שינוי רב היקף של שתלים מתכתיים עם מילויים נקבוביים, Polyelectrolytes וניטורם העקיף בvivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשנות שתלים מתכתיים בקנה מידה מרובה כדי לשלוט בהתנהגות התאים במבחנה וב-vivo. זה מושג על ידי הפקת שיפוע גודל נקבוביות בתוך שתלים צינוריים תלת מימדיים, שיטת מיצוי Biofreeze. השלב השני הוא פיתוח חיקוי קרום בסיס ננו פיברילר המבוסס על מתודולוגיה של קולגן ואלגינט שכבה אחר שכבה.

לאחר מכן, שיטה עקיפה לניטור שתלים כאלה לאחר ההשתלה באמצעות ניתוח פלזמת דם. HPLC וריצוף הפפטידים שלאחר מכן מודגמים בסופו של דבר כשתל שבו אזורים שונים יכולים להכיל סוגי תאים שונים לפי הצורך. עבור חלק מהרקמות הרב-תאיות ניתן להשיג אם כי מערכת זו יכולה לספק דרך לשנות שתלים מתכתיים.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות מודלים של תרביות תאים תלת מימדיות כגון רקמות מלאכותיות או מודלים של מחלות. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשניסינו למצוא טכניקה לשליטה בתנועת התאים סביב שתלי טיטניום נקבוביים in vivo. כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות את השתלים ולתכנן ולייצר תבניות טפלון כמתואר בטקסט הכתוב להקפאה וחילוץ.

הכן את תמיסת הפולימר הסינטטי PLLA בתערובת בינארית של דיוקסין ומים על ידי החדרת אבקת הפולימר לממס האורגני. על סטאר מגנטי מחממים את התערובת ל-60 מעלות צלזיוס על מנת לקבל תמיסה הומוגנית. טמפרטורה זו נבחרת מכיוון שהיא הגבול הגבוה יותר של עמידות הטמפרטורה עבור מזרקי הזכוכית המדויקים שישמשו להחדרת התמיסה לשתלים.

בינתיים, חשב את נפח תמיסת הפולימר הדרושה ביחס לנקבוביות השתל תוך התחשבות בשינוי בנפח התמיסה הקפואה. לאחר מכן, הכניסו את התמיסה לשתלים באמצעות מזרקי זכוכית מדויקים בדיוק של 0.1 מיקרוליטר. הגבול התחתון לריכוז הפולימר הוא 3% עבור היווצרות שיפוע PO הניתנת לשחזור, או מכיוון שקשה להשיג פיזור הומוגני בדגימות העבות מעל 6% להקפיא את הדגימות ישירות במינוס 80 מעלות צלזיוס או עם תקופת דגירה קודמת של 30 דקות בטמפרטורת החדר.

תנאי הקפאה קובעים חלקית את היווצרות הנקבוביות. כך ניתן להתאים את תנאי ההקפאה בהתאם לנקבוביות המכוונת. שמור את הדגימות למשך הלילה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

הפרדת התבנית במצב קפוא היא צעד קשה מאוד. יש להקפיד להפחית את המגע של תמיסת התחתית הקפואה עם התבנית, בעזרת קרקפת, טבלו את השתלים באתנול מקורר מראש של 80% כדי להשיג שיפועי נקבוביות. השתמש באזמל מקורר מראש כדי להסיר את כל חלקי העובש למעט הקנקנית, עבור השתלים הצינוריים וכל החלקים למעט החלק התחתון לשתלים בצורת דיסק, בצע את החילוץ במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר החילוץ, הסר את חלקי התבנית הנותרים וייבש את השתלים באוויר. לאפיון הנקבוביות הכוללת של המבנה. יש צורך בניתוח אוקסימטר כספית.

בדוגמה זו, מדידות אוקסימטר כספית מראות פסגות ברורות התואמות את הנקבוביות משני צידי השתל ואת הנקבוביות הקטנות יותר המפוזרות. עם זאת, הנתונים המכריעים יותר הם ההבדל בין הנקבוביות של משטחים תוך-לומינליים ואקסטרה-לומינליים, אותם ניתן לנתח על ידי תמונה J להתפלגות גודל הנקבוביות. לאחר שבר הקפאה של הדגימות על ידי התבוננות בחתך הרוחב במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בשל האופי הנקבובי הפתוח של השתלים המשמשים ויכולת החזרת האור של טיטניום, ניתן לבצע ערימות Z של תאים מסומנים בתוך השתלים הנקבוביים. ניתן להשתמש בתאים המסומנים ב-PKH 26 או בסידן AM כדי להמחיש את השתלים במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי להצטברות רב שכבתית. יכולת השחזור הגבוהה ביותר מתקבלת עם רובוטים טובלים.

עם זאת, אם רובוט טבילה אינו זמין, ניתן לבצע שלבים אלה באופן ידני. להכנת תמיסת הקולגן, השתמש בקולגן מסוג 1 ונתרן אלגינט בדרגה רפואית. הריכוזים האופטימליים הם 0.5 גרם לליטר לכל אחד ב-150 מילי-מולר.

בופר נתרן כלורי ציטראט ב-pH 3.8 ממיס את תמיסת הקולגן למשך הלילה כדי להבטיח את ההומוגניות. התמיסה pH חומצי של 3.8 נחוצה להצטברות יציבה של השכבות מכיוון שהמבנה אינו יציב. לפני קישור צולב.

בעיצוב pH ניטרלי מחזיק ספציפי לניצול השתלים עם רובוטים טבילה המשמשים בייצור רב שכבתי של פולי אלקטרוליטים. הנח את השכבות על פני השטח של שתלי טיטניום בלבד או שתלים ששונו כמתואר בטקסט. שימוש במערכת רובוט טבילה על ידי טבילת השתלים בתמיסת אלגינט למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטיפה של המבנה עם נתרן כלורי 150 מילימולרי ב-pH 3.8 למשך חמש דקות.

לאחר מכן טבלו בתמיסת קולגן למשך 15 דקות. כדי לייצב תחילה את קרום המרתף, הכינו את תמיסת הקישור הצולבת בג'נין של 100 מילימולרי. במאגר ציטראט A-D-M-S-O ביחס נפח אחד עד ארבעה נפחים, ממיסים את הג'נין ברכיב ה-DMSO ולאחר מכן ברכיב המים, כדי למנוע גושים, יש לקשר את הדגימות על ידי טבילה בתמיסת הקישור בין 12 ל-24 שעות לאחר מכן.

יש לשטוף בכמויות גדולות של חוצץ ציטראט ב-pH 3.8 לאחר שטיפת השלבים, יש לעקר את הדגימות בטיפול UV למשך 30 דקות או באמבט אנטיביוטי אנטי פטרייתי. הפרמטרים העיקריים הקובעים את איכות חיקוי קרום המרתף הם עוביו וקוטר הסיבים. חשב את קוטר הסיבים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או תמונות FM המתקבלות במצב מגע.

לאחר ייבוש הדגימות בזרימת חנקן, לפני ההדמיה יש לכמת את העובי של לפחות 10 סיבים לתמונה כדי לקבוע את עובי הסיבים הממוצע. עם תוכנת Image J לאחר ייבוש הסרטים הרב-שכבתיים של קולגן אלגינט 24 דו-שכבתי, ניתן לקבוע את עובי הסרטים על ידי בדיקות שריטות. השתמש תחילה ב- FM, השתמש במחט מזרק כדי לשרוט את הסרט לאחר לוקליזציה של השריטה במיקרוסקופ אור, השג תמונות עם FM על משטחים של 10 על 10 מיקרון רבוע בגבול השריטה.

חשב את הגבהים מהפרופילים המתקבלים באמצעות תוכנת A FM, המספקת את עובי שכבת הסרט. לאחר השתלת המכשיר בקנה הנשימה של הארנבים כמתואר בטקסט, קחו דגימות דם מוורידי האפרכסת שלהם, צנטריפוגה את הדגימות ב-5,000 סל"ד למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בסופרנטנט שהתקבל לניתוח לאחר חילוץ פלזמת הארנב עם 0.1% של חומצה אצטית טריור.

בצע טיהור HPLC בשלב הפוך של תכולת חלבון הפלזמה על ידי טיהור התמצית באמצעות עמודת שלב הפוך של תא גרעין 305 C 18. רשום את הספיגה ב-214 ו-280 ננומטר באמצעות מערכת הממס וקצב הזרימה הנמצאים בפרוטוקול הטקסט. אסוף את שברי השיא לפני ריכוזם באמצעות אידוי.

באמצעות יישום ואקום מהיר, חשוב לעצור את הוואקום המהיר לפני יובש מוחלט. מתאם את הפסגות המתקבלות בנקודות זמן שונות במהלך תקופת ההשתלה. השתמש בפפטידים המטוהרים המראים מגמות עקביות במהלך ההשתלה לזיהוי על ידי ריצוף אדמונד אוטומטי.

טען את הדגימה למסנני סיבי זכוכית שטופלו בפולי מוח לקבוע את רצף מסוף הקצה של הפפטידים המטוהרים על ידי פירוק אוטומטי של אדמונד באמצעות מיקרו רצף מדויק מקצועי. השלב הבא הוא זיהוי של חומצות אמינו פניל ואחת על ידי כרומטוגרפיה על עמודת C 18. לאחר קבלת הרצף, ניתן לזהותו על ידי תוכנת פיצוץ באמצעות מסד הנתונים של Swiss Prote.

על ידי שינוי ריכוז תמיסת ה-PLLA, ניתן לשלוט בגודל הנקבוביות בצד הלומינלי הנוסף של השתלים. גודל וצורת הנקבוביות הושפעו באופן משמעותי מנוכחותם של שתלי טיטניום. גודל הנקבוביות נע בין 40 ל-100 מיקרומטר עם ניצול ריכוזים נמוכים יותר וכתוצאה מכך נקבוביות קטנות יותר, בעוד שגודל הנקבוביות הצדדיות התוך-לומינליות נשלט על ידי המיצוי המוגבל והיה בסביבות תשעה מיקרון, שהוא פחות מהגודל הממוצע של פיברובלסטים.

על ידי הוספת שלב דגירה בטמפרטורת החדר, ניתן להשיג מבנים נקבוביים כפולים שבהם לדפנות הנקבוביות של הנקבוביות הגדולות יותר יש נקבוביות משלהם. תכונה זו חשובה עבור שתלים עבים מכיוון שהיא תקל על תנועת הגזים והחומרים המזינים. לאחר היווצרות שיפוע הנקבוביות, ניתן להוסיף את שכבת שכבת הקולגן אלגינט על גבי המבנה.

שכבת סרט זו יציבה על גבי קצף PLLA וניתן לשמור אותה גם על פני השטח בהיעדר סיבי קולגן ננומטריים מוקצפים. ככל ששכבת הסרט גדלה, הצמיחה של הסרט היא אקספוננציאלית. כך ניתן להשיג סרט עבה של כמה מאות ננומטרים.

שתלי טיטניום נקבוביים משתלבים ברקמת המארח ומתמלאים לחלוטין בין ארבעה לשישה שבועות in vivo, כפי שמוצג בחתכי השתל המושתלים. הרקמה בתוך הנקבוביות היא רקמת חיבור בוגרת עם רמה טובה של כלי דם. במהלך תקופה זו, ניתוח HPLC הראה שיאים מובהקים המשתנים במהלך זמן ההשתלה.

חלקי השיא המעניינים רוצפו ונקבעו כחצאי שרשראות המוגלובין אלפא ובטא, שהראו מגמה דומה עם קריאות חלבון תגובתי C. לאחר המאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות ביום אחד אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר שיפועי PO רב-ממדיים תלת מימדיים לשינוי שתלים מתכתיים ולניסויים בתרבית תאים.

מיצוי הקפאה ושכבה על ידי היווצרות הסרט הן מתכות פשוטות לפיתוח שתלים או מיקרו-סביבות משלך לתאים.