Name: חוכמת חלבון: Workbench ל בסיליקון דה נובו עיצוב של ביומולקולות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למד עיצוב חלבונים חישובי באמצעות כלי Protein WISDOM לשיפור יציבות ואפיניות קישור. שיטה זו מאפשרת למחקרים לפתח חלבונים מונומריים וקומפלקסים ליישומים ביוטכנולוגיים ורפואיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CAF מודה בהכרת תודה על תמיכתם של NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736), והסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב, EPA (R 832721-010). חלק ממחקר זה התאפשר בתמיכת הממשלה על ידי משרד ההגנה, משרד המחקר המדעי של חיל האוויר. JS מודה בהכרת תודה על תמיכת ה-NIH (P50GM071508-06). MLBP מודה בהכרת תודה על תמיכתה במלגת בוגרי מדע והנדסה להגנה לאומית (NDSEG), 32 CFR 168a. GAK מודה בהכרת תודה על התמיכה ממלגת מחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע תחת מספר מענק DGE-1148900.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מסגרת תכנון החלבון דה נובו מורכבת משני שלבים, שלב בחירת רצף ושלב אימות. המסגרת חזקה מספיק כדי להתמודד עם תבניות עיצוב קשיחות וגמישות, וניתן ליישם אותה על עיצוב חלבון יחיד או עיצוב חלבון מורכב. המסגרת יושמה בהצלחה על מערכות חלבון רבות עם יישומים לעשרות מחלות. מספר עיצובים אומתו בניסוי, ומספקים את המעכבים או האגוניסטים החזקים ביותר של כמה חלבונים שהתגלו עד כה. מסגרת זו זמינה כעת לקהילה האקדמית באמצעות Protein WISDOM.
ישנם שלושה שלבים קריטיים בשיטה. הראשון הוא שלב בחירת הרצף, המשתמש בטכנ...

עיצוב חלבון דה נובו הוא זיהוי רצפי חלבונים שיניבו מבנה שלישוני רצוי עם תכונות או תפקוד משופרים. מכיוון שהקפל המקורי של חלבון הוא הקונפורמציה שנמצאת במינימום האנרגיה החופשית, תכנון חלבון דה נובו מחפש רצפים שיהיו להם מינימום אנרגיה חופשית בקפל המטרה. בעיה זו תוארה לראשונה על ידי דרקסלר1 ופאבו2 וכונתה "בעיית הקיפול ההפוך". עם זאת, בניגוד לבעיית קיפול החלבון, שבה רצף יכול להניב רק פתרון מבנה מקופל אחד, בעיית תכנון החלבון דה נובו מציגה ניוון. רצפי חומצות אמינו רבים ושונים יכולים להניב את אותו מבנה ותפקוד שלישוני.
בעוד שתכנון חלבונים בוצע באופן מסורתי באופן ניסיוני באמצעות תכנון רציונלי ואבולוציה מכוונת, שיטות חישוביות שימשו לאחרונה כדי להתגבר על מרחב החיפוש המוגבל הטמון בשיטות ניסוי. נעשה שימוש במגוון שיטות חישוביות, כולל שיטות דטרמיניסטיות, שיטות סטוכסטיות ושיטות הסתברותיות. 3,4 שיטות חישוביות מוקדמות השתמשו בתבניות עמוד שדרה קבועות כדי להקל על פתרון הבעיה. 5-7 עם הופעתם של מעבדים מהירים יותר, מחשוב בעל ביצועים עיליים ואלגוריתמים יעילים יותר, גמישות עמוד השדרה שולבה על ידי שימוש באנסמבל של תבניות עמוד שדרה קבועות8-14 או על ידי שילוב גמישות עמוד שדרה אמיתית על ידי ביטוי התבנית במונחים של טווחים של מרחקים מאטום לאטום וזוויות דיהדרליות. 15,16
מאמר זה מתאר בפירוט את Protein WISDOM, כלי מקוון שהפך לזמין לקהילה האקדמית כדי להשתמש במסגרת עיצוב החלבון החישובי דה נובו שלנו. מסגרת זו יושמה על תכנון חלבונים רבים, לשימוש טיפולי המכוון למחלות כגון HIV, סרטן, מחלות משלימות והפרעות אוטואימוניות אחרות. רבים מהפפטידים החזויים אומתו בניסוי, מה שמדגים את כוחה של השיטה. טבלה 1 מספקת סיכום של החלבונים השונים שתוכננו, כולל גודל החלבון או הפפטיד, מספר התחזיות ואימות ניסיוני.
<גבול טבלה="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>עיצוב חלבון</td>
			<td>אורך החלבון</td>
			<td># של תחזיות חישוביות</td>
			<td># של ולידציות ניסיוניות</td>
			<td>הפניה</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עיצוב רצף מלא של בטא-דפנסין-2 אנושי</td>
			<td>41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי קומפסטטין של C3 אנושי</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אנלוגים של קומפסטין הנקשרים לחולדה C3c</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אנלוגים של קומפסטטין עם סיומת די-סרין</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מבנה מייצב של אנלוגי קומפסטטין W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אגוניסטים ואנטגוניסטים של קולטן C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אגוניסטים ואנטגוניסטים לקולטן C5a</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי HIV-1 gp14</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי HIV-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי Bak של Bcl-x L ו-Bcl-2</td>
			<td>16-18</td>
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי LSD1 ו-LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>41</td>
			<td>17/20</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מעכבי PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. סיכום של חלבונים ופפטידים מעוצבים באמצעות מסגרת עיצוב החלבון דה נובו. # התחזיות החישוביות מוצג כמספר התחזיות החיוביות (כלומר ספציפיות קיפול מעל חתך מסוים או זיקות קשירה משוערות גדולות מהרצף המקורי). # האימות הניסיוני נותן שני מספרים: הראשון הוא מספר התחזיות שאומתו בניסוי ואילו השני הוא המספר הכולל של התחזיות שנבדקו בניסוי.
תכנון של אדם-בטא-דפנסין-2 (hβD-2) בוצע כדי לשפר את התכונה האנטי-מיקרוביאלית של הפפטיד. 17 עבור תכנון זה, שקלנו שני מקרים: 1) עד 10 מוטציות לאורך hβD-2 ו-2) תכנון רצף מלא של כל מיקומי שאריות hβD-2 למעט הציסטאין (8, 15, 20, 30, 37 ו-38). שלוש תבניות עיצוב שונות ושלושה מודלים שונים לבחירת רצפים שימשו בעיצוב. רמות גבוהות של דמיון במוטציות נצפו בין מודלים של ממוצע משוקלל וסל מרחק הן עבור עיצוב 10 המוטציות והן עבור עיצוב הרצף המלא. בנוסף, נמצא כי למספר רב של רצפים יש ערכי ספציפיות קיפול מחושבים חיוביים יותר מאשר הרצף המקורי.
מעכבי מערכת המשלים (של C3, C3a ו-C5a) תוכננו להילחם במספר מחלות חיסוניות כגון שבץ מוחי, התקף לב, מחלת אלצהיימר, אסטמה, דלקת מפרקים שגרונית, דחיית השתלת זרים, מחלות נשימה במבוגרים, פסוריאזיס ומחלת קרוהן. שלושה מעכבי קומפסטטין של C3c שנחזו על ידי מסגרת תכנון החלבון בתוספת שלושה רצפים שתוכננו באופן רציונלי אומתו בניסוי כקושרים טובים יותר מהקומפסטין המקורי. 18,19
מחקרים נוספים בחנו את אובדן הפעילות של קומסטטין כנגד C3c שאינו פרימט ותכננו מספר מעכבי C3c מועמדים לחולדות ועכברים. חמישה רצפים הוכחו כבעלי אנרגיות חופשיות יותר עם C3c של חולדות מאשר מוטנט הקומפסטין W4A9 הידוע כמעכב C3c. זאת בשל היווצרות גשר מלח חדש על ידי Arg1. 20 שמונה רצפים עם סיומת N-terminal נחזו להיות קלסרים טובים יותר מ-W4A9 עם סיומת di-Serine. לבסוף, 18 רצפי קומפסטטין נחזו לייצב את הקונפורמציה הקשורה של W4A9, ולספק מועמדים חזקים למעכבי C3c פרימטים ולא פרימטים.
בנוסף למעכבי C3c, אגוניסטים ואנטגוניסטים של קולטני C3a ו-C5a תוכננו על בסיס המבנים של C3a ו-C5a. שבעה רצפי C3a שנחזו על ידי המודל נבדקו בניסוי. שניים מהרצפים היו אגוניסטים חזקים בעוד ששניים אחרים היו אגוניסטים חלקיים. 21 שני האגוניסטים החזקים הראו שיפור של פי 58 לעומת "סופראגוניסט" שהתגלה בעבר. העיצוב של אגוניסטים ואנטגוניסטים לקולטן C5a סיפק קבוצה של 61 רצפים. כל הרצפים סונתזו ושניים נמצאו כאגוניסטים חדשים של C5a.
מעכבי היתוך של HIV-1, הנגיף הגורם לאיידס, תוכננו למנוע מ-HIV-1 להדביק תאים. העיצוב הראשון התמקד ב-gp41, גליקופרוטאין מעטפת של HIV-1. מסגרת תכנון החלבון ניבאה שישה רצפים שהיו קושרים טובים יותר מהרצף המקורי. ארבעה מהרצפים החזויים הללו אומתו בניסוי כמעכבים HIV-1 כאשר הרצף הטוב ביותר היה בעל IC50 נמוך עד 29 מיקרומטר. רצף זה הראה שיפור של פי 3-15 לעומת הרצף המקורי ולא היה לו אובדן פעילות נגד זן וירוס עמיד ל-Enfuvirtide. 22 העיצוב השני התמקד ב-gp120, גליקופרוטאין מעטפת נוסף של HIV-1. ארבעה עשר רצפים נחזו להיות קושרים של gp120 ולספק מעכבי היתוך פוטנציאליים נוספים של HIV-1.
חלבונים רבים הקשורים לסרטן סיפקו מטרות מבטיחות לטיפולים בסרטן. Bcl-2 ו-Bcl-xL הם חלבונים אנטי-אפופטוטיים המונעים מוות של תאים. מעכבים של שני חלבונים אלה נועדו לגרום למוות של תאים בתאים סרטניים. עשרה רצפים נחזו להיות קושרים טובים יותר מהילידים, ותוצאות אלה תפסו תוצאות ניסויים ומוטגנזה קודמות. 23 חלבון מטרה נוסף, ERK2, מעורב במפלי העברת אותות שהופכים אותו למטרה מבטיחה לטיפולים אנטי-פרוליפרטיביים לסרטן. עשרים וחמישה רצפים נחזו כמעכבים של ERK2.
Histone methyltransferases ו-demethylases שולטים באופן דינמי במתילציה של היסטון, אשר נקשרה לסוגי סרטן רבים כולל ערמונית, שד, לימפומה, מיאלומה, שלפוחית השתן, המעי הגס, העור, הכבד, רירית הרחם, הריאות והקיבה. מסגרת תכנון החלבון דה נובו זיהתה 17 מעכבים של EZH2 (ליזין מתילטרנספראז) ומתוך עשרה שנבדקו בניסוי, כולם נמצאו כמעכבים EZH2. 24 לפפטיד החזק ביותר היה IC50 של כ-13 מיקרומטר, היה יעיל באותה מידה עם ריכוזי אנזימים גבוהים, ולא התחרה בקופקטור. פפטידים אלה היו הקבוצה הראשונה של מעכבי EZH2. 53 מעכבים של LSD1 (דמתילאז) נחזו על ידי המסגרת ומתוך 20 שנבדקו בניסוי, 17 היו מעכבים של LSD1 ו-18 היו מעכבים של LSD2. למעכבים הטובים ביותר היו ערכי IC50 מתחת ל-1 מיקרומטר, מה שהופך אותם למעכבים הפפטידיים החזקים ביותר שהתגלו עד כה.
שתי מערכות החלבון האחרונות סיפקו מטרות לטיפול במחלות אוטואימוניות שונות כגון מחלת צליאק, סוכרת מסוג 1, זאבת אדמנתית מערכתית, תסמונת סיוגרן, תסמונת צ'ורג-שטראוס, בלוטת התריס של השימוטו, מחלת גרייבס, פורפורה טרומבוציטופנית אידיופטית, דלקת מפרקים שגרונית ואלרגיות. אף אחד מהמעכבים הפוטנציאליים הללו לא אומת בניסוי, אולם המסגרת חזתה שישה רצפים הנקשרים ל-HLA-DR1 ו-13 רצפים הנקשרים ל-PNP.
טבלה 2 מסכמת מעכבים ואגוניסטים מאומתים בניסוי שנחזו באמצעות מסגרת תכנון החלבון דה נובו. מדד הזיקה המשוער שימש לחיזוי תשעה מהרצפים (מעכבים של C3c אנושי, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 ו-LSD2), בעוד שמדד הספציפיות של הקיפול שימש לזיהוי ארבעה מהרצפים (אגוניסטים/אנטגוניסטים של C3aR). פפטידים אלה מדגישים את ההצלחה של מסגרת עיצוב החלבון דה נובו, במיוחד מדד הזיקה המשוער הנוסף. המסגרת מגוונת ביותר בתחולתה. שישה חלבונים שונים הקשורים לעשרים וחמש מחלות שונות תוכננו בהצלחה ותוקפו בניסוי.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>שם</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>יעד חלבון</td>
			<td>מחלות ישימות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0.94 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>C3c אנושי</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">שבץ מוחי, התקף לב, מחלת אלצהיימר, אסטמה, דלקת מפרקים שגרונית, זאבת אדמנתית מערכתית, טרשת נפוצה, פסוריאזיס, סוכרת מסוג I, מחלת קרוהן, דלקת הלבלב וסיסטיק פיברוזיס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1.98 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>C3c אנושי</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4.73 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>C3c אנושי</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15.2 ננומטר</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36.4 ננומטר</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15.4 ננומטר</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26.1 ננומטר</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>איידס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13.57 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">סרטן הערמונית, השד, לימפומה, מיאלומה, שלפוחית השתן, המעי הגס, העור, הכבד, רירית הרחם, הריאות והקיבה</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0.521 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0.249 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2.51 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 מיקרומטר</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2. פפטידים שנחזו חישובית ואומתו בניסוי המכוונים למחלות שונות.

חוכמת חלבון: workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

המטרה של עיצוב חלבון נובו דה היא למצוא את רצף החומצות האמינו שיהיה לקפל לתוך מבנה 3 ממדים רצוי עם שיפורים במאפיינים ספציפיים, כגון זיקה מחייבת, אגוניסט אנטגוניסט או בהתנהגות, או יציבות, ביחס לרצף המקורי. עיצוב חלבון נמצא במרכזו של תכנון תרופות התקדמות הנוכחי וגילוי. לא רק שעיצוב חלבון מספק תחזיות למטרות תרופה פוטנציאליות טוב, אבל זה גם משפר את ההבנה של תהליך קיפול החלבונים וחלבוני האינטראקציות שלנו. שיטות ניסיוניות, כגון אבולוציה מכוונת הראו הצלחה בעיצוב חלבון. עם זאת, שיטות כאלה מוגבלות על ידי מרחב הרצף המוגבל שניתן לחפש tractably. בניגוד לכך, אסטרטגיות עיצוב חישוביים לאפשר הקרנה של קבוצה הרבה יותר גדולה של רצפים המכסים מגוון רחב של תכונות ופונקציונליות. יש לנו פיתחה מגוון רחב של חישובית דה נובו חלבון העיצוב methoDS מסוגל להתמודדות עם מספר תחומים חשובים של עיצוב חלבון. אלה כוללים את העיצוב של חלבוני monomeric ליציבות ומתחמים מוגבר לזיקה מחייבת מוגברת. כדי להפיץ את השיטות האלה לרחבים יותר להשתמש בחוכמה אנו מציגים חלבון <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">(http://www.proteinwisdom.org),</a> כלי שמספק בשיטות אוטומטיות למגוון רחב של בעיות עיצוב חלבון. תבניות מבניות מוגשים כדי לאתחל את תהליך העיצוב. השלב הראשון של תכנון הוא שלב בחירת רצף אופטימיזציה שמטרתה לשפר את יציבות באמצעות מזעור של אנרגיה פוטנציאלית במרחב הרצף. רצפים נבחרים לאחר מכן מנוהלים באמצעות שלב סגוליות קיפול ושלב זיקה מחייב. רשימת הדירוג של-מסודרת של הרצפים לכל שלב של התהליך, יחד עם מבנים המיועדים רלוונטיים, מספקת את המשתמש עם הערכה כמותית מקיפה של העיצוב. כאן אנו מספקים את הפרטים OF כל שיטת תכנון, כמו גם כמה הצלחות ניסיוניות בולטות שהושגו באמצעות השימוש בשיטות.

De Novo תכנון של מעכבי כניסה עבור HIV-1
מסגרת התכנון מסוג de novo המיושמת ב-Protein WISDOM שימשה לתכנון פפטידים מעכבים עבור מספר מערכות טיפוליות חשובות (טבלאות 1 ו-2). מערכת בולטת אחת היא תכנון פפטידים לעכוב את כניסת HIV-1 לקולטן CD4 של תא המארח, המשמשת כאן כמערכת מייצגת להדגמת השימוש המעשי בממשק של Protein WISDOM. הפפטידים תוכננו כדי להתמקד ביחידה התת-ממברנלית gp41, המשמשת כחלק מרכזי באיחוי ובכניסה של HIV-1 לתאי T מסייעים של המארח. שימו לב שהתוצאות לא יהיו בהכר...

פיתחנו שיטות עיצוב חלבון דה נובו חישוביות המסוגלות להתמודד עם מספר תחומים חשובים של עיצוב חלבונים. כדי להפיץ את השיטות הללו אנו מציגים את Protein WISDOM, כלי מקוון לתכנון חלבונים (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). החל מתבנית מבנית, ניתן לבצע תכנון של חלבונים מונומרים ליציבות מוגברת וקומפלקסים לזיקה קשירה מוגברת.

חוכמת חלבון: Workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לתכנן חלבונים או פפטידים בעלי קיפול, קישור או תכונות פונקציונליות משופרות. דבר זה מושג על ידי העלאת מבנה החלבון או הקומפלקס והגדרת מוטציות ואילוצים ביולוגיים. כשלב שני להגדרת מטרת התכנון, מבוצע אופטימיזציה של בחירת רצפים, המייצרת מספר רב של רצפי חלבונים או פפטידים אפשריים בעלי יציבות ותכונות אינטראקציה משופרות. לאחר מכן מתבצע קיפול.חישובים של ספציפיות ו/או זיקה קישורית מקורבת מבוצעים על הרצף שתוכנן, וזאת כדי לתקף את החלבונים או הפפטידים שתוכננו עבור התכונות המשופרות הרצויות. מתקבלות תוצאות המראות תכונות משופרות של הרצפים שתוכננו, בהתבסס על ניתוח חישובי של המבנים שהופקו באמצעות הפרוטוקול. פרוטוקול זה פותח במעבדתו של פרופסור כריס דולס, נגנית חלילים מאוניברסיטת פרינסטון.פרוטוקול חישובי כללי זה לתכנון חלבונים דה-נובו (de novo) מסוגל להתמודד עם מספר תחומים חשובים בתכנון חלבונים. אלו כוללים תכנון של חלבונים מונומריים ליציבות מוגברת וקומפלקסים לאפיניות קישור מוגברת. השגנו מספר תכנונים מוצלחים בולטים במגוון תחומים טיפוליים שונים, כולל מעכבים של H-I-V-G-P 41, מעכבים המכוונים ל-EZH two עבור טיפולים בסרטן, ומעכבים המכוונים לרכיבי המשלים C3 A. כדי להנגיש את יישום מתודולוגיית תכנון החלבונים לקהילה האקדמית הרחבה, פיתחנו ממשק אינטרנט בשם Protein Wisdom.ממשק זה מאפשר למשתמש שליטה מלאה בהגשת תבנית, הגדרת אילוצי תכנון ופירוט פרמטרי השיטה, כדי להשתמש בקלות בשיטות התכנון עבור מגוון רחב של בעיות תכנון. לאחר הרשמת המשתמש באתר protein wisdom כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, יש להגיש את רצף החלבון ומבנה התבנית, אך יש ללחוץ תחילה על כפתור התחברות המשתמש. כדי להתחיל את ניסוי תכנון החלבון, המשתמש מופנה לדף הבית של המשתמש, שבו מופיעים מספר המשימות שהוגשו, מספר המבנים שהועלו ורשימה של המבנים שהועלו עד כה. כעת ניתן להתחיל משימת תכנון חדשה.בלחיצה על create new job, המשתמש מועבר לדף הגשת העבודה. תנו שם לעבודה וציינו אם היא מבוססת על עבודה קודמת. לחצו על continue.העלו את מבנה החלבון של תבנית העיצוב. תבנית זו חייבת להיות בפורמט סטנדרטי של מאגר נתוני החלבונים או בפורמט PDB. היא יכולה להיות תבנית קשיחה עם סט קואורדינטות אחד לכל אטום, או תבנית גמישה עם מספר מודלים, כפי שמתקבל ממבני פתרון של NMR.במקרה של עיצוב חלבון בודד, יכולה להיות שרשרת אחת בלבד. בתבנית, המשתמש יכול להעלות תבנית חדשה או לבחור מתוך תבניות קיימות שהעלה בעבר. אם הועלו מספר תבניות, ודא שכל מודל מתחיל ב-model number ומסתיים ב-end model.ודא שכל שארית מוגדרת על ידי חומצת அமינו טבעית. לחץ על המשך. לאחר שהתבנית הועלתה ואושרה בהצלחה, המשתמש מועבר לדף הבקרה הראשי.בעמוד זה, המשתמש יכול לצפות בסטטוס העבודה, לשנות את מערכות המוטציות ואת האילוצים הביולוגיים, ולהגיש את העבודה לבחירת רצפים בשלב הראשון. בשלב זה, מכיוון שהשלב הראשון טרם הושלם, אין אפשרויות לשלב השני. אלו יופיעו ברגע שתוצאות השלב הראשון יהיו זמינות.בשלב הבא, לחצו על קישור מערכי המוטציות (mutation sets) בדף הבקרה הראשי כדי להגדיר מערכי מוטציות, בחרו אילו שאריות יורשו לעבור מוטציה ובחרו לאילו חומצות אמינו הן רשאיות להשתנות. כברירת מחדל, חומצות האמינו המותרות בכל מיקום נבחרות על בסיס שטח פנים נגיש לממסמ (solvent accessible surface area), כאשר נדרשים מערכי מוטציות SSA. לחצו על שמירת שינויים (save changes) לאחר בחירת מערכי המוטציות.שימו לב למורכבות החישובית של האופטימיזציה שיש לפתור. קיים גבול עליון של 20 בחזקת 25 למורכבות החישובית המותרת. לאחר מכן, לחצו על קישור האילוצים הביולוגיים (biological constraints) בדף הבקרה הראשי כדי להגדיר אילוצים ביולוגיים, ולהגדיר אילוצים של מטען או תכולת חומצות אמינו לאורך כל החלבון או בחלק מוגדר של החלבון.מספר המוטציות הכולל המותר להתרחש במידת הצורך; מגבלות ביולוגיות הן אופציונליות. חזור לדף הבקרה הראשי עם הסיום. לחץ על הקישור לתחילת שלב אחד כדי להעביר את המשתמש לדף הגשת שלב אחד.בחרו את השלשלת כדי להגדיר את מספר הרצפים ליצירת שדה הכוחות התלוי מרחק, ואת חישוב המודל. פרטים ספציפיים בנוגע לבחירות אלו ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. לאחר הגשת העבודה, המשתמש יופנה חזרה לדף הבקרה הראשי.סטטוס העבודה יעודכן כדי לציין את ההתקדמות הנוכחית של העבודה. העבודה תינעל לעריכה לאחר ההגשה. עם השלמת העבודה, המשתמש יקבל אימייל עם התוצאות, הכוללות רשימה של רצפים שתוכננו.ניתן לצפות בתוצאות גם בדף הבקרה הראשי. תיבה עבור סגוליות קיפול של שלב שני מופיעה בדף כדי לאפשר למשתמש לבצע אימות זה; כדי לעשות זאת, לחצו על "begin stage two fold specificity". כדי להיכנס לדף בניית שלב שני, הגדירו את גבולות המרחק של פחמן אלפא העליון והתחתון על ידי פירוט גורם הגמישות של התבנית, בין אם כאחוז מהמרחק ובין אם כמרחק קבוע.בשלב הבא, הגדירו את גבולות הזווית העליונים והתחתונים עבור זוויות ה-PHI וזוויות הדיהדרל הצדדיות. לאחר הגדרת מקדם הגמישות של התבנית כאחוז, לחצו על כפתור השליחה (submit), הגדירו את מספר המבנים שיש להפיק לכל רצף ולחצו על המשך (Continue). שימו לב, קיים גבול עליון של 500 מבנים להפקה לכל רצף.לאחר מכן, לחצו על continue כדי לאשר את הכוונה להגשה לאימות קיפול. שלב ראשון ושלב שני נעולים לעריכה עד להשלמת השלב השני. עם סיום העבודה, יישלח למשתמש דואר אלקטרוני עם התוצאות, שניתן לצפות בהן גם בדף הבקרה הראשי.כאן ניתן לצפות ולהוריד את קבצי הטקסט המכילים את הרצפים שעוצבו, את ערכי האנרגיה המתאימים משלב אחד ואת ערכי סגוליות הקיפול משלב שני. בנוסף, המשתמש יכול ללחוץ על קישור "הצגת תוצאות" (view results), המציג בדפדפן טבלה עם הדירוגים וערכי האנרגיה משלב אחד, וכן את הדירוגים וערכי סגוליות הקיפול משלב שני. חישובי זיקה (binding affinity) מקורבים משמשים כדי לקבוע את הזיקה של חלבון הליגנד או הפפטיד שעוצבו לשאר הקומפלקס.ניתן לבצע חישובים אלו מיד לאחר השלב הראשון או לאחר השלמת חישובי הספציפיות של הקיפול. כדי להתחיל, לחצו על מספר הרצף כדי לבחור את הרצף. כדי להתחיל בחישוב זיקה (affinity) מקורבת לקשירה, המשתמש יופנה לדף בחירת הרצפים, המציג רשימה של רצפי העיצוב, יחד עם דירוג בחירת הרצף ודירוג הספציפיות של הקיפול.לאחר בחירת הרצף ושמירתו, המשתמש מופנה לדף הבקרה הראשי. לאחר מכן, יש ללחוץ על Begin stage two, approximate binding affinity כדי להגיש את העבודה. עם השלמת התהליך, התוצאות יישלחו למשתמש בדואר אלקטרוני, כולל קובץ מצורף המכיל את מספר הרצף, זיקת קישור משוערת (approximate binding affinity) וערכים של פונקציות החלוקה. עבור כל עבודת זיקת קישור משוערת שתבוא לאחר מכן, קובץ זה יכיל את התוצאות עבור כל הרצפים שהושלמו.ניתן לצפות בתוצאות המלאות גם על ידי גישה לדף הבקרה הראשי עבור הג'וב המוצג. כאן מוצגת תבנית העיצוב עבור מעכבי כניסה של HIV-1, שהיא המבנה הגבישי של פפטיד מוצלב בעל 14 שאריות C14 link mid בקומפלקס עם הליבה של GP41. פפטיד תבנית זה הוא מעכב חזק ידוע, והוא מוגש כאשר חומר הקישור המוצלב הוסר.לאחר הגדרת קלטי התכנון והגשת המערכת לבחירת רצפים בשלב הראשון, ניתן לגשת לתוצאות בחירת הרצפים הממוינות באמצעות קישורי "view results" בעמוד העבודה הראשי. קישור זה מספק סיכום קריא של כל התוצאות שחושבו עבור מערכת נתונה, וניתן למיין אותו לפי כל אחת מתוצאות השלבים.לניתוח מהיר, ניתן להציג את התוצאות גם באמצעות קישור תוצאות הרצף, המספק סיכום של רצפים נבחרים בקוד חומצות אמינו בן שלוש אותיות. האפשרות השלישית לגישה לתוצאות היא באמצעות קישור תוצאות האנרגיה, המספק סיכום של הרצת מודל האופטימיזציה עם הרצפים הנבחרים, האנרגיות שלהם, והזמן שנדרש לפתרון המודל עבור הפתרון. לאחר השלמת שלב ראשון, בחירת רצפים והגשת שיטות סגוליות הקיפול ואפיניות קישור מקורבת של שלב שני, ניתן לגשת לתוצאות ולמיין אותן בסעיף תוצאות תצוגת הסיכום.לחלופין, ניתן לצפות בהם באופן פרטני בסעיף תוצאות ספציפיות לקיפול (Specificity Results); בסעיף זה, מספר הרצף וערכי הספציפיות לקיפול מוצגים כמערך. תוצאות חישובים של זיקה קישורית מקורבת לדגימות מוצגות כרשימה שניתן למיין. בסעיף הצגת התוצאות, לכל הרצפים שעבורם בוצע חישוב הזיקה הקישורית המקורבת יש קישור מודגש בעמודת התצוגה. קישור התצוגה מעביר את המשתמש לדף מידע על התכנון.דף זה מספק קבצי zip להורדה עבור כל מבני הקומפלקסים והפפטידים שנעשה בהם שימוש. בשלב תכנון המבנה הסופי עבור מבני הקומפלקסים והפפטידים, 10 המבנים בעלי האנרגיה הנמוכה ביותר מוצגים ברשימה מדורגת. לכל מבנה יש קישור לצפייה, המאפשר למשתמש לצפות במבנה בסביבת JM O אינטראקטיבית.קישור להורדה מסופק גם כדי לאפשר למשתמש להוריד כל מבנה באופן נפרד. פרטים נוספים על התוצאות מוצגים בסעיף תוצאות זיקת הכבילה המקורבת. סעיף זה מספק את הערכים עבור פונקציות החלוקה של הפפטיד, החלבון והקומפלקס, יחד עם ערך זיקת הכבילה המקורבת הסופי.בעת עבודה עם protein wisdom, חשוב לזכור כי לבחירת אילוצי התכנון עשויה להיות השפעה רבה על תוצאות התכנון הכוללות. אילוצי התכנון לא רק מאיצים את החיפוש הכולל על ידי הגבלת היקף מרחב הרצפים שהאלגוריתמים לאופטימיזציה צריכים לסקור, אלא ששימוש באילוצי אופטימיזציה הנגזרים ממידע ניסיוני יכול להוביל לקבלת תכנוני חלבונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. אנו מקווים שהזמינות של שיטות התכנון באמצעות ממשק האינטרנט של protein wisdom תאפשר שימוש נרחב יותר בשיטות תכנון אלו.אנו ממשיכים להרחיב ולפתח את יכולותיהם של שיטות התכנון ומקווים להכליל את המסגרת כך שתכלול מערכות מולטימריות, אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA ותכנון עם מודיפיקציות לאחר תרגום וחומצות אמינו לא קנוניות בעתיד הקרוב. עם כל הרחבה, זמינות השיטות באמצעות Protein Wisdom תאפשר יישום קל ויעיל על ידי הקהילה האקדמית.

protein-wisdom-workbench-for-silico-de-novo-design

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

רצפי חלבונים סינתטיים המבוססים על מוטיבים קונצנזואליים מתעלמים בדרך כלל משאריות מתפתחות משותפת, המרמזות על תלות אינטרפוזיציונית (IPD).  IPDs יכולים להיות חיוניים לפעילות, ועיצובים המתעלמים מהם עלולים לגרום לתוצאות לא אופטימליות.  פרוטוקול זה משתמש ב-StickWRLD כדי לזהות IPDs ולסייע בתכנון חלבון רציונלי, וכתוצאה מכך תוצאות יעילות יותר.

ושאריות או זיהוי של Interpositional תלות המציין מבני / צמודות תפקודית: אופטימיזציה של חלבונים סינטטיים

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

ניתוח חלקיקים בודדים במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית היא אחת הטכניקות העיקריות המשמשות לקביעת מבנה ההרכבים הביולוגיים ברזולוציה גבוהה. Scipion מספקת את הכלים ליצירת הצינור כולו לעיבוד המידע שנרכש על ידי המיקרוסקופ ולהשיג שחזור תלת מימדי של הדגימה הביולוגית.

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

מיומנות מרכזית בדוגמנות ביומולקולרית היא הצגת וביאור אתרים פעילים בחלבונים. טכניקה זו מודגמת באמצעות ארבע תוכניות פופולריות בחינם להדמיה מקרומולקולרית: iCn3D, Jmol, PyMOL, ו UCSF כימרהX.

מידול אתר פעיל אנזים באמצעות תוכנה חופשית להדמיה מולקולרית

פרוטוקול זה מספק גישה לאופטימיזציה של ניסוח על פני גורמי מחקר מתערובת, רציפים וקטגוריים הממזערת בחירות סובייקטיביות במבנה התכנון הניסויי. בשלב הניתוח נעשה שימוש בהליך התאמת מידול יעיל וקל לשימוש.

תהליך עבודה לאופטימיזציה של נוסחת ננו-חלקיקי שומנים (LNP) באמצעות ניסויים מתוכננים בתהליך תערובות ומודלים של אנסמבל מאומת עצמי (SVEM)

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

תכנון חלבונים כרוך בבניית רצפי חומצות אמינו ושילוב מוטיבים ספציפיים ליצירת גרסאות פונקציונליות. גישה זו חיונית לפיתוח פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) כדי להילחם בפתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה. מאמר זה מציג הליך לבניית חלבונים באמצעות כלים ביואינפורמטיים שונים.

יישום של I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, שרת HADDOCK ו-HEX loria עבור De Novo ו-In Silico Design של חלבונים

פרוטוקול זה מספק שיטה לאופטימיזציה גלובלית שיטתית של חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית באמצעות יצירה והערכה של ספריות גנטיות בסיוע אוטומציה. זה משולב עם מתודולוגיות תכנון ניסוי כדי לייעל את הניסויים ולאפשר בחירת רכיבים גנטיים כדי לכוונן את החיישנים הביולוגיים לתוצאות תכנון ספציפיות.

דגימה יעילה של מרחב תכנון חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מתאפשרת עם תכנון ניסויים וזרימת עבודה של אוטומציה

אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) עצמית התאספו monolayer (PEG-SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב אחד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. אלקטרופורזה לאחר מכן נעשה שימוש עבור ביומולקולות דפוסים עד הננומטרי.

Antifouling עצמית התאספו monolayers על Microelectrodes עבור ביומולקולות דפוסים

הסרטון מלווה מתאר את השימוש של מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה, אשר מחיצות דגימות חלבון מורכב על בסיס משקל מולקולרי ומשחזרת את השברים בשלב נוזלי. הסרטון מתאר כיצד הטכנולוגיה עובדת, וכיצד נעשה בו שימוש, ומספק נתונים כתוצאה, עם ניתוח ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide של homogenate מופרדים בכבד בקר.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

למד עיצוב חלבונים חישובי באמצעות כלי Protein WISDOM לשיפור יציבות ואפיניות קישור. שיטה זו מאפשרת למחקרים לפתח חלבונים מונומריים וקומפלקסים ליישומים ביוטכנולוגיים ורפואיים.

חוכמת חלבון: Workbench ל

גלה סרטונים נוספים