כותרות ביוכימית של גליקוגן במבחנה

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא טיטרציה של גליקוגן במבחנה בדגימות תאים. זה מושג על ידי ליזינג ראשון של התאים על ידי שיבוש מכני. השלב השני הוא הידרוליזה של הגליקוגן עם אלפא עמילאז כדי להשיג את הגלוקוז.

לאחר מכן, הגלוקוז מתחמצן ומייצר מין פלואורסצנטי. השלב האחרון הוא מדידת הקרינה. בסופו של דבר, טיטרציה ביוכימית של גליקוגן משמשת להצגת שינויים בתכולת הגליקוגן בתאים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא תחרותית, רגישה, מדויקת וספציפית מאוד. כדי להתחיל בהליך זה, תאי זרעים בריכוז של 0.5 עד 2 מיליון לצלחת בקוטר 100 מילימטר. דגרו על התאים למשך 24, 48 או 72 שעות בהיפוקסיה בתחנת עבודה אנאירובית המוגדרת ב-1% חמצן, 94% חנקן ו-5% פחמן דו חמצני.

במקביל, דגרו קבוצה נוספת של תאים בנורמוקסיה עבור כל מצב חמצן. החלף את המדיום המכיל גלוקוז של 25 מילי-מולרי כל 24 שעות כדי למזער שינויים בריכוז הגלוקוז במהלך הניסוי לאחר הטיפול. שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר עקבות של גלוקוז ממדיום התרבית.

לאחר מכן מגרדים את התאים בצנטריפוגה PBS קרה, תמיסת PBS ב -1000 סל"ד למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר הידרוליזה גליקוגן המתקבל מערכת בדיקת גליקוגן.

הרתיחו את הליזאט בחום של 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לנטרל את האנזימים. לאחר קירור הליזט לטמפרטורת החדר, מערבולת וצנטריפוגה. הליזאט פי 13,000.

כוח הכבידה למשך 10 דקות להסרת המוצרים הבלתי מסיסים. לאחר מכן הניחו בצד את הסופרנטנט כדי לנרמל את רמות הגליקוגן לתכולת החלבון בין הדגימות. כמת את החלבונים עם 25 עד 35 מיקרוליטר של הסופרנטנט באמצעות בדיקת חומצה bsic.

בעקבות תערובת זו, 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט מהשלבים הקודמים עם מיקרוליטר אחד של תערובת האנזים הידרוליזה. דוגרים את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ומניחים בצד להכנת תקן עקומת הכיול, מדללים את הערכה הסטנדרטית גליקוגן עם מאגר הידרוליזה כדי לתת ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 0, 4, 8, 12, 16 ו -20 מיקרוליטר מתוך 10 מיקרוגרם למיליליטר.

סטנדרטי לשישה צינורות נפרדים מדללים כל תקן עם מאגר הידרוליזה כדי לתת נפח סופי של 50 מיקרוליטר וריכוז גליקוגן של 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 ו-0.2 מיקרוגרם למיליליטר בהתאמה. הוסף מיקרוליטר אחד של תערובת אנזימי הידרוליזה לתקנים ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לכל מצב חמצן. סמן את השפופרת הראשונה כריכוז הגלוקוז החופשי ואת השפופרות שתיים ושלוש כריכוז הגלוקוז הכולל.

לאחר מכן הוסף 15 מיקרוליטר של הסופרנטנט המופק לצינור אחד ואחריו 35 מיקרוליטר של מאגר ההידרוליזה כדי לתת נפח סופי של 50 מיקרוליטר. הקרינה המתאימה לריכוז הגלוקוז החופשי תימדד מאוחר יותר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של הגליקוגן שעבר הידרוליזה לצינור שתיים והתאם לנפח סופי של 50 מיקרוליטר עם מאגר הידרוליזה.

כדי לשמור על ערכי הקרינה בריכוזי עקומת הכיול, הוסף שני מיקרוליטר של גליקוגן שעבר הידרוליזה לצינור שלוש והתאם לנפח סופי של 50 מיקרוליטר עם מאגר הידרוליזה. לאחר מכן, הכינו פתרון פיתוח לכל הדגימות והתקנים על ידי ערבוב של 48.7 מיקרוליטר של מאגר פיתוח, מיקרוליטר אחד של תערובת אנזימי פיתוח ו-0.3 מיקרוליטר של Oxy Redd Probe. עבור כל תקן דגימה, הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת זו לכל צינור ודגר בחושך למשך 30 דקות.

בטמפרטורת החדר למדידת הקרינה, הגדר את החריץ לשלושה ננומטר לעירור ופליטה, ולאחר מכן מדוד את הקרינה. ויסות אחסון הגליקוגן והיפוקסיה נחקר מכיוון שגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים. החישוב והסטנדרטיזציה של ריכוז הגליקוגן בתא בוצעו על הנתונים הגולמיים של הקרינה.

כפי שמוצג כאן מהמדידות הפלואורסצנטיות, חושב ריכוז הגלוקוז החופשי הכולל. באמצעות תוצאות אלה נקבעה כמות הגלוקוז הנגזרת מהגליקוגן. הבדיקה הביוכימית לגליקוגן אישרה כי האגרגטים צפופי האלקטרונים שנצפו במיקרוגרפים אלקטרוניים של תאי ccl 39 היו חלקיקי גליקוגן.

הצטברות גליקוגן והיפוקסיה תלויה בגורם השעתוק. גורם ראשון המעורר היפוקסיה, גורם השעתוק העיקרי המעורב בהסתגלות תאית להיפוקסיה בקווי תאים סרטניים ולא סרטניים שונים המאוחסנים בגליקוגן, יכול לעבור חילוף חומרים מהיר על ידי התא תוך פחות משש שעות. בנוסף, השימוש בגליקוגן מגן מפני מוות תאים בתנאים של רעב גלוקוז לאחר הליך זה.

כמו כן, ניתן לבצע שיטות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים וצביעה תקופתית של הסטת חומצה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו התפלגות הגליקוגן בתאים.