Name: מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למד מיקרוסקופיה אינטרוויטלית של שריר הכרמסטר בעכבר לניתוח אינטראקציות בין תאי גזע לתאי אנדותל בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת כימות נדידת תאי גזע היקפיים ומסייעת להבנת מנגנוני הנדידה ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל הפרוטוקול לאחר בידוד התא לוקח כ 2 שעות. 1. Microsurgical הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד בתאי גזע ממח עצם מתורם וסימון ניאון של subpopulation המבודד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 9,12 אפשר תאים לנוח בזמן המבצע בבעלי החיים מתבצע. לניאון תיוג אנו ממליצים CFDA (succinimidyl אסתר diacetate Carboxyfluorescein). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי במשקל גרם 20-25 עם קטמין (75 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (2.5 מ&quot;ג / קילוגרם) עכבר זכר. לאורך כל ההליכים כירורגיים ופרוטוקולים ניסיוניים, הרדמה צריכה להיות מתוחזק על ידי תוספים (10% מהזרקה ראשונית, ip) לפי צורך (בדרך כלל כל 30-60 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח בעדינות את ההיבט הקדמי של כיס האשכים תקין, כמו גם את הירך ומפשעה הימנית. לאסוף את כל לאבד את השיער עם מקלון צמר גפן טבולה. הנח את צד הגחון העכבר על שלב צפייה פרספקס ולתקן את התשלוםלא באמצעות וילון אלסטי. הבמה מחוייט, בהיקף של צלחת בסיס וצלחת שנייה בקצה הזנב של צלחת הבסיס לגובה של שני רגליים וצק האשכים. מניחים את הבמה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף על 37 ° C. לאחר קיבוע על הבמה, המקום חי תחת מיקרוסקופ פעולה ולבצע את שלבי הפעולה הבאים באמצעות 10 - להגדלת 16 פי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשוני באמצעות מספריים עור בשוק הימין, רק הקדמי של כלי הירך מהברך ועד למפשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את עורק הירך ובצע אותה proximally, וגייס את העורק מרקמות רכות. לזהות ולחתוך סניף גדול לאשך השמאלי באמצעות thermocautery. לאחר מכן למקם את תפר שהות באופן שטחי באשך השמאלי. מתיחה עדינה תאפשר גיוס הפרוקסימלי נוסף של עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הגיוס הפרוקסימלי, לזהות ולחתוך mediall סניף פועל גדולy בירך על ידי thermocautery. לאחר מכן לקשור את עורק הירך בחלקו האחורי של ירך ימין. מתיחה עדינה על המייתר תסייע הכנה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפנות את תשומת לב החברה לעורק הירך הפרוקסימלי שוב ולמקם את תפר סביב העורק כproximally ככל האפשר. הכן את קשר אבל לא לקשור את זה עדיין. החל מתיחה עדינה לתפר וליצור מסתלסלים בעורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקמת מסתלסלת, לחתוך את העורק באמצעות microscissor בזהירות. קח טיפול מיוחד שלא לפגוע בעורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microcatheter מוכן (קוטר פנימי 0.28 מ&quot;מ) דרך החתך. קטטר יש deaired (כלוריד 0.9% נתרן, NaCl) ומחובר לכניסה לפני מזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כניסה מוצלחת של קטטר, לשחרר בזהירות מסתלסלת על מנת להקל על המעבר של קטטר. זרימת דם בעורקים צריכה להיות גלויה באופן מיידי בתוך קטטר. בעדינות לקדם את הקטטר כמה מילימטרשל מעבר למסתלסל הקודם. לאחר מכן, לקשור את המייתר מוכן לקיבעון של הקטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את הצנתר (0.9% NaCl) ולשאוב כדי לאשר את המיקום נכון. השתמש בנייר דבק כדי להבטיח עוד יותר את הצנתר לשלב הפעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע נאות, לשים את הקטטר בצד לשלבי ההכנה הבאה של שריר Cremaster. החל שטיפה ושאיפה של קטטר כל דקות 5-10 קבועות על מנת למנוע היווצרות קריש דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפנות את תשומת לב החברה לצק האשכים תקין ועושה חתך על ידי חיתוך העור וfascia מעל היבט הגחון של שק האשכים תקין. יש להיזהר שלא לגעת ברקמה הבסיסית עם כל מכשירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את החתך עד לקפל מפשעתי וcaudally לקצה הדיסטלי של שק האשכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה נפרדת זהירות בסיסית רכה וחיבור מעל שק Cremaster, מבלי לגעת בו. זהה את הקצה הדיסטלי של Cremaster, ולמקם את תפר שהות כאן כדי SLightly להאריך את השרירים. לכרות עם החברה רקמות רכות שנותרו מתחת לשק השריר על ידי משייכתו בעדינות את שריר caudally ו anteriorly. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרדה מוחלטת מרקמות חיבור, פתח את שק Cremaster בנקודה אחת על קצה הגולגולת באמצעות מספריים. להאריך את החתך מפתיחה למטה זה לקצה הדיסטלי של השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את כלי השיט הקטן המחבר את האשך וCremaster באמצעות thermocautery, לאחר מכן לחתוך את הקשרים שנותרו בין השרירים והאשך באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להניח בצד האשך, מתוך השדה במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cremaster נפתח כעת מניח שטוח על הבמה. הנח ארבעה 6-0 תפרי שהות Prolene בקצוות של הרקמה ולתקן אותן עם וילון אלסטי כדי להפיץ את רקמת שריר Cremaster. מעתה והלאה ברציפות ללחלח את הרקמות שבנאגר מלוח פוספט (PBS) באמצעות מזרק 1 מיליליטר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לחברת ההכנה למנוחה ל15 דקות. לאחר מכן להזריק0.05-0.1 מיליליטר של 1% Rhodamine-Dextran דרך עורק הירך השמאלי להגברת הניגודיות של נימי הדם. אם כל כמוקינים או סוכנים דלקתיים מתוכננים ליישום, אתה צריך עכשיו למריחה ללחלח את השריר עם מגיב בהתאמה באמצעות מזרק 1 מיליליטר. במקרה של ניסוי בקרה, ימשיך הרטבה עם PBS. </li></ol> 2. מיקרוסקופית Intravital <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכבר קבוע בשלב הפעולה ולהעביר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הותאם לעלית תאורה ומחובר לCCD (מכשיר תשלום מצמידים) מצלמת וידאו. קח טיפול מיוחד שלא לנקוע את הקטטר עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויים באמצעות מטרת טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתאמה האובייקטיבית להדמיה מספקת של זרימת דם Cremaster ולפני הזרקת תאים, stochastically להגדיר שש venules postcapillary לניתוח מאוחר יותר של דבקות תאי גזע איתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל בתאי גזע שכותרתו ניאון,מומס ב200 μl PBS, ב0.4 x 10 6 תאים לכל הזרקה, עם סך של חמש זריקות רצופות ניצול צנתר עורק הירך ומזרק 1 מיליליטר. לנער בזהירות את מדגם התא לפני הזריקה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע שיא מתגלגלים מייד לאחר הזרקת תאים, ובכך מגדירים את &quot;גלגול&quot; כהפחתה של יותר מ -50% מתא מהירות לאורך אנדותל הציפוי הפנימי בשילוב עם טיפוסי סלולארי &quot;מקל ולשחרר את&quot; תנועות. לבצע ספירה של תאי גזע מתגלגלים וכל תאי הגזע עוברים מרחק venular מוגדר מראש במהלך 1 דקות של ההתבוננות הבאה כל זריקה. כמות מתגלגל בתאי הגזע באה לידי ביטוי כאחוז מכל התאים שעוברים. אל תסמכו תאים מציגים תופעות קשירה קצרות אקראיות כמו תאים מתגלגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזרקת התא האחרונה לקבוע את מספר תאי גזע חסיד בחוזקה על ידי ספירה ולהביע את הסכום ביחס למשטח אנדותל המחושב של הדואר שש venules המוגדרת מראש (π x אורך x קוטר) כתאים חסיד / 2 מ&quot;מ. הידבקות משרד נחשבת כאשר אין תנועת תא היא לגילוי ל30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת מיקרוסקופיה intravital להסיר בזהירות את שריר Cremaster ולאחסן אותו בהתכתבות לצורך הניתוח מאוחר יותר (אימונוהיסטוכימיה או ביולוגיה מולקולרית). להקריב את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. הניתוח של הקלטות מיקרוסקופיה intravital לכימות של מתגלגל תאי גזע והידבקות אנדותל משרד, כמו גם פרמטרים המודינמיים כלי הדם, כגון מהירות דם אדום תא (מ&quot;מ / השני), אונייה שאורכה (מיקרומטר), קוטר כלי (מיקרומטר), שער מניית קיר (שניות -1); יש לבצעו במצב לא מקוון על ידי חוקר העיוור כדי טיפול רקמות ניסיוני בהתאמה ניצול תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874(2011).</li>
<li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha%2FCXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit%2B+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

כל הניסויים בבעלי החיים, שנערכו לכתב היד הזה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המקומית. החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

<html> מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital מאפשר הדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע. מודל שריר Cremaster הוא שימושי במיוחד, שכן חשיפת microsurgical והדמית intravital טכניקות כבר מבוססת היטב במהלך המחקר על אינטראקציות יקוציט-האנדותל ורכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמים באופן סלקטיבי לרקמת המטרה על ידי טכניקת superfusion פשוטה. בשל היעדרם של חפצי תנועה ורעש בתמונה חמורה, דגם מיוחד זה, בהשוואה להגדרות intravital-מיקרוסקופית אחרות, מספק תנאים אופטימליים להדמיה של ...

מטרתו של המאמר הנוכחי היא לתאר את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital (IVM) להחיל על זרימת דם Cremaster עכבר להתבוננות וניתוח ישירים של נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי. התחדשות רקמות ואיברים המבוסס הקונספט הנוכחי של תאי גזע כרוך הביות של תאי גזע שמקורם במח עצם לרקמות נפצעו 1. צעד חיוני לנדידת תאי גזע מוצלחת כולל גזע אינטראקציה עם תא האנדותל המקומי בתוך האיבר הפצוע ואחרי הגירת transendothelial וסופו של דבר האיבר engraftment 2. ניתוח Intravital של תאי גזע אלה - אינטראקציות תא האנדותל מהווה פרמטר אידיאלי לכימות של תגובת משובי תאי גזע מבוססת בהגדרות pathophysiological שונות in vivo. יתר על כן, זה נראה מתקבל על הדעת, כי, בעתיד, ניתוח intravital של יכולת הנדידה של תאי גזע הספציפי populations בתוך סביבות microcirculatory סטנדרטיות, עשוי להיות מיושם לפני קידום אוכלוסיות אלה לבדיקה קלינית נוספת. מיקרוסקופיה Intravital פותחה בתחילה עבור התצפית וכימות של אינטראקציה תא יקוציט-אנדותל in vivo בתחום המחקר דלקתי 3. הקלטות מוצלחות הראשונות של מחקרי מיקרוסקופיה intravital דווחו על ידי Cohnheim כבר במאה ה -19, לומדות לשון וmesenteries צפרדעים תחת מיקרוסקופ אור 4. מאז השימוש הראשון שלה IVM עבר פיתוח טכני אדיר והיום רכיבים חיוניים מסוימים יוצרים תנאים מוקדמים על מנת לבצע IVM כמותיים: הכנות (i) רקמה המאפשרות גישה אופטית, (ii) בדיקות מולקולריות שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ, (iii ) מיקרוסקופ המחובר למערכת גילוי וכן (iv) ניתוח מערכות מחשב מבוסס שיכול לחלץ פרמטרים של עניין מנתוני התמונהלהגדיר 4. מגוון רחב של הכנות רקמות כבר הציג ללימודי IVM כולל mesenteries והכבד של העכבר והחולדה 5, תאי skinfold הגב של עכבר ו6 אוגר, אוזן הארנב וכיס הלחי אוגר עד כמה שם. עם זאת, בחלק הבא אנו נתמקד בשריר Cremaster העכבר, המייצג את הרקמה אידיאלית לתצפיות intravital, כהכנה להדמיה הן אפשריות על ידי הליך כירורגי סטנדרטי היטב, ובאופן כללי אין בעיות של חפצי תנועה להתרחש. הכנת השרירים Cremaster הפתוחה בוצעה בפעם הראשונה ב1970s ידי אאז ועמיתיו 7. תאר במקור עבור חולדות, זה כבר אימץ בהצלחה גם לעכבר 8. לאחר המחקרים קודמים התמקדו בעיקר באינטראקציות יקוציט עם קיר הכלי, הקבוצה שלנו הציגה לאחרונה את הכנת השרירים Cremaster העכבר כvaluaכלי ble להדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע בתוך microenvironment מוגדר 9. אוכלוסיות תאי גזע שונות נחקרו ניצול מודל זה, כולל c-kit עכברי + בתאי גזע במח עצם ותאי גזע mesenchymal, כמו גם תקליטורי אדם תאי גזע במח עצם 133 + 10-12. בעקבות בידוד תא ממח עצם מתורם וניאון תיוג להדמיה, תאי הגזע מיושמים באופן סלקטיבי לזרימת דם Cremaster ניצול הזרקת עורקים דרך עורק הירך, ובכך להימנע מכל מלכודת תא בתוך איברים מרוחקים. יתר על כן, מודל שריר Cremaster שימושי במיוחד מאז כמוקינים שונים שעלולים להיות מתווכים נדידת תאי גזע מקומית בתוך ההגדרות המתאימות, ניתן למריחה על עור לרקמות המטרה על ידי טכניקת superfusion פשוטה.

<table><tbody><tr><td>קרבוקסי-פלואורסצאין דיאצטט סוקסינימידילסטר (CFDA)</td><td>Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>רודמין 6 גרם (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, מינכן, גרמניה</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>קטמין (קטנסט)</td><td>פייזר, ברלין, גרמניה</td><td>לא זמין Xylacin</td><td></td></tr><tr><td>(Rompun)</td><td>באייר, לברקוזן, גרמניה</td><td>לא זמין לרכישה</td><td></td></tr><tr><td>פוספט של Dulbecco - מי מלח חומציים (PBS)</td><td>PAN Biotech, איידנבאך, גרמניה</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופית intravital של זרימת הדם בשריר העכבר cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

בעידן של פרוטוקולי יישום תא intravascular בהקשר של טיפול בתאי משובי, המנגנונים של נדידת תאי גזע לרקמות nonmarrow לא הובהרו לחלוטין. אנו מתארים כאן את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital להחיל את זרימת דם Cremaster עכבר לניתוח של נדידת תאי גזע היקפית מח עצם בגוף חי. מיקרוסקופיה Intravital של Cremaster מ &#39;כבר הציגה בעבר בתחום של מחקר דלקתי לתצפית ישירה של האינטראקציה יקוציט עם האנדותל של כלי הדם. מאז גזע היקפי מספיק ונדידת תאי אב כוללים שלבים ראשוניים דומים של מתגלגל לאורך והידבקות משרד בהאנדותל המצפה את זה מתקבל על הדעת להחיל את מודל Cremaster מ &#39;לתצפית וכימות של האינטראקציה של תאי גזע מנוהלים intravasculary עם האנדותל. כרכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמים באופן סלקטיבי כדי לא היעדנושא על ידי טכניקות superfusion פשוט, זה אפשרי להקים תנאים מוקדמים microenvironmental חיוניים, לגיוס תאי גזע ראשוני להתקיים באורגניזם חי מחוץ למח העצם.

באופן כללי, אינטראקציה של תאי גזע הוזרקה ישירות או אב עם האנדותל של כלי הדם בתוך זרימת דם השרירים Cremaster הוא אירוע נדיר ומתרחש באופן בלעדי בvenules postcapillary (קוטר: 30-80 מיקרומטר). בשל מתגלגל תיוג הקרינה ותאי גזע חסיד בחוזקה ניתן לכמת באופן ברור בהפרדה ממחזור leucocytes אנדוגני בvenules נצפתה (איור 2). תנאי microcirculatory מיוצגים על ידי זרימת דם המהירות ושיעור גזירה קיר בדרך כלל לא היו ...

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ &#39;מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להמחיש אינטראקציות בין תאי גזע לתאי אנדותל in vivo. מטרה זו מושגת תחילה על ידי החדרת קטטר לעורק הפמורלי בבעל חיים תחת הרדמה, כדי להשיג גישה תוך-עורקית. בשלב השני, השריר הכרומטי מכין באופן כירורגי עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיה.לאחר מכן, מזריקים את אוכלוסיית תאי הגזע הרלוונטית באמצעות קטטר בעורק הפמורלי. בסופו של דבר, ניתן להדמיות ולכמת את האינטראקציות בין תאי הגזע שהועברו באימוץ לבין האנדותל של מיקרו-סירקולציית השריר הראשי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד מוסדרת הגירתם של תאי גזע המיושמים למטרות טיפוליות בתוך אורגניזם חי?לפני תחילת המיקרו-כירורגיה, יש להכין קטטר המחובר למזרק של 1 ml עם 0.9% sodium chloride. לאחר מכן, יש לגלח בעדינות את החלק הקדמי של השכין הימני, כמו גם את הירך והמפשעה הימנית של עכבר זכר הרדום השוקל 20 עד 25 mg. יש לאסוף את כל השיער הרופף באמצעות מקלון צמר גפן לח, ולאחר מכן להניח את העכבר כאשר צדו הבטני פונה כלפי מעלה על במה לצפייה מתוכננת במיוחד העשויה מפלקסיגלס, המורכבת מלוח בסיס ומלוח שני בקצה התחתון של לוח הבסיס להגבהה של שתי הרגליים האחוריות והשכין.לאחר קיבוע הרגליים באמצעות כיסוי אלסטי, הנח את משטח העבודה על פד חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף בעל החיים ב-37 °C. לאחר מכן, באמצעות הגדלה של 10 עד 16 פעמים, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה ובמספריים כדי לבצע חתך ראשוני בירך ימין, קדמית לכלי הדם הפמוריים, מהברך ועד למפשעה. זהה את העורק הפמורי ועקוב אחריו פרוksימלית, תוך ניתוק העורק מהרקמות הרכות שסביבו.לאחר מכן, באמצעות כהייה תרמית, זהו וחתוך ענף עורקי גדול המוביל לאשכולית השמאלית. מקם תפר קיבוע (stay suture) מסוג prolene 6-0 באופן שטחי באשכולית השמאלית. לאחר מכן, זהה ובצע כהייה תרמית לענף העורקי הגדול העובר מדיאלית בירך.בשלב הבא, באמצעות מתיחה עדינה, קשרו את העורק הפמורלי (עורק הירך) בחלק הדיסטלי של הירך הימנית, ולאחר מכן הניחו תפר סביב העורק הפמורלי הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר למרכז הגוף של בעל החיים. כעת, צרו קשר רפוי סביב העורק הפמורלי, אך אל תקשרו אותו. לאחר מכן, הפעילו מתיחה עדינה על התפר כדי ליצור כיפוף (kinking) של העורק.לאחר יצירת הקיפול, השתמשו במספרי מיקרו כדי לקצץ בזהירות את העורק, תוך הקפדה מיוחדת על מניעת פגיעה בווריד הפמורלי. לאחר מכן, הכניסו את המיקרוקתטר שהוכן מראש אל תוך החתך. שחררו בזהירות את הקיפול כדי להקל על מע passage של הקטטר.זרימת דם עורקית צריכה להיות גלויה באופן מיידי בתוך הקתטר. התקדמו באיטיות עם הקתטר מספר מילימטרים מעבר לכיפוף הקודם. לאחר מכן, קשרו את הליגטורה שהוכנה כדי לקבע את הקתטר.כעת שטפו בעדינות את הקטטר באמצעות הנתרן כלורי ולאחר מכן שאבו את התמיסה כדי לאשר את מיקומו הנכון של הקטטר. השתמשו בסרט הדבקה כדי לקבע את הקטטר בצורה בטוחה יותר למשטח הניתוח. לאחר שהקטטר קובע כראוי והוזז הצידה, חתכו את העור והפסציה מעל ההיבט הוונטרלי של השקית השמאלית הימנית.יש להקפיד לא לגעת ברקמה שמתחתה עם שום מכשיר. הרחב את החתך עד לקפל המפשעה ובזהירות עד לקצה הדיסטלי של השכיך. לאחר מכן, הפר בעדינות את הרקמות הרכות והרקמות החיבריות שמתחתיהן מעל שק הקרמסטר (cremaster sac) מבלי לגעת ברקמה עצמה.לאחר מכן, הניחו תפר קיבוע מסוג 6-0 Prolene בקצה הדיסטלי של השריר המקריב (cremaster) כדי למתוח מעט את השריר. לאחר מכן, משכו בעדינות את השריר כלפי מטה וקדימה כדי להסיר את רקמת הרכים שנותרה מתחת לשקיק השריר. לאחר ההפרדה המלאה מרקמת החיבור, השתמשו במספריים כדי לפתוח את שקיק השריר המקריב בקצה הקרניאלי, והרחיבו את החתך מפתיחה זו עד לקצה הדיסטלי של השריר.לאחר צריבה תרמית של הכלי הדק המחבר את האשך לשריר ה-cremaster, השתמש במספריים כדי לחתוך את החיבורים הנותרים בין השריר לאשך. ה-cremaster הפתוח יונח כעת באופן שטוח על הבמה. כעת מקם ארבע תפרי Stay מסוג prolene 6-0 בקצוות הרקמה וקבע אותן באמצעות הכיסוי האלסטי.כדי להפריש את רקמת שריר הקרמסטר (cremaster) מהנקודה זו ואילך, השתמש במזרק של 1 מיליליטר כדי להרטיב את הרקמה באופן רציף עם PBS. לאחר שההכנה נחה במשך 15 דקות, הזרק 0.05 עד 0.1 מיליליטר של 1% rhodine dextrin דרך העורק הפמורי השמאלי להגברת הניגודיות של מיקרו-כלי הדם. כעת, העבר את העכבר ואת הבמה תחת התקן CCD (charge coupled device).מיקרוסקופ פלואורסצנציה המחובר למצלמה, ששונה לצורך תאורת epi, תוך נקיטת זהירות מיוחדת כדי לא להזיז את הקטטר של העורק הפמורלי. לאחר כיוון עדשת השקיעה במים (water immersion objective) להשגת ויזואליזציה מספקת של המיקרוסירקולציה ב-chma, הוגדרו באופן סטוכסטי שישה מקטעי ES פוסט-קפילריים לצורך ניתוח מאוחר יותר של היצמדות יציבה של תאי גזע. לאחר מכן, יש למלא מזרק של 1 mL ב-200 µL של תאי גזע פלואורסצנטיים מתרומת מח עצם שסומנו מראש.הקישו בעדינות על המזרק כדי לחדש את השעיה תאי התליה, ולאחר מכן הזריקו את התאים דרך הקטטר הפמורלי בהזרקות של 40 µL, לסך הכל חמש הזרקות רצופות. תיעו את גלגול תאי הגזע מיד לאחר הזרקת התאים. הגלגול יוגדר כהפחתה של למעלה מ-50% במהירות התא לאורך הריפוי האנדותליאלי, בשילוב עם תנועות ההדבקה והשחרור האופייניות לתאים.לאחר השלמת המיקרוסקופיה התוך-חיה (intra vital microscopy), הסר בזהירות את שריר הקרמסטר (cremaster muscle) ואחסן אותו לצורך ניתוח מאוחר יותר. באופן כללי, האינטראקציה של תאי גזע או תאי פרוגניטורים שהוזרקו ישירות עם האנדותל העורקי במיקרו-סירקולציה של שריר הקרמסטר היא אירוע נדיר, ומתרחשת בלעדית בורידי הפוסט-קפילריים בזכות הסימון הפלואורסצנטי. ניתן להבחין בבירור בין התאים המתגלגלים, כפי שמוצג על ידי חץ השחור, ובין תאי הגזע הדבקים בחוזקה, כפי שמוצג על ידי החצים הלבנים, לבין הלוקוציטים אנדוגניים במחזור הדם בורידים.תנאי המיקרו-סירקולציה, המיוצגים על ידי מהירות זרימת הדם וקצב גזירת הדופן, בדרך כלל אינם שונים באופן משמעותי בין קבוצות הניסוי השונות שקיבלו טיפולים שונים בכימוקינים. טיפול מקומי של רקמת שריר ה-ker master בכימוקינים שונים או במתווכים של תגובה דלקתית. לדוגמה, stromal cell derived factor one alpha או tumor necrosis factor alpha מסוגלים לדמות תנאים סביבתיים זעירים ספציפיים.תנאים אלו מגבירים את האינטראקציות בין תאי הגזע לתאי האנדותל בדרגות שונות, בהתאם לכימוקין או למתווך הספציפי שיושם ולאוכלוסיית תאי הגזע שהוזרקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובהB לגבי האופן שבו ניתן להדמות אינטראקציות בין תאי גזע לתאי endothelial in vivo באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy) של מיקרוסירקולציה בשריר CreER.

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה צדדי חדש להסתכלות של microcirculation מוצג. זה נחשב מתאים תצפית ארוכת טווח, ועל בשילוב עם התערבויות ביולוגיות pharmacophysiological או המולקולרית.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

הכנת רקמות מתואר עבור להדמיה של מניפולציה ניסויית בזרימת הדם החי. בעכברים מורדמים זכר, רזה, שרירי מאוד vascularized cremaster מוכן מיקרוסקופיה intravital ללמוד רשתות כלי הדם כולל arterioles, נימים venules. הכנה זו היא מותאמת בקלות לחולדות ואוגרים.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

מיקרוסקופ דיגיטלי intravital epifluorescence של venules postcapillary ב microcirculation cremasteric היא שיטה נוחה להבנה טובה של אינטראקציה...

בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

ומונוציטים הם מתווכים חשובים של arteriogenesis בהקשר של מחלת עורקים היקפית. פרוטוקול זה באמצעות מטריקס קרום המרתף דמוי מיקרוסקופ intravital, חוקר אנגיוגנזה ביות ו הקשורות הגידול מונוציט לאחר ההזרקה מונוציט במודל מאתר מצדו בעורק הירך.

מיקרוסקופ intravital של יונת מונוציט, הקשורות הגידול אנגיוגנזה במודל מאתר של מחלת עורקים היקפית

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

למד מיקרוסקופיה אינטרוויטלית של שריר הכרמסטר בעכבר לניתוח אינטראקציות בין תאי גזע לתאי אנדותל בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת כימות נדידת תאי גזע היקפיים ומסייעת להבנת מנגנוני הנדידה ברפואה רגנרטיבית.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

גלה סרטונים נוספים