מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפריד תתי-מדורים שונים של ממברנות ולבחון את הרכב החלבונים השונה ביניהם. דבר זה מושג באמצעות סימון של תאים באיזוטופים יציבים תחת תנאים שונים, כדי לאפשר הבחנה בין הטיפולים. בשלב השני, בניתוח ספקטרומטריה של מסות, מערבבים חומר תאי משני הטיפולים, מה שמבטיח עיבוד משותף ומפחית את השונות בין הדגימות.

בשלב הבא, תת-תאים של ממברנת הפלזמה מטוהרים ומופרדים לתת-תאים סטריליים עשירים וסטריליים דלים באמצעות סוכרוז. תוצאות סרטיפוגציה במדרג (Gradient centrifugation) משיגות נתונים המראים שפע חלבוני שונה בתת-התאים תחת טיפולים שונים, בהתבסס על נתונים מספקטרומטריית מסות כמותית. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה על פני שיטות קיימות, כגון Western blotting, הוא היכולת לתעד באופן כמותי את התפלגות תת-התאים של אלפי חלבונים, ובכך לגלות מועמדים חדשים לתהליכי איתות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן למידת טיהור של מערכת דו-פאזית היא משימה קשה. הסיבה לכך היא שהתהליך כרוך בשלבים רבים, ובקרה מדויקת וטיפול יסודי הן בעלות חשיבות רבה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האיתות הביולוגי על ידי גילוי מועמדים חדשים של חלבונים המשמשים כווסתים של תהליכי ממברנה. התחילו בגידול תרביות של סספנסיות תאים של *Arabidopsis thaliana*, מסומנות ובלתי מסומנות, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

תאים הומוגנאיים מכ-ליטר אחד של תרביות תאי סספנסיה בנות שבעה ימים בחנקן נוזלי; מערבבים בכלי ביקר כמויות שוות של תרביות תאים קפואות מסומנות ולא מסומנות על בסיס משקל רטוב, ומוסיפים שני נפחים של בופר H. מניחים מיד את הכלי הביקר על שייקר ומנערים עד שהחומר נמס וללא גבישי קרח. מסננים את ההומוגנאט דרך שכבה אחת של בד מראה (mirror cloth) לתוך מבחנות צנטריפוגה של 250 מיליליטר. לאחר איזון הדגימות עם בופר H, מבצעים צנטריפוגה ב-10,000 Gs למשך שמונה דקות. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את ה-snat למבחנות אולטרה-צנטריפוגה שקוללו מראש בנפח של כ-32 מיליליטר.

לאחר איזון הדגימות עם בופר h, השקיפו את המיקרוסומים על ידי סרכזה ב-100,000 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסרכזה הסירו את supernatant, המכיל חלבונים מסיסים. ניתן לשמור כמות קטנה של פרקציה זו להמשך שקיעת חלבונים וניתוח עוקב של חלבונים מסיסים. השביו מחדש את משקע הממברנה של כל דגימה בכמות המתאימה של בופר R כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, והעמיסו על החלק העליון של מערכת ה-U one two phase.

אם נעשה שימוש במערכת שתי הפאזות של שישה גרם, טענו בדיוק שני גרם של משקע ממברנה שתולש (resuspended membrane pellet) וטענו את אותו נפח של בופר R טהור ששימש לתלישה של הדגימה אל תוך U2. ערבבו לאט את מבחנות U1 ו-U2 על ידי הפיכתן 30 פעמים, בקצב של הפכה אחת לשנייה בערך; סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-1500 Gs ובטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות. לאחר הסבוב, הסירו את הפאזה העליונה מ-U2. העבירו את הפאזה העליונה מ-U1 אל U2 לפני חזרתו על הסבוב באותם פרמטרים. לאחר מכן, העבירו את הפאזה העליונה מ-U2 למבחנות אולטרה-צנטריפוגה, דללו עם חמישה נפחים של בופר R וערבבו היטב; סבבו את הדגימות ב-200,000 Gs ובטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת.

לבסוף, שימוש חוזר. השהה את משקע הממברנה בכמות קטנה של תמיפת T and E לצורך בידוד של ממברנות עמידות לדטרגנט. לאחר בדיקת הריכוז של פראקציית ממברנת הפלזמה באמצעות בדיקת Bradford, הוסף Triton X 100 לפראקציית ממברנת הפלזמה ביחס משקלי של דטרגנט לחלבון שבין 13 ל-15, ובריכוז סופי של דטרגנט שבין 0.5% ל-1%. נער את הדגימות במהירות של כ-100 RPM ובטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה נפחים של סוכרוז בריכוז 2.4 molar לנפח אחד של ממברנת הפלזמה שעברה טיפול, כדי להגיע לריכוז סופי של סוכרוז של 1.8 molar. הכינו את מדרג הסוכרוז באنبובות אולטרה-צנטריפוגה על ידי טעינת תמיסות הסוכרוז המתאימות מעל לשבר ה-1.8 molar. צנטריפוגו את הדגימות ב-250,000 GS ובטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך 18 שעות. הוציאו בזהירות את אנובובות האולטרה-צנטריפוגה מהרוטור כדי למנוע פגיעה בפס בעל הצפיפות הנמוכה, שעשוי להיראות כטבעת חלבית בממשק שבין סוכרוז 0.15 molar לסוכרוז 1.4 molar.

לעיתים לא ניתן לראות דבר, אך פראקציית החלבון העמידה לדטרגנט עדיין קיימת. הסיר פראקציה בנפח של 0.75 מיליליטר מחלקו העליון של הגרדיאנט, פראקציות שתיים ושלוש, המכסות נפחים של כ-1.5 מיליליטר מעל טבעת הבינפזה. ו-0.5 מיליליטר מתחת לטבעת הבינפזה.

מייצג את פראקציית הממברנה העמידה לדטרגנט. אספו פראקציות אלו לשפופרות Falcon של 15 מיליליטר. פראקציות 9 ו-10 מכילות את פראקציית הממברנה המסימה בדטרגנט וניתן לאסוף גם אותן לצורך השוואה.

כדי להתחיל במיצוי חלבונים מהפרק העמיד לדטרגנטים, יש להוסיף ארבעה נפחים של methanol לפראקציות שנאספו ולערבב היטב באמצעות vortex. לאחר מכן, יש להוסיף נפח אחד של chloroform ולערבב שוב היטב ב-vortex. לבסוף, יש להוסיף שלושה נפחים של מים, לערבב היטב ב-vortex ולסבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-2000 Gs למשך חמש דקות.

באמצעות צנטריפוגה שולחנית, הסר את הפאזה המימית שמעל לשכבת החלבון שבבינ-פאזה. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של methanol וערבב במערבל vortex. הסר ביסודיות את העלייה (supernatant) לפני שאיבת המשקע (pellet) כדי להכינו לעיכול בתמיסה (in-solution digestion).

התחילו בעיכול בתמיסה (in-solution digestion) על ידי המסת הדגימה בנפח קטן של urea בריכוז six molar ו-thyroid בריכוז two molar ב-pH eight, המכונה בקיצור UTU. השתמשו בנפח הנמוך ביותר האפשרי התואם את הדגימה. לאחר סבוב של הדגימות וביצוע העיכול כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, דללו את הדגימה בארבעה נפחים של tris HCL בריכוז 10 millimolar ב-PH eight.

לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של trypsin לכל 50 micrograms של חלבון דגימה, הדגירו למשך לילה בטמפרטורת החדר עם ניעור קבוע ב-700 RPM, וסבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-4,000 GS למשך 10 דקות. לבסוף, חמצו את הדגימות עד לריכוז סופי של 0.2%TFA כדי להגיע ל-pH שתיים על ידי הוספת נפח של כעשירית מ-2%tri fluoro acetic acid. להכנת C 18 stage tips, הניחו דיסק mour C 18 על משטח נקי ושטוח, כגון צלחת פטרי מפלסטיק חד-פעמית.

חלוץ דיסקה קטנה באמצעות מחט תת-עורית בעלת קצה קהב בקוטר של 1.5 millimeters. הדיסקה נדבקת למחט וניתן להעביר אותה לקצה של פפטה. דחף את הדיסקה החוצה מהמחט וקבע אותה בתוך ההיצרות של קצה הפפטה באמצעות פיסת fused silica או צינורית המתאימה לחלק הפנימי של המחט; התנה את קצה שלב C 18 על ידי הנחת 50 microliters של תמיסה B על קצה השלב שהוכן.

סובב את הקצה בצנטריפוגה ב-2000 RPM למשך שתי דקות. בצנטריפוגת שולחן, בצע שיווי משקל לקצה הבמה באמצעות 100 µL של תמיסה a. סובב את הקצה ב-5,000 GS בצנטריפוגת שולחן. חזור על תהליך שיווי המשקל והסיבוב.

העמיסו את הדגימה על הדיסק על ידי פיפטינג זהיר של הדגימה אל תוך קצה הפיפט שבו נמצא הדיסק. סובבו את הקצוות בצנטריפוגה עד שכל נפח הדגימה יעבור דרך דיסק ה-C 18. שטפו את קצות שלבי העבודה פעמיים עם 100 µL של תמיסה A. לאחר סיבוב הקצוות בצנטריפוגה, אספו את ה-EIT לשפופרת תגובה נקייה של 1.5 mL המכילה 40 µL של תמיסה B, וסובבו בצנטריפוגה.

שוב, רכז את הדגימה ב-speed vac תחת תנאים אופטימליים. הפסק את תהליך הייבוש כאשר נותרים כ-1 או 2 µL של נוזל. כשלב סופי, הוסף לדגימה נפח סופי של 9 µL של תמיסת Resus suspension והעבר אותה ללוחית המיקרוטיטר לצורך אנליזת mass spec.

ניתן להדגים העשרה של חלבוני ממברנת הפלזמה באמצעות אנליזה פרוטאומיקה של אליקוואות קטנות של ממברנת הפלזמה, פראקציות וחלבוני הפאזה התחתונה של המערכת הדו-פאזית. הפאזה התחתונה מכילה את הממברנות הפנימיות של התא. לדוגמה, חלבוני ממברנת פלזמה מוכרים טיפוסיים, כגון חלבוני רספטור קינאז, הראו שפע גבוה בפראקציית ממברנת הפלזמה ושפע נמוך בפראקציית הפאזה התחתונה המכילה את הממברנות הפנימיות.

בתורם, חלבונים מוכרים של הרשת האנדופלזמית הראו שכיחות גבוהה בפרקציית הממברנה הפנימית ולא נצפו בפרקציית ממברנת הפלזמה. העשרה עוקבת של פרקציית ממברנה עמידה לדטרגנט תביא, במקרים אידיאליים, להיווצרות של טבעת חלבית של וסיקולות ממברנה בעלות צפיפות נמוכה. בגובה של כחומש מהמבחנה, נמצאה השכיחות הגבוהה ביותר של חלבון remn בפרקציית הממברנה העמידה לדטרגנט או בפרקציית ה-DRM, כצפוי.

לעומת זאת, חלבונים שאינם נמצאים בדומיינים מיקרוסקופיים של הממברנה, כגון נשאי A b, C, אינם מראים שפע מוגבר בפרקציית ה-DRM. כמו כן, מזהמים טיפוסיים, כגון חלבון מיטוכונדרי מקומפלקס ה-A TPAs F zero וחלבון ריבוזומלי מהריבוזום 60 s, אינם מראים שפע מועשר בפרקציית ה-DRM. למרות שניתן עדיין לזהות כמויות מינימליות לאחר ניתוח ספקטרומטריית מסות, ניתן להבחין באופן כמותי ביחסי שפע של חלבונים ובמצב הפוספורילציה של חלבונים בפרקציות של ממברנת הפלזמה בתרביות תאים מסומנות ולא מסומנות.

תוצאות טיפוסיות מחלון הכימות של ה-MS אמורות להראות יחס עוצמת יונים של אחד-לאחד עבור רוב הפפטידים שזוהו. פפטידים שבהם יחס עוצמת היונים סוטה באופן משמעותי מיחס של אחד-לאחד נחשבים לוואים המווסתים באופן דיפרנציאלי בין תרבית התאים המסומנת לבלתי המסומנת, והם מהווים מועמדים להתאמה לחלבונים שהושפעו מהטיפול שהוחל. בקרת איכות טובה לסימון מטבולי מוצלח היא התאחדות של שתי גרסאות הפפטיד, המסומנת והבלתי מסומנת, כפיסגה אחת בהפרדת nano HPLC, כפי שמוצג כאן.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בתוך שלושה ימים, החל מתחילת המיצוי ועד להעמסת הדגימה למספקטורומטר המסה. בהמשך להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון Western Belt כדי לענות על שאלות נוספות לגבי השפעה של חלבוני מטרה ספציפיים. לפיכך, לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה לגבי האופן שבו מערבבים תרביות תאי צמחים המסומנות באיזוטופים יציבים, כיצד לבצע ניקוי של ממברנת הפלזמה באמצעות מערכת דו-פאזית, וכיצד להפריד תתי-תאים של ממברנות עשירות בסטרוולים מאלו הדלות בסטרוולים.