אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה פשוטה הניתנת לשחזור לאינדוקציה של מעבר אפיתל למזנכימלי או EMT במבחנה. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של סוג תאי האפיתל המעניין בנוכחות תוסף המדיה המעורר EMT. השלב השני של ההליך הוא החלפת אמצעי התרבות באמצעי תרבית טריים המכילים את תוסף המדיה המעוררת EMT שלושה ימים לאחר הציפוי הראשוני.

השלב האחרון הוא לקצור תאים חמישה ימים לאחר הציפוי הראשוני לאפיון במורד הזרם, כגון צביעה חיסונית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות תאים המקבלים מאפיינים מזנכימליים באמצעות מיקרוסקופ אור, כימיה של ציטו חיסוני, מערך ניתוח דם מערבי או הליך ניתוח אחר לבחירה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו גירוי בטא TGF או שינוי גנטי, הם ששיטה זו מהירה וקלה, בניגוד לשינוי גנטי ומאפשרת השראת EMT במגוון סוגי תאים, שחלקם עשויים שלא להגיב אך ורק לגירוי בטא TGF.

ההשלכות של טכניקות אלה משתרעות על טיפול ואבחון של גרורות סרטניות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים את היכולת לפתח חתימות ביטוי נפוצות של תאים גרורתיים שניתן להשתמש בהם באבחון. הוא גם מספק תאים שישמשו לסינון תרופות.

התחל בחימום מצע התרבות לתאים המעניינים ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות תמיסת דיסוציאציה כגון עם טריפל E אקספרס. לאחר מכן השעו את התאים במצע תרבית טרום חם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה את תרחיף התאים ב-400 Gs למשך חמש דקות.

הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שפיכתו למיכל פסולת והשעיית גלולת התא במצע תרבית טרום חם. כעת ספרו את התאים הקיימאים, דללו דגימה של תרחיף התאים בתמיסה כחולה של 0.4%. הניחו 10 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת על המו, ציטומטר וספרו תאים ברי קיימא.

תאים ברי קיימא. אל תהפוך לכחול לאחר חישוב צפיפות התאים בצלחת התמיסה. תשעה עד 10,000 תאים לסנטימטר רבוע במצעי תרבית חמים מראש המכילים תוסף מדיה מעורר XEMT אחד השתמשו בצלחות או בתרבית צלוחיות שטופלו בתרבית רקמות.

התאים מצופים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ועוקבים אחר המורפולוגיה שלהם מדי יום באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך. שלושה ימים לאחר מכן, החלף את המדיה במצע תרבית טרי שמחמם מראש המכיל תוסף מדיה מעורר XEMT אחד. חמישה ימים לאחר הציפוי, התאים מוכנים לניתוח.

דמיין את המורפולוגיה של התאים תחת אור הפוך מיקרוסקופ ניתן כעת לתקן או לקצור תאים למחקרים במורד הזרם. הכן פתקי כיסוי סטריליים של 12 מילימטר לצלחת 24 בארות על ידי הנחת פתקי כיסוי בצלחת פטרי המכילה 95% אתנול. הסר בעדינות את החלקות הכיסוי מהאתנול באמצעות מלקחיים מעוקלים.

להבות מעקרות כל החלקת כיסוי ומעבירות לבאר אחת של טיפול בצלחת 24 באר החלקות הכיסוי דורשות טיפול ותרגול. הבא ב-0.5 מיליליטר של מדיית תרבית מחממת מראש המכילה מדיה מעוררת XEMT אחת. תוסף לתאים וצלחת 16,000 תאים לבאר.

כעת גדל והאכיל את התאים כפי שתואר קודם לכן. חמישה ימים לאחר ציפוי התאים, הסר את המדיה וקבע אותם עם 300 מיקרוליטר לבאר של 4% אלדהיד פרפורם ב-XPBS אחד מאפשרים לקיבוע להמשיך במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את הקיבוע ושטוף את התאים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של XPBS אחד לבאר.

לאחר מכן, דגרו את התאים הקבועים ב -400 מיקרוליטר של חיץ חוסם לבאר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מריחת החסימה, הכינו את הנוגדן הראשוני בריכוז המומלץ של היצרן ב-400 מיקרוליטר של חיץ חוסם לבאר. לאחר מכן הסר את תמיסת הבלוק מהבארות והוסף את תערובת הנוגדנים לתאים.

דגרו על התאים במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ואם הנוגדן העיקרי מצומד ישירות לפלואורוכרום, דגרו אותם בחושך. לאחר מכן, הסר את הנוגדן העיקרי ושטוף בארות שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר לבאר של XPBS אחד המכיל 0.1% BSA אפשר לכל שטיפה להימשך חמש דקות ובמידת הצורך, הגן על התאים מפני אור.

כעת, במידת הצורך, דגרו תאים בנוגדנים משניים בריכוז המומלץ של היצרן. לדלל את הנוגדן ב-400 מיקרוליטר לבאר של XPBS אחד המכיל 1% BSA. אפשר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מאור לאחר שעה.

שטפו את התאים שלוש פעמים בדיוק כפי שנעשה כדי להסיר את הנוגדן העיקרי לאחר השטיפות. אם תרצה, החל כתם נגד DPI על התאים. לבסוף, שטפו את התאים במים נטולי יונים והרכיבו את החלקות הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופיות באמצעות אמצעי הרכבה.

שוב, היזהר בטיפול בתלושי הכיסוי. תנאי התרבית המעוררים EMT מספקים שיטה חזקה לאינדוקציה של EMT במגוון סוגי תאים. זה נבדק על ארבעה קווי תאים אנושיים שונים.

תאים שטופלו בתוסף המדיה המעורר EMT השתנו ממורפולוגיה אפיתלית קלאסית למורפולוגיה בצורת ציר מזנכימלי. צביעה כפולה לביטוי e cadherin ו-fibronectin הדגימה את הוויסות הנמוך של סמן האפיתל e cadherin באדום ואת הוויסות המוגבר של הסמן המזנכימלי פיברונקטין בדגימות CF 10 A הירוקות הכילו אשכולות צפופים המוקפים בתאים ארוזים יותר באופן רופף. אשכולות אלה היו E יכול להיות חיובי כאן מוצג באדום.

האשכולות נעלמו עם טיפול בתוסף המדיה המעורר EMT. זה עלה בקנה אחד עם עלייה בביטוי פיברונקטין בירוק. ט 98.

ל-G נמצאה רמה בסיסית נמוכה ביותר של טרין לפני השראת EMT, מה שמנע את ניתוחו. עם זאת, עם סמן זה, נמצא כי רמות הפיברונקטין עולות באופן משמעותי עם השראת EMT בתאים אלה. רמות הביטוי של e דבק ופיברונקטין אושרו עוד יותר באמצעות כתמים מערביים של סך הליזטים של התאים.

למרות שהכתם המערבי אינו מראה ירידה משמעותית ברמות הכוללות של חלבון הרין EAD בתאי HT 29, הייתה ירידה בביטוי פני השטח של טרין שנצפה על ידי אימונוכימיה כדי להעריך עוד יותר את מצב EMT סמנים מזנכימליים האופייניים למנטון EMT בירוק ושבלול באדום נותחו לפני ואחרי אינדוקציה של EMT בהתאם לתוצאות קודמות. Eki כאן באפור היה מווסת בכל קווי התאים שנבדקו מה שמצביע על כך ש-EMT הושרה. בנוסף, הייתה ויסות מוגבר של חילזון באדום ומנטון בירוק בתאי 5 49 T 98 G ו-MCF 10 A CCF שבעה תאי סרטן שד אנושיים ותאי קרצינומה של הלבלב האנושי PanIN דווחו שניהם שלא נכנסו ל-EMT על ידי איתות בטא TGF בלבד.

דיווחים אלה אושרו עם TGF רקומביננטי בטא אחד בלבד. בריכוז בתוך תוסף המדיה המעוררת EMT, התאים שמרו על מורפולוגיה האפיתל שלהם ורמות הקוהרנטיות של פני השטח E היו דומות לתאי הביקורת. לעומת זאת, תאים שעוררו עם תוסף המדיה המעורר EMT הראו ירידה דרסטית ברמות ה-E cadherin על פני השטח שלהם.

תאים אלה קיבלו גם מורפולוגיה מזנכימלית יותר. סימן היכר נוסף של תאים מזנכימליים הוא יכולתם לנדוד ולפלוש. זה נותח באמצעות בדיקת פלישת תאי BME של 96 בארות.

על פי הוראות היצרן, נצפו עליות משמעותיות בנדידת התאים הן עם תא 5 49 והן עם תא פאן אחד. לאחר השראת EMT, אותה בדיקה בוצעה עם מסנן מצופה תמצית קרום מרתף לבדיקת פלישה. תאים המושרים על ידי EMT הראו עלייה משמעותית ביכולות הפלישה בהשוואה לתאים שלא טופלו.

האינדוקציה החזקה של EMT שימושית לניתוח שינויים בביטוי גנים ואיתות המתרחשים בתאים אלה. מערך מסחרי מבוסס נוגדנים המשתמש בליזטים מ-MCF 7 ו-5,49 תאים שימש לניתוח הרמות של בני משפחת MA קינאז זרחניים. שני סוגי התאים הראו זרחון מוגבר של kreb irk one ו-irk two בתאים המושרים EMT בהשוואה לביקורת.

5,49 תאים הראו גם עלייה בזרחן GSK שלוש בטא. תאי Mc שבעה הראו זרחון מוגבר של P 70 S 6 K בנוסף לזרחון מוגבר של kreb או אחד ו-DIRK 2. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיכולה להיות שונות מסוימת בתוצאות מסוגי תאים שונים, לא מכל התאים.

אנו משתמשים באותם מסלולים במורד הזרם לאינדוקציה של EMT מה שמוביל להבדלים בביטוי הסמנים בין סוגי התאים. בנוסף, סמנים רבים של EMT אינם מדגימים מצבי הפעלה וכיבוי קפדניים ועשויים להיות בעלי רמות בסיסיות בתאי האפיתל. סמנים כאלה יכולים להראות חילופי לוקליזציה מוגברים במעבר מזנכימלי בעקבות הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו בדיקת תרופות כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו תרכובות מסוגלות לווסת את המעבר בין אפיתל למזנכימלי. תרכובות אלו יכולות להיות שימושיות מאוד בטיפול בסרטן ופיברוזיס.