Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להבחין בין זנים עמידים למתיצילין או MRSA ורגישים למתיצילין, או MSSA של סטפילוקוקוס זהוב על ידי פאג' חיידקים ליטיים אנטי-מותאמים במיוחד. כאשר חיידקים מחוברים לזנבות הארוכים והגמישים של הפאג' הליטי, המרחק בין התאים המחוברים למשטח החיישן גדול יותר מחדירת הגל האקוסטי של ה-QC m. לכן, האות של אירוע הכריכה אינו נוצר.

החלפת הפאג' השלם בספרואיד מביאה לפאג'ים מתפקדים לחלוטין עם זנבות קצרים, הקושרים את החיידקים בעומק החדירה של הגל האקוסטי של ה-QC m, ובכך תורמים לשינויי התדירות והפיזור כאשר סטרואידים של פאג'ים מופקדים על גביש A-Q-C-M-D ונחשפים לתרחיף החיידקים המעורב, הם קושרים את זני ה-MRSA וה-MSSA של סטפילוקוקוס זהוב, אבל לא חיידקים אחרים שמפרידים את הסטפילוקוקוס הזהוב מהחיידקים האחרים על פני הגביש. לבסוף, כאשר מוסיפים PPP ספציפי ל-Mr.RSA שני חרוזים קשורים לנוגדנים A, נוצר אות בנוכחות זני Mr.RSA של סטפילוקוקוס זהוב. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת כגון PCR הם ששיטה זו אינה דורשת מיצוי DNA ואינה רגישה לאמפיריות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סינון וחיטוי של סטפילוקוקוס אורוס, ניתן ליישם אותה גם על חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שייצור חיישנים ביולוגיים דורש דיוק, דיוק וסבלנות. התחל בניקוי חתיכות קוורץ מקודדות זהב על ידי תחריט פלזמה בארגון למשך 10 דקות, ולאחר מכן עקר את החלקים במשך שש שעות באור UV בארון סטרילי לאחר עיקור ב-50 מיקרוליטר של תרחיף פאג'ים למשטח הזהב של כל חתיכה בצלחת פטרי סטרילית, ולאחר מכן דגר את החלקים למשך הלילה בתא לח בטמפרטורת החדר למחרת בבוקר, הסר את מתלה הפאג'ים הנותר לצורך טיטרינג, ולאחר מכן שטוף כל חתיכת קוורץ עם פאג' קשור חמש פעמים עם PBS כדי להסיר כל פאג' לא קשור.

כדי לבדוק את זיהום הפאג'ים המשותק על משטח יבש, תחילה יש לפזר תרבית לילה של סטפילוקוקוס זהוב על NZY eRate ולאפשר לתרחיף להתייבש. לאחר מכן הניחו חתיכת קוורץ מצופה זהב עם פאג' משותק עם הפנים כלפי מטה על הצלחת. לאחר 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ניתן לצפות באזור ליזה המעיד על זיהום כדי לבדוק את הפעילות הליטית של פאג' חופשי בנוזל.

ראשית, הוסף תרבית חיידקים למשך הלילה של סטפילוקוקוס זהוב ל-10 מיליליטר של NZY בכל אחת מארבע צלוחיות זרוע צד של 300 מיליליטר. לאחר מכן הוסף פעמיים 10 לששת ה-PFU למיליליטר של פאג' חופשי לשניים מהצלוחיות. כעת, עקוב אחר מהלך הזמן של ליזיס תאי סטפילוקוקוס למשך 570 דקות על ידי מדידת צפיפות אופטית במרווחים של 30 דקות עבור כל בקבוק תוך ביצוע מדידה סופית לאחר 24 שעות.

כדי לבחון את הפעילות הליטית של פאג' קשור בנוזל, חזור על השלבים שהודגמו זה עתה, אך הוסף חתיכות זהב עם פאג' קשור לצלוחיות הניסוי במקום פאג' חופשי. להכנת סטרואידים של פאג'ים יש לשלב תחילה 400 מיקרוליטר של תרחיף פאג' 1 2600 עם נפח שווה של ספקטרום כלורופורם בדרגה פוטומטרית לבקבוקון של מיליליטר אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מערבל בעדינות את תרחיף הכלורופורם של הפאג' חמש עד שש פעמים במרווחים של חמש שניות במשך דקה אחת.

לאחר מתן אפשרות לתרחיף להתייצב למשך 30 שניות, אסוף את החלק העליון המכיל את תרחיף הסטרואידים. העבירו כמה מיקרוליטרים של תרחיף הסטרואידים לבקבוקון של 500 מיקרוליטר לשידור וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. שמור את תרחיף הסטרואידים הנותר בבקבוקון של מיליליטר אחד לייצור חיישנים ביולוגיים.

כדי להכין תחילה את החיישן הביולוגי, נקה את חיישני ה-QCMD על ידי תחריט פלזמה בארגון למשך 10 דקות במנקה פלזמה. לאחר מכן שטפו את החיישנים בהקסאן כדי להסיר זיהומים אורגניים. לאחר מכן, נקה שוקת של איזון הסרט כפי שתואר בעבר על ידי אולסון אטל בכתב העת לשיטות מיקרוביולוגיות.

על ידי מילוי שוקת LB בתמיסת תת פאזה וניקויה עם מחסום שוקת. לאחר מכן מייצבים את השוקת על 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כעת צור חד-שכבת פאג' על תמיסת תת-הפאזה LB על ידי טפטוף בזהירות של 300 מיקרוליטר Eloqua של תרחיף מימי פאג' 1 2600 שנעשה מוט זכוכית אכיל נוטה השקוע בחלקו בשלב SOPH לאחר שאפשר לשכבה החד-שכבתית להתייצב במשך 10 דקות, דחוס את החד-שכבתי בקצב של 30 מילימטרים לדקה עד להשגת לחץ קבוע של 19 ניוטון למטר.

תצהיר הסרט האנכי הוא החלק המסובך ביותר בהליך זה. כדי להבטיח הצלחה, יש לוודא שכל מרכיבי הליך זה נקיים וגם יש לייעל את פרמטרי התצהיר החד-שכבתי. כעת טבלו את החיישן פנימה והחוצה מהחד-שכבתי שבע פעמים ברציפות בקצב של 4.5 מילימטרים לדקה כדי לבצע תצהיר סרט אנכי.

על חיישן ה-QCMD הממוקם בניצב. שקיעת סרט אנכית קושרת את הפאג' השלם למשטח החיישן הביולוגי. לבסוף, השתמש בחיישנים ביולוגיים של פאג'ים מפוברקים לזיהוי MRSA מיקרוסקופ אלקטרונים ואופטומטריה של הפאג' החופשי והקשור כאחד.

התחל שלב זה על ידי קביעת קווי בסיס, תדר תהודה ופיזור אנרגיה של חיישן QCM במים באמצעות תוכנת qof T. לאחר כ-30 דקות, צייר תרחיף של תאי חיידקים חיים רגישים למתיצילין או MSSA במים דרך תא הבדיקה. הקו הכחול מציג את ערך התדר ואילו הקו האדום מדגים את רמת פיזור האנרגיה.

הקווים האופקיים מראים את הקמת קו הבסיס. המספר שתיים באמצע המסך מציין שאירועים קשורים לחיישן. מספר שתיים מתוך ארבע עוקבות באופן רציף אחר השינויים בתדר התהודה ופיזור האנרגיה של החיישנים עבור הצליל העילי הראשון המוצג.

להלן השינויים לאחר שחיידקים עוברים את תא הבדיקה. שימו לב שלוקח רק כמה שניות עד שהתדר יורד ופיזור האנרגיה גדל כאשר השינויים בתדר התהודה של החיישנים ופיזור האנרגיה הפנימי מגיעים לרמות רוויה בהשעיה של מהירויות לטקס מצומדות של נוגדני PVP לזרימה וממשיכים בניטור רציף של פיזור התדרים. מוצג כאן כל תהליך הזיהוי המראה את הקמת קווי הבסיס, השינוי השני הבודד בתדירות ופיזור האנרגיה לאחר הוספת חיידקים, הרוויה, ולבסוף, השינויים לאחר הוספת חרוזים.

טבלה זו מציגה את הפעילות הליטית של הפאג'ים המודגמת כנגד כל הזנים שנבדקו של S reus, כולל זני MRSA כפי שמצוין במבחן נקודת הפאג'ים. גדלי הפלאק נעו בדרך כלל בין חמישה ל-15 מילימטרים. לא נמצאה פעילות נגד תרביות בדיקה אחרות.

כאן, הצמיחה הנורמלית של סטפילוקוקוס Urus A TCC 1 2600 במדיום NZ Y על אינקובטור שייקר ב-37 מעלות צלזיוס מודגמת כאשר מספר החיידקים גדל מ-3.2 כפול 10 ל-6 עד 4.0 כפול 10 ל-8 CFU למיליליטר. תוך כ-24 שעות, פאג' משותק על משטח זהב הפגין פעילות ליטית דומה לפעילות הפאג' בתרחיף. הפאג' המשותק נשאר מדבק בזיהום חיידקי טרי גם לאחר שימוש בניסוי גידול של 24 שעות, מספר שטיפות ואחסון ב-PBS במשך שישה ימים בארבע מעלות צלזיוס.

בתמונה זו, ניתן לראות את הליזוזום סביב פיסת הזהב המצביע על כך שהפאג'ים המשותקים מסוגלים לליז תאי חיידקים. לכן, כפי שמודגם כאן, הירידה האפקטיבית של צמיחת החיידקים שנמצאת בתרבית משותפת של חיידקים ופאג'ים משוחררים היא תוצאה של האינטראקציה הראשונית של חיידקים מרחפים במים ופאג'ים קשורים. כאן, שידור וסריקה של מיקרוגרפי אלקטרונים של הפאג' הליטי השלם 1 2600 על משטח מצע זהב מוצגים כאשר תרחיף הפאג' נתון לטיפול בכלורופורם, זנב הפאג מתכווץ באורכו ומתעבה והראש המצולע הופך מעוגל או סטרואידי.

למרות השינויים המבניים המשמעותיים. הפעילות הליטית של הסטרואידים כפי שנמדדה על ידי מספרי הפלאק לא השתנתה כתוצאה מהטיפול בכלורופורם. חיישני QCM עם פאג'ים ליטיים משותקים לא הראו שינויים משמעותיים בתדר התהודה או בפיזור האנרגיה כאשר הם נחשפו ל-MRSA, מה שמצביע על כך שהאינטראקציה של פאג'ים MRSA הביאה לשינוי מסת שם.

עם זאת, על פי ה-QCM, מיקרוגרפי האלקטרונים של חיישנים ביולוגיים לאחר הבדיקה חשפו קשירה חיידקית משמעותית על פני החיישן. כאשר הוזרקו תרחיפי MRSA לתא הזרימה עם חיישנים ביולוגיים של סטרואידים פאג'ים, נצפתה ירידה משמעותית בתדירות ועלייה בפיזור. בעקבות אינטראקציות קשירת MRSA חיידקיות של פאג'ים ספרו, חיישני הבדיקה נחשפו למתלי מהירות לטקס מצומדים של BBP שני נוגדנים A.

חיישנים ביולוגיים אלה של בדיקת MRSA הגיבו למתלי מהירות לטקס מצומדים של BPP שני נוגדני A כנצפו ירידה נוספת בתדירות ועלייה בפיזור. קשירת ה-MSA לבדיקות פאג'ים ומהירויות לטקס מצומדות של נוגדן PPP שני A אושרה באמצעות חקירות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. כאשר החיישן הביולוגי של סטרואיד הפאג'ים נחשף ל-MSSA, ירידה משמעותית בתדירות ועלייה בפיזור נצפתה בעקבות אינטראקציות קשירת MSSA של סטרואידים פאג'ים, חיישני הבדיקה אותגרו עם מתלי מהירות לטקס מצומדים PPP שני נוגדנים A.

בתחילה, החיישן הביולוגי של בדיקת MSSA הראה חולף קצר של עלייה בתדירות וירידה בפיזור לאחר מספר דקות של MSSA ו-PPP שני נוגדנים מצומדים לטקס מזרזים אינטראקציות. עם זאת, התדר חזר לרמות החדרת נוגדנים A לאחר PVP, אך אנרגיית ה-deci גדלה. לאחר מכן נותחה הקישור של MSSA לבדיקות פאג'ים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אך לא נצפתה כאן קשירה בין MSSA ל-PPP שתי מהירויות לטקס מצומדות של נוגדנים, פרופיל עובי סימטרי של אליפס ומפת עובי תלת מימדית של פאג' ליטי.

קו על פני מפת העובי שורטט כדי ליצור את פרופיל העובי. תמונות אחרונות אלה מציגות תמונות מייצגות של מצלמה אופטית CCD של MRSA שצולמו על ידי פאג'ים הקשורים למשטח הזהב של חיישן A-Q-C-M-D ופרופילי עוצמה תלת מימדיים של MRSA על מצעי זכוכית משותקים של פאג'ים בריכוז של 10 עד שמונה CFU למיליליטר ו-10 עד תשעה CFU למיליליטר. כל עיגול עגול מייצג חיידק יחיד.

ברור שהעלייה בריכוז החיידקים בתרחיף נוזלי מ-10 ל-8 CFU למיליליטר ל-10 ל-9 CFU למיליליטר מביאה לעלייה משמעותית של חיידקים שנלכדו בפרופילי העוצמה התלת-ממדיים. מספר הפסגות הלבנות בשכבה העליונה פרופורציונלי למספר החיידקים שנלכדו, וכצפוי, צפיפות הפסגות עולה משמעותית כאשר החשיפה של החיידקים גדלה מ-10 לשמונה ל-10 לתשעה יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. השכבה הכחולה הכהה התחתונה תואמת את שכבת הפאג'ים במגע עם מצע זהב.

ככל שיותר חיידקים נלכדים, התכונות האופטיות של הפאג'ים משתנות כשהם קושרים חיידקים וכתוצאה מכך צבע כחול כהה יותר עז יותר. בעקבות הליך זה, אנו יכולים להגדיר יעילות לכידת חיידקים על מנת להבין את האינטראקציות של חיידקי הפאג'ים לאחר ההתפתחות. טכניקה זו מראה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול בפאג'ים בחיידקים לחקור עיכוב פתוגנים בבעלי חיים ובבני אדם אל תשכח שעבודה עם ממיסים אורגניים בחיידקים פתוגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וחשוב מאוד לעקוב אחר הרגולציה הקפדנית.