Name: כותרות ביוכימית של גליקוגן במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למד שיטה ביוכימית למדידת גליקוגן במבחנה באמצעות הידרוליזה לאנזים אלפא אמילאז ומדידת פלואורסצנציה. השיטה מאפשרת מעקב אחר שינויים בתכולת גליקוגן בתאים בצורה מדויקת ואמינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר טיירי Pourcher על שאפשר לנו להשתמש בספקטרומטר הקרינה ועל עזרתו. המעבדה ממומנת על ידי Ligue Nationale Contre le הסרטן (labellisée Equipe), האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le סרטן, המכון הלאומי du הסרטן (Inca), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר, METOXIA (תכנית האיחוד האירופי FP7), המרכז א Lacassagne, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique, Institut National de la סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale ואוניברסיטת ניס <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">(http://www.unice.fr/isdbc/).</a> אנו מודים לד&quot;ר M כריסטיאן Brahimi-הורן לקריאה ביקורתית ועריכת תיקון.

כותרות ביוכימית של גליקוגן 1. תמוגה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בריכוז של 0.5-2 x 10 6 לכל 100 צלחת בקוטר מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול: דגירה תאים 24, 48, או 72 שעות בריכוז הנמוך של חמצן (היפוקסיה) בתחנת באג-Box אנאירובי עבודה (הטכנולוגיה Biotrace Plc Ruskinn הבינלאומי, Bridgend, בריטניה) נקבעה על 1% או 0.1% O 2, 94% או 94.9% N 2, ו 5% CO 2. במקביל, תאי דגירה בnormoxia (21% O 2, CO 2 של 5%). שנה בינונית (מדיום המכיל גלוקוז 25 מ&quot;מ) בכל שעה 24 כדי למזער את השינויים בריכוז הגלוקוז בתקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפול, תאים לשטוף 2X עם PBS להסיר עקבות של גלוקוז ממדיום לתרבות. לגרד את התאים בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון ב1,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות, לבטל את supernatant לשטוף את הכדור פעם אחת עם PBS. גלולה יכולה להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך הלאה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור במים מזוקקים 100 μl. הוספה של גליקוגן הידרוליזה הצפת 100 μl מסופק עם גליקוגן ערכת Assay (Abcam). מרתיחים את lysate ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית אנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ו צנטריפוגות lysate ב13,000 סל&quot;ד 10 דקות כדי להסיר את המוצרים לא מסיסים. שמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל רמות הגליקוגן לתכולת החלבון בין דגימות, כימות של חלבונים ניתן לעשות עם 25-35 μl של supernatant באמצעות assay Bicinchoninic חומצה (BCA-Interchim). </li></ol> חלק מlysate ניתן להשתמש כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז החופשי בתוך התאים. 2. הידרוליזה של גליקוגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של supernatant (שלב 1) עם 1 μl של הידרוליזה אנזים המיקס. תערובת זו מכילה glucoamylase. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומת הכיול על ידי דילול גליקוגן הסטנדרטי (2 מ&quot;ג / מיליליטר) שלupplied עם הערכה לפתרון של 10 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר הידרוליזה. בשלב הבא, להכין שישה צינורות נפרדים עם 0, 4, 8, 12, 16, ו20 μl של 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטנדרטי ולהתאים את כל צינור לנפח סופי של μl 50 עם חיץ הידרוליזה לתת ריכוז של גליקוגן של 0, 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, ו0.2 מיקרוגרם / מיליליטר. הוסף 1 μl של הידרוליזה אנזים מיקס בסטנדרטים ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol> ריכוז הגלוקוז ברקע של הקו הסלולרי, שניתן על ידי ערך עבור ריכוז גלוקוז החופשי, זה חייב להיות מופחת הערך לריכוז המוחלט גלוקוז (גלוקוז מהידרוליזה גליקוגן + חופשי גלוקוז) כדי לקבוע את הרמה של גליקוגן בתאים. 3. פיתוח וקריאה של הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי, להכין צינור אחד (צינור 1) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז חופשי ושני צינורות (צינורות 2 ו -3) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז בסך הכל (כל שנינות צינורחה נפח שונה של גליקוגן שעבר הידרוליזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של supernatant שחולץ בסופו של שלב 1 בצינור 1. הוסף 35 μl של חיץ הידרוליזה כדי להשלים לנפח סופי של μl 50. הקרינה המתקבלת תיתן את הריכוז הגלוקוז בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה (שהושג בשלב 2) בצינור 2. להסתגל לנפח סופי של μl 50. נפח דגימה (X μl) צריך להיות מותאם על פי צפיפות תאים ו / או סוג תא על מנת לקבל ערכי הקרינה שאינם מעבר לריכוזים של עקומת הכיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה בצינור 3. להסתגל לנפח סופי של μl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיתוח לדגימות ולתקנים על ידי ערבוב לכל צינור 48.7 μl של פיתוח מאגר, μl 1 של פיתוח אנזים מיקס ו0.3 μl של OxiRed Probe (מסופק בערכת Assay גליקוגן). לדוגמא, עבור 2 תנאים, להכין תערובת לצינור 12s (6 לסטנדרטים, 2 לגלוקוז חופשי ו4 לסך הקרינה גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של תערובת זו על צינור אחד ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקרינה באורך גל עירור של 535 ננומטר, אורך גל פליטה של ​​587 ננומטר כפי שהומלץ, וחריץ של 3 ננומטר לעירור ופליטה. </li></ol>

<ol><li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li>
<li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li>
<li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li>
<li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+liver+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li>
<li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li>
<li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li>
<li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Fluorescent+glycogen%22+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li>
<li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DCH+%22Theory+and+practice+of+histotechnology%22">Theory and practice of histotechnology</a>. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).</li>
<li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Kokubyo+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

טיטרציה ביוכימית של גליקוגן במבחנה מאפשרת כימות מדויק של תוכן גליקוגן בתאים. השוואה לכמה טכניקות אחרות (PAS, immunofluorescence עם נוגדן גליקוגן, וכו &#39;.), טיטרציה זו היא ספציפית מאוד, רגישה ושחזור. יתר על כן, השיטה היא נוחה שכן הוא לא דורש רדיואקטיביות אבל ספקטרומטר הקרינה. עם זאת, טכניקה זו היא אך ורק כמוני ואינה מספקת מידע על חלוקת גליקוגן בתאים. הטכניקה המתוארת בכתב היד הזה מושגת על תמציו...

גליקוגן הוא פולימר multibranched של שאריות הגלוקוז, אשר שוהה בציטופלסמה של סוגי תאים רבים. זוהי אחת הצורות העיקריות של אחסון אנרגיה בתאים וממלא תפקיד חשוב בחילוף חומרים של הגלוקוז. רוב תאי היונקים מסוגלים לייצר וגליקוגן חנות, אשר יכול להיות מושפל במהירות לגלוקוז כדי לקדם את ייצור גליקוליזה ו-ATP בלחץ מטבולים. Hepatocytes לייצר כמויות מסיביות של גליקוגן כדי לווסת את רמת הסוכר בדם ובכך לספק אספקה ​​רציפה של גלוקוז בגוף. לעומת זאת, הריכוז של גליקוגן בתאים אחרים (שרירים, תאי דם אדומים, וכו &#39;) הוא נמוך יחסית. עם זאת, באופן מקומי, כמויות אלה מספיקות כדי לספק אנרגיה בטווח הקצר, כאשר התאים נחשפים פתאום לסביבה המקופחת של חומרים מזינים. סינתזה של גליקוגן ופירוק גליקוגן כדלקמן את אותם צעדים בכל הרקמות (איור 1). ראשית, גלוקוזנכנס לתאים על ידי מובילי גלוקוז (עודפים), ומומר במהירות מglucose-6-phosphate (G6P) לגלוקוז-1-פוספט (G1P) על ידי phosphoglucomutase. G1P הוא שונה אז לUDP-גלוקוז, וC1 הפחמן של UDP-גלוקוז מחובר לשאריות טירוזין של glycogenin, חלבון העיגון של גליקוגן. מולקולה זו, הנחשבת לפריימר הגליקוגן, הוארכה על ידי צירופה של UDP-גלוקוז לגלוקוז המסוף ידי α (1 → 4) איגרות חוב באמצעות synthase הגליקוגן. לבסוף, כאשר שרשרת ליניארית של מעל 11 שאריות הגלוקוז נוצר, אנזים ההסתעפות מעביר oligosaccharide מסוף היווה ידי מינימום של 6 שאריות גלוקוז לגלוקוז אחר של השרשרת סמוכה באמצעות הצמדת α (1 → 6). חזרה על התהליך הזה נותן מבנה פרקטלית מאסיבי המכיל ענפים היוצרים סליל עם 6.5 גלוקוז בכל תור. הגליקוגן יכול להיות reversely הידרוליזה לגלוקוז על ידי הפעולה מתואמתשל debranching אנזימים שhydrolyze α (1 → 6) מחויב וphosphorylase גליקוגן שhydrolyzes α (1 → 4) glycosidic כבול בין השאריות האחרונות של גלוקוז של סניף ומולקולת גליקוגן. תגובה זו נקראת &quot;גליקוגנוליסיס מופעלת על ידי הגדלת רמות של AMP (המשקף את צריכת ה-ATP), ומעוכבת על ידי גלוקוז ו-ATP 2,3. על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, מולקולות גליקוגן תוארו בסוגי תאים רבים חלקיקי β כבחינם (או monoparticles גליקוגן) של 15-30 ננומטר בקוטר. בסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes, ניתן להרכיב חלקיקי β למורכבים ליצירת רוזטות, הידוע גם בחלקיקים α המשתנות בקוטר מ 80 ננומטר עד למקסימום של 4 200 ננומטר </sup&gt;. דרך חלקיקי β אלה ערובה ליצירת צבירים גדולים יותר של חלקיקי α עדיין לא הובהרה במלואו. כמה ראיות נוטה להוכיח כי יכולים להיות קשורים חלקיקי β ידי מליטה קוולנטיים 5, מליטה מימן, או אפילו דרך אינטראקציות בין חלבונים 6. כמות הגליקוגן מאוחסן בתאים תלויים בפרמטרים רבים: (i) הסכום של glycogenin בתא שיוזם סינתזת הגליקוגן (ii) את הפעילות של synthase הגליקוגן וphosphorylase מוסדר על ידי זירחון חלבון / dephosphorylation; (שלישי) את הריכוז של גלוקוז בתאים, שהוא תלוי במספר פרמטרים כגון אספקת הגלוקוז ממערכת כלי הדם וספיגת הגלוקוז על ידי תאים. מאגרי הגליקוגן מוסדרים בחוזקה על ידי הרגולציה allosteric של הורמוני biosynthetic דרך מטבוליטים ביניים, על ידי הורמונים המסדירים את חילוף חומרים של אנרגיה, ועל ידי מסלולי איתות חישת מזין 7. חשוב להיותמסוגל לכמת גליקוגן בדגימות ביולוגיות כדי להבין את החשיבות של חילוף חומרים של הגליקוגן בגוף כולו והרמה תאית טוב יותר. אנו מתארים כאן ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה בassay חוץ גופית לגליקוגן. טכניקה זו מבוססת על הקרינה גלוקוז הכימות לפני ואחרי הידרוליזה ספציפית של גליקוגן. שיטות אחרות קיימות כדי להעריך את הרמה של גליקוגן בתאים, אבל רובם הם לא כמוני. אחת הטכניקות הראשונות שתוארו לכימות של גליקוגן בתאים התבסס על מדידת התאגדות [14 C]-גלוקוז לגליקוגן 8,9. השימוש בקרינה רדיואקטיבית עושה את התהליך הזה קשה יותר להתמודד אבל יש לו את היתרון של מתן שיעור התאגדות גלוקוז לגליקוגן ולהבחין בין ההפצה של שאריות הגלוקוז על הענפים החיצוניים ובליבה של המולקולה (זה גם דורש β-amyloly נוסףאחותי וצעד chromatographic). טכניקה נוספת שפותחה לאחרונה והוא מבוסס על השילוב של 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-י.ל.] אמינו}-2-deoxyglucose), נגזר 2-deoxyglucose ניאון, לגליקוגן 10. עוצמת הקרינה שנמדדה משקפת את כמות הגליקוגן מיוצרת וניתן למדוד עם קורא הקרינה. הפצה של הקרינה בתא גם יכולה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal. בין טכניקות nonquantitative האחרות, מכתים תקופתי חומצה שיף (PAS) הוא אולי הנפוץ ביותר. ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי של גליקוגן בתאים קבועים, קטעי רקמה בפרפין או קפואים. צבעי טכניקה היסטולוגית זה לא במיוחד סוכרים, glycolipids, גליקופרוטאינים, תאית וmucins הניטרלי בסגול. הסגוליות של בדיקה זו יכולה להיות מוגבר על ידי טיפול בתאים קבועים או חלקי רקמות עם diastase, שדווקא מעכל גליקוגן. לאחר מכן,רמת הגליקוגן ניתן לאמוד באופן איכותי על ידי השוואת דגימות unhydrolyzed (כל מקרומולקולות הפחמימות שונה) לדגימות שעברו הידרוליזה (פחמימות שונה מקרומולקולות מלבד גליקוגן). צביעת PAS וניתוח מיקרוסקופי, בניגוד למבחנים ביוכימיים של גליקוגן, מספק מידע בנוגע להפצה של גליקוגן בתאים, אשר יכול להיות מפוזרת או מרוכזת בחלק מסוים של התא. עם זאת, אף על פי שהבדלי הערכות צביעת PAS בהצטברות גליקוגן בין תנאים שונים, זה לא כמוני 11. נוגדן חד שבטי עכבר במקור נעשה באמצעות סחוס condylar mandibular כאנטיגן הוכח להגיב בגליקוגן בתאים ועם גליקוגן מטוהר במבחנה 12. כנוגדן זה דווקא מכיר בשרשרות סוכר הקשורות לגליקוגן, זה הוא כלי שימושי לזיהוי של הגליקוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באופן ספציפי יותר מאשר צביעת PAS. </p&gt; במיקרוסקופ אלקטרונים הוא טכניקה נוספת שמאפשרת הדמיה של דגנים של גליקוגן בתאים והערכה של מידת אחסון גליקוגן. למעשה, חלקיקי β גליקוגן הם קל לזיהוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים כגרגרים צפופים אלקטרון 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת גליקוגן</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>ספקטרומטר פלואורסצנטי</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

גליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בבעלי חיים בעלי חוליות וממלאים תפקיד מכריע בחילוף חומרים בגוף כולו, כמו גם בחילוף חומרים תאיים. שיטות רבות לאיתור גליקוגן כבר קיימות אבל רק מעטים הם כמוני. אנו מתארים כאן שיטת שימוש בערכת assay Abcam גליקוגן, אשר מבוססת על השפלה ספציפית של הגליקוגן לגלוקוז על ידי glucoamylase. גלוקוז אז במיוחד חמצון למוצר שמגיב עם חללית OxiRed לייצר הקרינה. כותרות היא מדויקות, רגישה ויכולות להיות מושגת על תמציות תא או חלקי רקמות. עם זאת, בניגוד לשיטות אחרות, זה לא נותן מידע על ההפצה של גליקוגן בתאים. כדוגמא לטכניקה זו, שאנו מתארים כאן טיטרציה של גליקוגן בשתי שורות תאים, CCL39 פיברובלסטים ריאות אוגר הסיני וLS174 קרצינומה של המעי הגס האנושי, מודגרות בnormoxia (O 21% 2) לעומת היפוקסיה (1% O 2). חוקרים שערנו כי היפוקסיה היא signal שמכין תאים לסנתז וגליקוגן חנות על מנת לשרוד 1.

רמה נמוכה של חמצן (היפוקסיה) באותות גידולים לתאי גידול את הצורך לאחסן אנרגיה כדי להתמודד עם דלדול מזין שלאחר מכן, כדי לשרוד. כגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים, שחקרנו את ויסות אחסון הגליקוגן בהיפוקסיה. החישוב וסטנדרטיזציה של הריכוז של גליקוגן בlysates התא חייב להתבצע על הנתונים הגולמיים של הקרינה כפי שמוצגים בלוחות 1, 2, ו -3. Assay ביוכימי לגליקוגן אישר כי אגרגטים האלקטרונים צפופים נצפו על micrographs אלקטרונים של תאי CCL3...

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא טיטרציה של גליקוגן במבחנה בדגימות תאים. זה מושג על ידי ליזינג ראשון של התאים על ידי שיבוש מכני. השלב השני הוא הידרוליזה של הגליקוגן עם אלפא עמילאז כדי להשיג את הגלוקוז.לאחר מכן, הגלוקוז מתחמצן ומייצר מין פלואורסצנטי. השלב האחרון הוא מדידת הקרינה. בסופו של דבר, טיטרציה ביוכימית של גליקוגן משמשת להצגת שינויים בתכולת הגליקוגן בתאים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא תחרותית, רגישה, מדויקת וספציפית מאוד. כדי להתחיל בהליך זה, תאי זרעים בריכוז של 0.5 עד 2 מיליון לצלחת בקוטר 100 מילימטר. דגרו על התאים למשך 24, 48 או 72 שעות בהיפוקסיה בתחנת עבודה אנאירובית המוגדרת ב-1% חמצן, 94% חנקן ו-5% פחמן דו חמצני.במקביל, דגרו קבוצה נוספת של תאים בנורמוקסיה עבור כל מצב חמצן. החלף את המדיום המכיל גלוקוז של 25 מילי-מולרי כל 24 שעות כדי למזער שינויים בריכוז הגלוקוז במהלך הניסוי לאחר הטיפול. שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר עקבות של גלוקוז ממדיום התרבית.לאחר מכן מגרדים את התאים בצנטריפוגה PBS קרה, תמיסת PBS ב -1000 סל"ד למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר הידרוליזה גליקוגן המתקבל מערכת בדיקת גליקוגן.הרתיחו את הליזאט בחום של 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לנטרל את האנזימים. לאחר קירור הליזט לטמפרטורת החדר, מערבולת וצנטריפוגה. הליזאט פי 13,000.כוח הכבידה למשך 10 דקות להסרת המוצרים הבלתי מסיסים. לאחר מכן הניחו בצד את הסופרנטנט כדי לנרמל את רמות הגליקוגן לתכולת החלבון בין הדגימות. כמת את החלבונים עם 25 עד 35 מיקרוליטר של הסופרנטנט באמצעות בדיקת חומצה bsic.בעקבות תערובת זו, 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט מהשלבים הקודמים עם מיקרוליטר אחד של תערובת האנזים הידרוליזה. דוגרים את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ומניחים בצד להכנת תקן עקומת הכיול, מדללים את הערכה הסטנדרטית גליקוגן עם מאגר הידרוליזה כדי לתת ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 0, 4, 8, 12, 16 ו -20 מיקרוליטר מתוך 10 מיקרוגרם למיליליטר.סטנדרטי לשישה צינורות נפרדים מדללים כל תקן עם מאגר הידרוליזה כדי לתת נפח סופי של 50 מיקרוליטר וריכוז גליקוגן של 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 ו-0.2 מיקרוגרם למיליליטר בהתאמה. הוסף מיקרוליטר אחד של תערובת אנזימי הידרוליזה לתקנים ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לכל מצב חמצן. סמן את השפופרת הראשונה כריכוז הגלוקוז החופשי ואת השפופרות שתיים ושלוש כריכוז הגלוקוז הכולל.לאחר מכן הוסף 15 מיקרוליטר של הסופרנטנט המופק לצינור אחד ואחריו 35 מיקרוליטר של מאגר ההידרוליזה כדי לתת נפח סופי של 50 מיקרוליטר. הקרינה המתאימה לריכוז הגלוקוז החופשי תימדד מאוחר יותר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של הגליקוגן שעבר הידרוליזה לצינור שתיים והתאם לנפח סופי של 50 מיקרוליטר עם מאגר הידרוליזה.כדי לשמור על ערכי הקרינה בריכוזי עקומת הכיול, הוסף שני מיקרוליטר של גליקוגן שעבר הידרוליזה לצינור שלוש והתאם לנפח סופי של 50 מיקרוליטר עם מאגר הידרוליזה. לאחר מכן, הכינו פתרון פיתוח לכל הדגימות והתקנים על ידי ערבוב של 48.7 מיקרוליטר של מאגר פיתוח, מיקרוליטר אחד של תערובת אנזימי פיתוח ו-0.3 מיקרוליטר של Oxy Redd Probe. עבור כל תקן דגימה, הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת זו לכל צינור ודגר בחושך למשך 30 דקות.בטמפרטורת החדר למדידת הקרינה, הגדר את החריץ לשלושה ננומטר לעירור ופליטה, ולאחר מכן מדוד את הקרינה. ויסות אחסון הגליקוגן והיפוקסיה נחקר מכיוון שגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים. החישוב והסטנדרטיזציה של ריכוז הגליקוגן בתא בוצעו על הנתונים הגולמיים של הקרינה.כפי שמוצג כאן מהמדידות הפלואורסצנטיות, חושב ריכוז הגלוקוז החופשי הכולל. באמצעות תוצאות אלה נקבעה כמות הגלוקוז הנגזרת מהגליקוגן. הבדיקה הביוכימית לגליקוגן אישרה כי האגרגטים צפופי האלקטרונים שנצפו במיקרוגרפים אלקטרוניים של תאי ccl 39 היו חלקיקי גליקוגן.הצטברות גליקוגן והיפוקסיה תלויה בגורם השעתוק. גורם ראשון המעורר היפוקסיה, גורם השעתוק העיקרי המעורב בהסתגלות תאית להיפוקסיה בקווי תאים סרטניים ולא סרטניים שונים המאוחסנים בגליקוגן, יכול לעבור חילוף חומרים מהיר על ידי התא תוך פחות משש שעות. בנוסף, השימוש בגליקוגן מגן מפני מוות תאים בתנאים של רעב גלוקוז לאחר הליך זה.כמו כן, ניתן לבצע שיטות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים וצביעה תקופתית של הסטת חומצה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו התפלגות הגליקוגן בתאים.

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר בדיקה ספקטרופוטומטרית להערכת פעילות גליקוגן סינתאז. השיטה מסתמכת על ירידה בספיגת NADH עם הזמן ומצביעה על פעילות גליקוגן סינתאז.

בדיקה ספקטרופוטומטרית לקביעת פעילות גליקוגן סינתאז

בסרטון זה אנו מתארים בדיקה ספקטרופוטומטרית איכותית כדי לקבוע את מידת ההסתעפות בדגימת גליקוגן בעלת מבנה לא מאופיין. השוואת מקסימום הספיגה של המדגם הלא מאופיין לזה של פוליסכרידים עם מבנים מסועפים ידועים מצביעה על נוכחות של הסתעפות במדגם הלא מאופיין.

בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

צביעת חומצה שיף תקופתית היא טכניקה המדמה את תכולת הפוליסכריד של רקמות. מאמר זה מדגים פרוטוקול צביעת חומצה שיף תקופתי המותאם לשימוש בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי מטוהרים מדם ורידי אנושי. דגימות כאלה מועשרות עבור לימפוציטים ותאי דם לבנים אחרים של מערכת החיסון.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.

מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

בדיקת רקמת בעלי החיים משתמשת בזיהוי נצנוץ גרעיני כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית של גליקוגן סינתאז על ידי מדידת השילוב של גלוקוז מסומן רדיו בגליקוגן.

הערכה רדיוכימית של פעילות אנזים גליקוגן סינתאז ברקמות בעלי חיים

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה חלופית לזיהוי titering של וירוסים באמצעות זיהוי אנטיגן האנזימטית טכניקה המכונה assay אימונו. כאן, אנו יראה לכם כיצד לאסוף דגימות ויראליות שלך, להכין את התאים לבדיקה, ולבסוף assay באמצעות אימונו דילולים סדרתי כדי לקבוע את titer ויראלי.

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.

החדר דג הזברה המוח Injection

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

למד שיטה ביוכימית למדידת גליקוגן במבחנה באמצעות הידרוליזה לאנזים אלפא אמילאז ומדידת פלואורסצנציה. השיטה מאפשרת מעקב אחר שינויים בתכולת גליקוגן בתאים בצורה מדויקת ואמינה.

כותרות ביוכימית של גליקוגן

גלה סרטונים נוספים