מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic Thaliana ארבידופסיס תא תרבויות השעיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפריד בין תאי משנה שונים של הממברנה ולחקור את הרכב החלבון הדיפרנציאלי שלהם. זה מושג על ידי תיוג איזוטופים יציב של תאים בתנאים שונים כדי לאפשר בידול של הטיפולים. בניתוח ספקטרומטרי מסה כשלב שני מעורבב חומר תא משני הטיפולים, מה שמבטיח עיבוד משותף ומפחית את השונות בדגימה לדגימה.

לאחר מכן, תאי המשנה של קרום הפלזמה מטוהרים ומופרדים לתאי משנה סטריליים, עשירים וסטריליים מדוללים על ידי סוכרוז. מתקבלות תוצאות צנטריפוגה שיפוע המראות שפע חלבון דיפרנציאלי בתאי המשנה תחת טיפולים שונים על סמך נתונים מספקטרומטריית מסה כמותית. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה על פני שיטות קיימות, כגון Western Blotting, הוא שאנו יכולים לתעד כמותית את התפלגות תת-התא של אלפי חלבונים ובכך לגלות מועמדים חדשים לתהליכי איתות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את טיהור ה-me של מערכת דו-פאזית. הסיבה לכך היא שזה כרוך בהרבה שלבים והבקרה המדויקת והטיפול היסודי חשובים מאוד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות על ידי גילוי מועמדים חדשים לחלבון כמווסתים של תהליכי ממברנה התחל בגידול תרביות תרחיף תאים arabidopsis מסומנות וללא תווית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

תאים הומוגניים מליטר אחד של תרביות תרחיף תאים בנות שבעה ימים בחנקן נוזלי מערבבים את אותן כמויות של תרביות תאים קפואות מסומנות וללא תווית על בסיס משקל טרי בכוס ומוסיפים שני נפחים של בופר H, מניחים מיד את הכוס על שייקר ומנערים עד שהחומר נמס וללא קרח. גבישים מסננים את ההומוגנאט דרך שכבה אחת של בד מראה לצינורות צנטריפוגה של 250 מיליליטר לאחר איזון הדגימות עם צנטריפוגת H חיץ ב-10,000 גרם למשך שמונה דקות. לאחר הצנטריפוגה, טען את החטף לצינורות צנטריפוגה אולטרה קרירים מראש בנפח של כ -32 מיליליטר.

לאחר איזון הדגימות עם מאגר h גלולה את המיקרוזומים על ידי צנטריפוגה ב-100, 000 Gs ו-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שצנטריפוגה מסירה את הסופרנטנט, הסופרנטנט מכיל חלבונים מסיסים. ניתן לשמור כמות קטנה של חלק זה למשקעי חלבון נוספים, וניתוח עוקב של חלבונים מסיסים משהה מחדש את גלולת הממברנה של כל דגימה בכמות המאגר R המתאימה כמתואר בעומס פרוטוקול הטקסט על החלק העליון של מערכת U אחת דו-פאזית.

אם נעשה שימוש במערכת הדו-פאזית של שישה גרם, טען בדיוק שני גרם של גלולת ממברנה תלויה באותו נפח של מאגר טהור R המשמש למתלה החידוש של הדגימה על U2. מערבבים לאט את צינורות U one ו-U2 על ידי היפוכם 30 פעמים בערך בהיפוך אחד לשנייה צנטריפוגה את הדגימות ב-1500 Gs ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, הסר את השלב העליון מ- U2. העבר את השלב העליון מ-U אחד ל-U2 לפני שתחזור על הצנטריפוגה באמצעות אותם פרמטרים. לאחר מכן, העבירו את השלב העליון מ-U2 לתוך צינורות האולטרה-אולטרה-צנטריפוגה מדללים בחמישה נפחים של מאגר R ומערבבים היטב את הדגימות ב-200, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

לבסוף, שימוש חוזר. השעו את גלולת הממברנה בכמות קטנה של מאגר T ו-E לבידוד ממברנות עמידות בפני חומרי ניקוי. לאחר בדיקת ריכוז שבר קרום הפלזמה על ידי בדיקת ברדפורד, הוסף טריטון X 100 לשבר קרום הפלזמה בחומר ניקוי לחלבון, יחס משקל למשקל בין 13 ל -15, וריכוז חומר ניקוי סופי בין 0.5 ל -1% לנער את הדגימות בסביבות 100 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן הוסף שלושה נפחים של סוכרוז מולארי 2.4 לנפח אחד של קרום הפלזמה המטופל כדי לקבל ריכוז סופי של 1.8 מולארי של סוכרוז. הכן את שיפוע הסוכרוז בצינורות אולטרה-צנטריפוגה על ידי העמסת תמיסות הסוכרוז המתאימות על גבי צנטריפוגת השבר המולרי של 1.8 הדגימות ב-250, 000 GS וארבע מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. הסר בזהירות את צינורות האולטרה-צנטריפוגה מהרוטור כדי למנוע הפרעה של הרצועה בצפיפות נמוכה, שעשויה להיראות כטבעת חלבית בממשק של סוכרוז 0.15 מולרית ו-1.4 מולארית.

לפעמים לא ניתן לראות דבר, אך חלק החלבון העמיד לניקוי עדיין קיים. הסר שבריר של נפח של 0.75 מיליליטר מהחלק העליון של השיפוע, שברים שניים ושלושה, המכסים נפחים של כ -1.5 מיליליטר מעל טבעת הבין-פאזית. ו -0.5 מיליליטר מתחת לטבעת הבין-פאזית.

מייצג את חלק הממברנה העמיד בפני חומרי ניקוי. אסוף את השברים הללו לצינורות פלקון של 15 מיליליטר. שברים 9 ו-10 מכילים את חלק הממברנה המסיסה בחומר הניקוי וניתן לאסוף אותם גם להשוואה.

כדי להתחיל במיצוי חלבונים מהחלק העמיד לחומרי ניקוי, הוסף ארבעה נפחים של מתנול לשברים שנאספו ומערבולת v ביסודיות. לאחר מכן הוסף נפח אחד של כלורופורם לפני מערבולת יסודית שוב. לבסוף, הוסף שלושה נפחים של מים ומערבולת צנטריפוגה יסודית את הדגימות ב-2000 Gs לחמישה.

בעזרת צנטריפוגה שולחנית, הסר את השלב המימי מעל שכבת החלבון באינטרפאזה. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של מתנול ומערבולת. הסר היטב את ה-S supernatant לפני משיכת הגלולה כדי להתכונן לעיכול תמיסה.

התחל בעיכול התמיסה על ידי המסת הדגימה בנפח קטן של שש אוריאה מולארית, שתי טוחנות של בלוטת התריס, pH שמונה UTU מקוצר. השתמש בנפח נמוך ככל האפשר התואם לדגימה. לאחר סיבוב הדגימות וביצוע העיכול כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לדלל את הדגימה בארבעה נפחים של 10 מילי-מולרי טריס HCL PH שמונה.

לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של טריפסין לכל 50 מיקרוגרם של חלבון דגימה דגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ניעור מתמיד בצנטריפוגה של 700 סל"ד הדגימות ב-4,000 GS למשך 10 דקות. לבסוף, החמצנו את הדגימות לריכוז סופי של 0.2% TFA כדי להגיע ל-pH 2 על ידי הוספת נפח עשירי של 2% חומצה אצטית טרי פלואורו. כדי לייצר טיפים לשלב C 18, הנח דיסק מור C 18 על משטח נקי ושטוח כגון צלחת פטרי חד פעמית מפלסטיק.

חורר דיסק קטן באמצעות מחט היפודרמית עם קצה קהה בקוטר 1.5 מילימטרים. הדיסק נדבק במחט וניתן להעבירו לקצה פיפטה. דחוף את הדיסק החוצה מהמחט וקבע אותו בהתחדדות של קצה פיפטה באמצעות חתיכת סיליקה התמזגה או צינור המתאים בחלק הפנימי של מצב המחט קצה שלב C 18 על ידי הנחת 50 מיקרוליטר של תמיסה B על קצה הבמה המוכן.

סובב את הקצה בצנטריפוגה ב-2000 סל"ד למשך שתי דקות בצנטריפוגה ספסל, אזן את קצה השלב באמצעות 100 מיקרוליטר של תמיסה א. סובב את הקצה ב-5,000 GS בצנטריפוגה שולחנית. חזור על שיווי המשקל וסיבוב

טען את הדגימה על הדיסק על ידי הזרמת הדגימה בזהירות לקצה הפיפטה כשהדיסק בפנים. סובב את הקצוות בצנטריפוגה עד שכל נפח הדגימה עובר דרך דיסק C 18. שטפו את קצות הבמה פעמיים עם 100 מיקרוליטר תמיסה A.לאחר סיבוב הקצוות בצנטריפוגה, אספו את ה-EIT בצינור תגובה טרי של 1.5 מיליליטר ב-40 מיקרוליטר של תמיסה B וצנטריפוגה.

שוב, רכז את הדגימה במהירות הוואקום בתנאים אידיאליים. עצור את תהליך ההתייבשות כאשר נשאר רק מיקרוליטר אחד או שניים של נוזל. כשלב אחרון, הוסף נפח סופי של תשעה מיקרוליטרים של תמיסת תרחיף Resus לדגימה והעביר אותו לצלחת המיקרוטיטר לניתוח מפרט המסה.

ניתן להראות העשרה של חלבוני קרום פלזמה על ידי ניתוח פרוטאומי של eloqua קטן של קרום פלזמה, שברים וחלבונים בשלב התחתון של המערכת הדו-פאזית. השלב התחתון מכיל את הממברנות הפנימיות של התא. לדוגמה, חלבוני ממברנת פלזמה הידועים בדרך כלל כגון חלבוני קינאז קולטן הראו שפע גבוה בשבר קרום הפלזמה ושפע נמוך בשבר הפאזה התחתון המכיל את הממברנות הפנימיות.

בתורם, חלבונים ידועים של הרטיקולום האנדופלזמי מראים שפע גבוה בשבר הממברנה הפנימי ולא נצפו בשבר קרום הפלזמה. ההעשרה שלאחר מכן של שברי ממברנה עמידים בפני חומרי ניקוי תביא, במקרים אידיאליים, להיווצרות טבעת חלבית של שלפוחיות קרום בצפיפות נמוכה. בכחמישית מגובה הצינור, השפע הגבוה ביותר של חלבון שריד נמצא בממברנה העמידה לחומרי ניקוי או בשברי DRM כצפוי.

לעומת זאת, חלבונים שאינם קיימים בקרום, תחומי מיקרו כגון טרנספורטר A b, C אינם מראים שפע מוגבר בשבר ה- DRM. כמו כן, מזהמים אופייניים כגון חלבון מיטוכונדריאלי מקומפלקס A TPAs F אפס וחלבון ריבוזומלי מהריבוזום של 60 s אינם מראים שפע מועשר במקטע ה-DRM. למרות שעדיין ניתן לזהות כמויות מינימליות לאחר ניתוח ספקטרומטרי מסה, ניתן להבחין כמותית בין יחסי שפע החלבון של מצב זרחון החלבון בקרום הפלזמה, ניתן להבחין כמותית בין שברים של תרביות תאים מסומנות ולא מסומנות.

תוצאות אופייניות מחלון הכימות הכמותי של MS צריכות להראות יחס עוצמת יונים של אחד לאחד עבור רוב הפפטידים שזוהו. אותם פפטידים עם יחס עוצמת יונים החורג באופן משמעותי מאחד לאחד נחשבים כמווסתים באופן דיפרנציאלי בין תרבית התאים המסומנת לתרבית התאים הלא מסומנת, והם מועמדים להתאמה לחלבונים המושפעים מהטיפול המיושם. בקרת איכות טובה של תיוג מטבולי מוצלח היא הקואליציה של גרסאות פפטיד מסומנות ולא מסומנות כשיא יחיד בהפרדת ננו HPLC כפי שמוצג כאן.

לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים מתחילת המיצוי ועד טעינת הדגימה על ספקטרומטר מסה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו החגורה המערבית על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי תחינה של חלבוני מטרה ספציפיים. אז לאחר צפייה בסרטון זה, אנו אמורים להבין היטב כיצד לערבב תרביות תאי צמחים עם תווית איזוטופ יציבה, כיצד לבצע טיהור קרום פלזמה על פני מערכת דו-פאזית, וכיצד להפריד בין תאי משנה של קרום עשיר וסטרילי מדולל.