Name: בחינה של דרוזופילה Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: חקור שיטה מהירה לקביעת זחלי דרוזופילה לצורך הדמיית תאי קצה קני הנשימה במיקרוסקופ אור. השיטה מאפשרת ניתוח כמותי של מורפולוגיה תאית וזיהוי הבדלים בין תאים פראיים למוטנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג&#39;יליאן סטנפילד להערות על כתב היד. טאג&#39; נתמך על ידי אוניברסיטת יוטה הגנטיקה הדרכה גרנט T32-GM007464 מNIGMS NIH.

1. דור פסיפס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלב גנטי האמבטיה w FRT 19 א: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, כטב&quot;מ-GFP (זכרים) X * FRT 19 א / אל (נשים), שבו * מייצג את המוטציה כדי להיבחן. הערה: הגדרה לעבור לפחות יום אחד לפני הניסוי, כמו זו מאפשרת חיות להזדווג כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חילוני: צלב העברה לבקבוקונים לטוס-מזון עם כתם קטן של רסק שמרים טרי הונח על כלי התקשורת. לאפשר לשכבת במשך שעה 1 ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח: חיות העברה מבקבוקון מראש להניח לבקבוקון טרי עם כתם קטן של רסק שמרים טרי. לאפשר להניח ל6 שעות ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוגרים העברה בחזרה מראש להניח בקבוקון לאחסון ושימוש בניסויים הבאים. הלם באופן מיידי חום הבקבוקון המכיל 0-6 שכב עוברים ישנים HR ל45 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, באמבט מים במחזור. הערה: פני השטח של המזון צריך להיות מתחת למפלס המים כדי לאמת את כלעוברים כראוי לחמם בהלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוקונים המומים חום של 25 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים עד שזחלי instar שלישי להתחיל לנדוד. </li></ol> 2. מסך למען בעלי חיים פסיפס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר בעדינות להרים זחלים שלישי instar-נודדים מן הצדדים של הבקבוקון ולהכניס אותם לתוך גליצרול 100% צוננים בצלחת פלסטיק קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ לנתח הגדלה גבוה מצוידים באופטיקה ניאון. זהה את הזחלים עם ביטוי פסיפס של תאים שכותרתו fluorescently קונים נשימה. בדרך כלל, זה יכול להיעשות ב10-הגדלת 20X. </li></ol> 3. קיבוע חום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר לבחור בקפידה חיות פסיפס מתוך הצלחת ומניחה בירידה של 100% גליצרול טרי בשקופית זכוכית לבנה מ&quot;מ 75x25x1 מיקרוסקופ. הערה: ניתן להציב בעלי חיים רבים בירידה (איור 1 א). יכולים גם להיות ממוקמים בעלי חיים בטיפת גליצרול ישירות על גבי coverslip,אך יש להקפיד במהלך קיבעון (שלב 3.2), כמו החיות תהיה לחמם במהירות רבה והוא יכול להיות מעל קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות זכוכית מקום על 70 מעלות צלזיוס עד לגוש חום החיות רק להפסיק לנוע, לא יותר מ -20 שניות לשקופית, ו -10 שניות ללהחליק את מכסה (איור 1). בעלי חיים להתפתל בהתחלה, אבל לעצור ולהיות נוקשה ומוארך פעם אחת מת. הערה: חשיפה לחום ארוכה מדי תפגע בסניפי מסוף ולומן, כמו גם להפוך את אות ה-GFP עמומה ומפוזרת. ליעילות אופטימלית מומלץ לי הגוש החום באותו החדר כמו מיקרוסקופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר בזהירות לכוון את כל הזחלים בירידה בכיוון אחד, כך שכל הזחלים בשקופית מקבילים בכיוון אחד לשני (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות מכסה זכוכית מייקר 18x18mm על גבי זחלים (או להפוך את coverslip לשקופית זכוכית) ולמנוע בועות יוצרים (1D איור). הערה: ייתכן שלא תשקר coverslip בדיוקדירה על זחלים, זו לא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי תמונה בתוך 30 דקות. תאי מסוף קבועים חום יהיו לבזות ואות ה-GFP תהפוך להיות מאוד מפוזרת. </li></ol> 4. בתחום ההדמיה vivo של תאי קני Terminal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית על הבמה של stereomicroscope מתחם. באמצעות מטרה לאתר 5X שני גזעי הגב המקבילים ריצה מקדמית לאחוריים על פני השטח הגבי של בעל החיים (איור 1F). לאתר את שני תאים סופניים גב, באופן ישיר בין שני הגזעים הגבי. זה עוזר לזהות את הקטע המתאים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת בכיוון, לסובב את החיות לתאים סופניים רצויים תמונה. כדי לעשות זאת, בזהירות לדחוף את coverslip על הקצה עם המלקחיים בניצב לציר הארוך של הזחלים, מגלגלים את הזחלים מתחת coverslip (האיורים 1E ו1G) באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת תאי המסוף המתאים היא קריטית לתוצאות עקביותוהשוואות בין מוטציות. (FB) תאים סופניים סניף השומן בגוף נמצאים בסמוך לגזע הגבי, לרוחב קו האמצע בקלות. התאים סופניים לרוחב קבוצת G (LG) הם מצאו בקלות והם ממוקמים רק לרוחב של קו האמצע הגחון (איור 1H). הערה: ב( TR10) המגזרים הקדמיים ביותר (TR1) ואת אחורי של תא הסדר מסוף הוא מסתעף ממגזרים אחרים. אנו מנתחים רק תאים סופניים במגזרי TR2-Tr9. יש תאים סופניים הגבי דפוס הסתעפות סטריאוטיפי יותר מאשר תאים סופניים קנו נשימה אחרות. זה יכול להיות תלוי באותות נוספים, שאינו תא אוטונומיים, וזה צריך להילקח בחשבון כאשר מחליטים אם לכלול אותם בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתא מסוף עניין זוהה, ללכוד תמונה באמצעות ההגדלה הרצויה, בדרך כלל 10X או 20X הוא הטוב ביותר (איור 2 א). הערה: בשל דפוסי הסתעפות משתנות, מנסה ללכוד תמונות שכוללות כמה שיותר סניפים וטיפים לסניף ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להזיז את הבמה, לכבות את הקרינה ולהדליק את האור מועבר ללכוד תמונת brightfield של אותו התא ומישור מוקד (איור 2). הלום יהיה דמיינו כמו קדרות מנוגדת בתוך חלל תא המסוף. אם מתכנן על סניפים לכמת סלולריים מסוף ולומן, לאסוף מספר רב של תמונות במטוסי מוקד מרובים של כל תא מסוף. </li></ol> 5. ניתוח וכימות של מורפולוגיה של תאי מסוף באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות הניאון וbrightfield באמצעות ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">(http://rsb.info.nih.gov/ij/)</a> התוספת NeuronJ <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">(http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי &quot;הוסף העתקים&quot;, באופן ידני לאתר את הסניפים ולומן של תא הטרמינל כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באפשרות &quot;תווית ההעתקים&quot;, שינוי שם וRecolor להקצות לכל קו בתוך עקבות ייעוד ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באפשרות &quot;הגדר הפרמטרים&quot;, לשנות את עובי הקו 6-10 512x512 פיקסלים (לתמונות המתקבלות מהמצלמה הדיגיטלית מחוברת למיקרוסקופ המתחם. למצלמות ברזולוציה גבוהות יותר או נמוכות יותר, ברוחב פיקסל צריך להיות מדורגת כראוי), תוך שימוש בכל הגדרות ברירת מחדל אחרות, ולבחור &quot;אישור&quot;. לאחר מכן להשתמש בכלי &quot;הפוך תמונה&quot; לקחת תמונה. בחר &quot;צייר עקבות&quot; כדי לקבל תמונת מצב של העקבות שניתן לראות בצד על ידי צד עם מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;מדוד ההעתקים&quot; ובחר את סוג המעקב (כלומר שסניפים למדידה המבוססים על הייעודים הספציפיים שהוקצו בשלב 5.3). בשלב הבא, בחר באפשרות &quot;תצוגת מדידות מעקב&quot; ו &quot;מדידות קודמות ברור&quot; ולאחר מכן לחץ על &quot;הפעל&quot;. זה יהיה לייצר גיליון אלקטרוני המכיל את השם, תווית, אורך (בפיקסלים), ונתונים אחרים לתמונה. לאחר מכן ניתן לשמור את הנתונים כגיליון אלקטרוני של Microsoft Excel עבור סטטיסטי נוסףניתוח. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

טכניקת קיבוע החום המתוארת כאן היא כלי מהיר ונוח לתאים סופניים קונים נשימת הדמיה תסיסנית זחל. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לבחון את ההסתעפות ודפוס לומן של wild-type תאים. קנו נשימת תאים להביע GFP, מונע על ידי האמרגן הספציפי לקנה הנשימה הנשימה, יכולים להיות בקלות דמיינו דרך ציפורן הזחל לאחר קיבוע חום. את דפוסי הסתעפות מסוימים של תאי מסוף בודדים, כמו גם אלה של לומן מלא באוויר, יכולים להיות במהירות ודמיינו שנמדדו באמצעות שיטה זו. טכניקה זו יכולה גם להתבצע על זחלי ...

צורת תא היא קריטית לתפקוד של תאים בודדים בתוך האורגניזם, כמו גם תאים שמתפקדים כחלק מאיבר או רקמה. אנו משתמשים בתאים תסיסנית קנו נשימת מסוף, מרכיב של מערכת הנשימה החרקים, כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המשתתפים בשליטה על שני סוגים נשמרים של מורפולוגיה תאית: היווצרות צינור (lumenogenesis) והסתעפות. תאי מסוף נמצאים בקצוות של רשת מסועף של צינורות שפונקציות כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות 1 ויש לי מורפולוגיה קנים משוכללת אשר תלוי במסלול איתות FGF שהוא נשלט על ידי רמות חמצן מקומיות בתוך יעד רקמות 2. ענפים סלולריים מסופים צינורות דקים, עם לום subcellular מלאי גז המתרוצץ בכל סניף. הארכיטקטורות שונות של תאים הסלולריות מסופים, יחד עם קלות שבה ניתן לבצע ניתוח גנטי בדרוזופילה, להפוך את התאים האלה F מודל מצויןאו חקר מנגנונים של תולדה סלולרית, מסתעף, והיווצרות צינור תוך תאית. תאי מסוף הוכיחו מודל שימושי להבנת חלק ממסלולי האיתות המובילה להתמיינות תאים מסועפת, תולדה, והתבגרות 2-4. באמצעות מערכת זו משוחדת, מסכי קדימה גנטיים למוטנטים המורפוגנזה סלולריים כבר בוצעו, מניב תובנות מנגנוני שליטה תא צורה 5,6. לדוגמה, מסכי אלה חשפו כי RabGAP ספציפי נדרש לקוטביות cytoskeletal וסחר בשלפוחית ​​בהיווצרות ומיצוב 7 לום; שהידבקות integrin בתיווך נדרשת ליציבות ענף 8, וכי חלבוני PAR-קוטביות אפיתל לווסת את סחר קרום מקוטב נדרש עבור שניהם לום היווצרות 9 הסתעפות ו. מחקרים אחרים בתאי מסוף הראו כי הצטברות אקטין סימטרית וארגון microtubule נדרש להתארכות תא וlumenogenesis <sעד&gt; 10. לפיכך, מנגנוני תאים שונים, נשמרים ביולוגיים יתרמו להמורפוגנזה תא מסוף. כאן, אנו מתארים שיטה לתקן את הזחלים תסיסנית שלישי instar-שלמים לניתוח של מסוף היווצרות לום תא הסתעפות ובמהירות. פרוטוקול זה גם יכול להתבצע על בעלי החיים instar גם ראשונים והשני. מפתח לטכניקה זו היא היכולת לדמיין תאי מסוף שכותרתו גנטית על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי ישירות דרך ציפורן הזחל של בעלי חיים שלמים. מאז הליך זה אינו דורש שום מניפולציות לאחר קיבוע, כגון צביעת נוגדנים, כדי לבחון את התאים, הוא גם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה, כולל בדיקות גנטיות או בסמים. ביטוי חלבון פלואורסצנטי חושף את המבנה של הסניפים המלאים cytoplasmically. היווצרות צינור יכולה להיות במעקב במקביל באמצעות מיקרוסקופ brightfield לזהות לום גז מלא, העומד בניגוד לסביבת נוזל המילוירקמות ed. בפרוטוקול זה כלל הוא השיטה ליצירת פסיפסים גנטיים המבוססים על מערכת MARCM 11, כדי לייצר תאים סופניים מוטציה הומוזיגוטים שכותרתו עם חלבוני ניאון בבעלי חיים בדרך אחרת ללא תווית. זה הכרחי, שכן תאים סופניים לפרט המבנים המורכבים שלהם רק בשלב מאוחר יחסית בפיתוח; פסיפסים גנטיים מאפשרים מעקף של דרישות הגנים ברקמות אחרות מוקדמת יותר בפיתוח. . כדי ליצור שיבוטים MARCM, קנה נשימה מסומנות באמצעות מנהל ההתקן הספציפי לקנה נשימת הנשימה (BTL) 12 מתוארת כאן הוא הפרוטוקול לכרומוזום X תסיסנית; לכרומוזומים אחרים, ניתן להשתמש בהליך דומה, עם חומרים כימיים גנטיים מתאים לכרומוזום להיות בדק. כאן, קנה נשימה מתויגת על ידי ביטוי של GFP cytoplasmically מקומי, אבל ההליך עובד באותה מידה גם עם ביטוי של חלבוני ניאון אחרים, כגון DsRed. בנוסף, יש לנו כלל שיטה לכמת דפוסי הסתעפות והיווצרות לומן בתאים סופניים, המבוסס על שיטות שפותחו לאפיון דפוסים עצביים 13 סניפים. סוג זה של נתונים כמותיים יכול להיות קריטי בתפקיד ההבחנה המדויק של הגנים בתהליך ההסתעפות או lumenogenesis, כמו גם לאפשר להשוואה ישירה בין מוטציות שונות 9.

<table><tbody><tr><td>סטודנט Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 מיקרוסקופ מנתח (או שווה ערך)</td> <td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 מיקרוסקופ מורכב (או שווה ערך)</td> <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>מצויד ב-AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, סט מסננים 38HE</td></tr><tr><td>100% גליצרול</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr>גנוטיפ מלאי <td></td><td></td><td>זבוב</td><td>: w FRT19A tub: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>מלאי</td><td></td><td></td> זבוב <td>גנוטיפ: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

צורת תא היא קריטית לתפקוד תא. עם זאת, למרות חשיבותה של מורפולוגיה של תאים, מעט מאוד ידוע על אופן בו תאים בודדים ליצור צורות ספציפיות. תאים סופניים קנו נשימה תסיסנית הפכו מודל גנטי רב עוצמה כדי לזהות ולהבהיר את התפקידים של גנים הנדרשים ליצירת מורפולוגיות הסלולר. תאי הדקים הם מרכיב של רשת צינורות מסועפת, המערכת לקנה הנשימה המתפקדת כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות. תאי Terminal הם מודל מצוין לחקר שאלות של צורת תא כפי שהם בעלי שתי ארכיטקטורות סלולריות שונות. ראשית, יש תאים סופניים מורפולוגיה קנים משוכללת, בדומה לתאי עצב מורכבים; שני, סניפי מסוף סלולרי נוצרים כדקים צינורות ומכילים תאי לום קרום הנכנס. ניתוח כמותי של מספר מסוף תא סניף, ארגון סניף וסניף צורה פרטנית, ניתן להשתמש בו כדי לספק מידע על תפקידו של mech הגנטי הספציפיanisms בהתהוות של תאים מסועפים. ניתוח של היווצרות צינור בתאים אלה יכולים לחשוף את המנגנונים נשמרים של tubulogenesis משותפים לרשתות צינורי אחרות, כגון כלי דם החוליות. כאן אנו מתארים טכניקות שיכולים לשמש כדי לתקן במהירות, תמונה, ולנתח את שני דפוסי הסתעפות והיווצרות תאי צינור במסוף בתוך זחלי דרוזופילה. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לנתח תאים סופניים בחיות הבר מסוג ומוטציה גנטיים, או פסיפסים. בגלל היעילות הגבוהה של פרוטוקול זה, הוא גם מתאים מאוד לגנטי, RNAi מבוסס, או מסכי סמים במערכת תסיסנית קנה הנשימה.

תוצאות מוצגות באיור 2. קבוצה אחת לרוחב (LG) תא מסוף מציגה הסתעפות subcellular נרחבת (דמיין ידי GFP;) ולום subcellular מלאי גז פועל באמצעות כל אחד מהסניפים (דמיינו ידי מיקרוסקופ brightfield; ב &#39;). תמונות אלו נאספו מזחל L3 פסיפס, שנוצרו באמצעות מערכת MARCM המתוארת בסעיפי 1 ו -2, ונקבע חום וצלם, כאמור בסעיפים 3 ו -4. לוחות C &amp; D להראות שמץ NeuronJ שנוצר, כאמור בסעיף 5, של הסניפים ולומן בהתאמה מהתמונות המוצגות בA &amp; E &amp; B. פנלי F להראות את המיקום של השו...

כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מיקרוסקופ אור של תאים סופניים בקנה נשימה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים. שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של ענף ומורפולוגיה לום בבעלי חיים שלמים ויהיה שימושי עבור ניתוח של מוטציות או מסכים למוטציות המשפיעות על התפתחות תאי מסוף בודדות.

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא קיבוע מהיר של זחלי דרוזופילה (drosophila) שלמים, במטרה לדמות את המורפולוגיה של ענפים וצינורות בתאים טרמינליים של קשקש (tracheal terminal cells). הדבר מושג תחילה על ידי יצירת תאים טרמינליים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי הומוזיגוטית בבעליים פסיפס גנטיים (genetically mosaic). השלב השני של הפרוצדורה הוא איסוף הזחלים הפסיפסיים וקיבועם באמצעות חום.השלב השלישי הוא דימוג של תאי קצה מסומנים בבעלי חיים מקובעים, תוך שימוש בביטוי GFP לצפייה בענפים ובמיקרוסקופיה בשדה בהיר לצפייה בצינורות. השלב האחרון הוא כימות המורפולוגיות של תאי הקצה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתוצאות כדי להבחין ולסווג מורפולוגיות תאיות מובחנות של תאי קצה מסוג בר (wild type) ומסוג מוטנטי.היתרון המובהק של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון קיבוע כימי, הוא שקיבוע זה מהיר ביותר, ולכן ניתן להשתמש בו לאנליזה בשקיפות גבוהה של תאי קצה קשייים (tracheal terminal cells). בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שבחירת זחלים בשלב L3 וקיבועים מהירים שלהם לשמירה על המורפולוגיה דורשים ריכוז וזהירות. ליצירת זבובים פסיפסים.יש להשתמש בטכניקת Mark M עם נקבות הנושאות את המוטציה הנבדקת. הגדירו את ההכלאות בבקבוקוני טרום-הטלה (pre lay vials) עם מריחה של משחת שמרים טרייה, ואפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך שעה אחת בטמפרטורה של 25 °C. לאחר מכן, העבירו את הזבובים מבקבוקון טרום-ההטלה לבקבוקון חדש עם משחת שמרים טרייה ואפשרו להם להטיל ביצים במשך שש שעות בטמפרטורה של 25 °C.לאחר שש שעות, העבירו את הבוגרים בחזרה למבחנות טרום-הטלה (pre lay vials) לאחסון ולשימוש מיידי בניסויים עוקבים. החילו הלם חום למבחנות ההטלה שנאספו בבמבּת מים עם סירקולציה למשך 45 דקות בטמפרטורה של 38 °C; על פני השטח של המצע להיות מתחת למפלס המים כדי להבטיח שכל העוברים יעברו הלם חום כנדרש. כעת, דגרו את המבחנות שעברו הלם חום בטמפרטורה של 25 °C למשך ארבעה עד חמישה ימים עד להגעה לשלב הדרג השלישי של הזחלים (third instar larvae).התחילו את תהליך הנדוּד (wandering) באמצעות פינצטה עדינה. אספו בעדינות פיתאות בשלב הגולם השלישי הנודדות מדפנות הבקבוקון, והעבירו אותן לתוך glycerol 100% מקורר בצלחת פלסטיק קטנה. בחנו את הפיתאות באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה גבוהה המצויד באופטיקה פלואורסצנטית, בהגדלה של 10x או 20x.זהו את הזחלים עם ביטוי פסיפס של תאי קנה נשימה המסומנים פלואורסצנטית. לאחר מכן, בעזרת פינצטה עדינה, אספו בזהירות את אותן חיות והניחו אותן בטיפה של 100% glycerol טרי על זכוכית מיקרוסקופ לבנה. ניתן להניח מספר חיות בטיפה אחת באותו חדר שבו נמצא המיקרוסקופ.הניחו את זכוכית העצירה על גבי בלוק חימום בטמפרטורה של 70 °C עד שהחיות מפסיקות לזוז, מה שקורה בתוך 20 שניות. בתחילה החיות פועלות בתנועות רעידה, אך לאחר מכן הן הופכות לנוקשות ומוארכות. חשיפה ממושכת לאחר המוות מובילה לנזק תרמי של הענפים המסיימים וכן לנזק ללומנים.אות ה-GFP הופך לעמום ומפוזר. תזמון הקיבוע בחום הוא קריטי, כיוון שקיבוע יתר עלול לפגוע בתאים ולהוביל לאנליזה מטעה או קשה. לכן, יש להניח את הדגימות בבלוק החימום ולקבען עד לרגע שבו הן מפסיקות לנוע, אך לא מעבר לכך.כעת, באמצעות פינצטה עדינה, יישרו בזהירות את כל הזחליים המקובעים כך שיהיו מקבילים זה לזה. לאחר מכן, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי (micro cover glass) מעל הזחליים והימנעו מהיווצרות בועות. ייתכן שזכוכית הכיסוי לא תהיה שטוחה לחלוטין, אך אין בכך בעיה.במהלך 30 הדקות הבאות, בצעו הדמיה של הזחלים. זאת מכיוון שהתאים הקצה שעברו קיבוע בחום מתכלים במהירות ואותי ה-GFP הופכים למפוזרים מאוד. לאחר מכן, הניחו את השקופית על במה של מיקרוסקופ סטריאו תרכוב.באמצעות עדשה של 5x, אתרו את שני הגזעים הגביים המקבילים המשתרעים מקדמה לאחורה על פני השטח הגבי של בעל החיים. לאחר מכן, אתרו את שני התאים הגביים הטרמינליים שנמצאים ישירות בין שני הגזעים הגביים. פעולה זו מסייעת בזיהוי הסגמנט המתאים לניתוח.לאחר היישור, סובבו את בעלי החיים כדי לדמות את התאים הקטביים הרצויים על ידי דחיפה זהירה של קצה זכוכית המכסה באמצעות פינצטה. ביצוע פעולה זו בניצב לציר האורכי של בעל החיים גורם לגלגול איטי של הזחלים. בחירת התאים הקטביים המתאימים היא קריטית לקבלת תוצאות עקביות ולהשוואות בין מוטנטים.ניתן למצוא בקלות את התאים הטרמינליים של ענפי גוף השומן בסמוך לגזע הגבי, לצד קו האמצע. ניתן למצוא בקלות את התאים הטרמינליים של קבוצה G הלטראלית, והם ממוקמים ממש לצד קו האמצע הוונטרלי במקטעים הקדמיים וה אחוריים ביותר. סידור התא הטרמינלי שונה מזה של המקטעים האחרים.אין לבחון מקטעים אלו, אלא להתמקד בתאים ובמקטעים. לתאים טרמינליים גביים ב-TR שתיים עד תשע יש תבנית התבססות סטריאוטיפית יותר מאשר לתאים טרמינליים קשייים אחרים. הדבר עשוי להיות תלוי באותים נוספים שאינם אוטונומיים לתא, ויש לקחת זאת בחשבון בעת קבלת ההחלטה האם לכלול אותם בניתוח.לאחר זיהוי תא קצה רלוונטי, צלם תמונה בהגדלה של 10 x או 20 x, בשל תבניות ההסתעפות המשתנות. נסה לצלם תמונות הכוללות כמה שיותר ענפים וקצות ענפים ללא הזזת הבמה. כבה את הפלואורסצנציה והדלק את האור המועבר.כדי ללכוד תמונת שדה בהיר (brightfield) של אותו תא ובאותו מישור מוקד, הלומן יוצג בניגודיות כהה בתוך חלל התא הטרמינלי. כדי לכמת את הענפים והלומנים של התאים הטרמינליים, אספו מספר תמונות במישורי מוקד מרובים עבור כל תא טרמינלי. חלק מהתאים דורשים תמונה אחת בלבד כדי לאסוף נתונים מספיקים, אך אחרים עשויים לדרוש עד שלוש תמונות נפרדות במישורי מוקד שונים.כדי לתעד את כל הענפים, פתחו את תמונות השדה בהיר (brightfield) הפלואורסצנטיות בתוכנת Image J עם תוסף ה-Neuron J המותקן. באמצעות כלי ה-add tracings, עקבו ידנית אחר הענפים והלומן של התא הטרמינלי כולו; השתמשו בכלי ה-label tracings כדי לשנות שם ולצבע, ובכך להקצות לכל קו בתוך השרטוט הגדרה ספציפית עבור תמונות של 12 על 5 פיקסלים. השתמשו בכלי ה-set parameters כדי להתאים את עובי הקו מ-6 ל-10 פיקסלים.שנו את קנה המידה של תמונות ברזולוציה גבוהה או נמוכה יותר בהתאם. השאירו את ההגדרות האחרות כברירת המחדל ולחצו על אישור (okay). לאחר מכן, השתמשו בכלי יצירת תצלומיות (make snapshot).כדי להפיק תמונה, בחרו ב-draw Trace לקבלת צילום של העקבה שניתן להציג זה לצד זה עם התמונה המקורית. בחרו בכלי measure tracings ובחרו בעקבה הרלוונטית. הקלידו את הענפים למדידה בהתבסס על הסימונים הספציפיים.בשלב הבא, בחרו ב-display tracing measurements. לאחר מכן נקו את המדידות הקודמות ולחצו על run. פעולה זו תפיק גיליון נתונים המכיל את השם, התווית, האורך בפיקסלים ונתונים נוספים של התמונה, אשר יישמרו לצורך ניתוח סטטיסטי.פרוטוקול זה בוצע כדי לנתח תאי קנה נשימה מוטפים בפסולת של זחלי Mosaic L3 שנצפו באמצעות GFP. התא הטרמינלי של הקבוצה הצידית הבודדת המסומן כ-LG מראה הסתעפות תת-תאית נרחבת תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. באמצעות Neuron J ניתן לראות לומן תת-תאי ממולא בגז העובר דרך כל אחד מהענפים. בוצע מעקב אחרי הענפים וכן מעקב אחרי הלומן. בבעל זה, שאינו פסיפס (non mosaic), מזוהה התא הטרמינלי של גוף השומן FB.שימו לב כי GFP מובע לאורך כל מערכת הנשמיות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבע תמונות במהירות ולבצע ניתוח כמותי של תאי קצה נשמיים בבעלי חיים שלמים לאחר התפתחותם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים להשתמש בתאי קצה נשמיים כמודל קריטי להבנת היבטים של מורפוגנזה של תאים באמצעות תאי קצה נשמיים.

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

סרטון זה מתאר את בלוטת הלימפה דרוזופילה – האתר העיקרי של המטופויזיס בזחל הזבוב – ומציג פרוטוקול לדוגמה לניתוח והרכבה של האיבר לצורך אימונוהיסטוכימיה והדמיה פלואורסצנטית.

דיסקציה של בלוטת הלימפה בזחל: בידוד האיבר המייצר המוציטים של דרוזופילה

סרטון זה מתאר את בלוטת טבעת דרוזופילה, מבנה אנדוקריני מורכב החשוב לביוסינתזה ולהפרשת אקדיסטרואידים והורמונים אחרים. הפרוטוקול המוצג מדגים את הדיסקציה, הקיבוע והחיסון.

דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל: בידוד איברים אנדוקריניים התפתחותיים מדרוזופילה

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

חקור שיטה מהירה לקביעת זחלי דרוזופילה לצורך הדמיית תאי קצה קני הנשימה במיקרוסקופ אור. השיטה מאפשרת ניתוח כמותי של מורפולוגיה תאית וזיהוי הבדלים בין תאים פראיים למוטנטיים.

בחינה של

גלה סרטונים נוספים