1 0 1 יוצר פילמנטים ספירליים סופרא-מולקולריים. ברגע שתהיה שליטה בטכניקה זו, ניתן להשלימה בתוך שבוע אחד.

תודה לצפייה.