Name: סינתזה, משלוח נייד ו בvivo יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: למדו סינתזה ויישום של חיישני pH פלואורסצנטיים מבוססי דנדרימר לדימות תאים חיים ומוח בעכברים. השיטה משתמשת באלקטרופורציה ומיקרוסקופיית קונפוקל לדיוק גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

דיונים מועילים עם Isja דה Feijter ומאט בייקר הם הודה בהכרת תודה.

1. סינתזה של חיישנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסעיף הבא שאנו מספקים להליך נטיה של מדדי ה-pH ל dendrimers Pamam. אותו הפרוטוקול יכול להיות מיושם עם שינויים מינימאליים לdendrimers אמין נושאות חלופיות. 5,17,13,14 dendrimers וצבעים ניתן להשיג בחנויות ניתן להשתמש ללא purifications נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את dendrimer בDMSO נטול מים (ריכוז סופי 50 מיקרומטר). הכן פתרונות מניות 10mm של ההעמסה-NHS וtetramethyl-rhodamine-NHS (ת.מ. ר) ב DMSO נטול מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפתרון dendrimer את הכמות הרצויה של העמסה וTMR. היחס טוחנת בתערובת ישקף את כמות הצבעים נטענים על dendrimer. בדרך כלל 1 מיליליטר של תמיסת dendrimer Pamam G4 בצינור microcentrifuge הוא הגיב עם 8 EQ (40 μl) של והעמסת ו8 EQ (40 μl) של TMR. מערבבים את הפתרון בטמפרטורת חדר למשך שעה 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1:10 עם מים deionized ולטעון את התגובהתערובת בשקית דיאליזה (MWCO = 10 KDA). Dialyze ל24 שעות נגד המים deionized החלפה בתדירות גבוהה המים במאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפתרון לבקבוקון ולהקפיא יבש ל24 שעות. יש לקבל אבקה סגולה. משקל שהושג מוצק ולהמס אותו במי milliQ בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. Aliquot הפתרון ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 2. במבחנה מדידות pH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבחנת הכיול להכין 500nm פתרון של dendrimer ב PBS (פוספט 2 מ&quot;מ) בקובט קוורץ. השימוש בחיץ מאוד לדלל PBS (2 מ&quot;מ), כדי למנוע שינויים פתאומיים של pH בטיטרציה מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספקטרום הפליטה של ​​והעמסת (exc 488 ננומטר) ות.מ. ר (exc 550 ננומטר) ולמטב את הגדרות אופטיות של fluorimeter כדי להשיג יחס אות לרעש טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע טיטרציה pH על ידי הוספת כמויות קטנות של 0.1 NaOH N ונ &#39;HCl 0.1 לאחר כל תוספת לנער את קובטלערבוב, חכה 1 דקות לאיזון ולמדוד את רמת החומציות באמצעות microelectrode-pH. ספקטרום פליטה של ​​והעמסת וTMR צריך להיות מוקלט על כל צעד ללא כל שינוי בהגדרות אופטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את עוצמת הקרינה לעומת pH לטיטרציה. אות rhodamine צריכה להיות מושפעת מרמת חומציות (&lt;10%). האות והעמסת צריכה להיות עקומת sigmoidal וצריכה להיות מצוידת עם מודל יחיד מחייב עם pK = 6.4. </li></ol> 3. תא תרבות וElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפח את תאי הלה במדיום שונה Dulbecco הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 פניצילין U / ml, ו100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין (Invitrogen). שמור על תרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electroporation dendrimer, כאשר תאי מחוברות, הסר את המדיה ולשטוף תאים באמצעות DPBS (פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco). הסר את DPBS ולהוסיף טריפסין-EDTA. לנטרל את Trypלחטוא על ידי הוספת סרום בינוני המכיל אך לא אנטיביוטיקה. צנטריפוגה ב900-1,200 סל&quot;ד במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את המדיה ולשטוף את כדורים באמצעות DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולקחת 4 * 10 6 תאים. צנטריפוגה ב1,200-1,500 סל&quot;ד במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב μl 200 של חיץ microporation (המסופק על ידי יצרן microporator) ולהעביר את תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תמיסה מימית dendrimer לתוך תאים מושעים. כמות dendrimer נדרש לדגימה היא תלויה בסוג Pamam (בדרך כלל 250 ננומטר עבור קטיוני ו2 מיקרומטר לdendrimers הניטרלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ electroporation (המסופק על ידי יצרן microporator) בצינור microporation. פיפטה את התאים וdendrimers תערובות עם קצה electroporation של 100 μl בגודל נפח. הכנס את פיפטה microporator לתחנת פיפטה. הגדר את המצב הדופק לmicroporation: מתח דופק = 1,005 V; wid דופקה = 35 אלפיות שנייה; דופק מספר = 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תאי העברת דופק לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות תאים 5 דקות ב1,200 סל&quot;ד כדי להסיר את עודף dendrimer במדיום. צלחת 10 μl של תאי electroporated על גבי זכוכית תחתונה מנות 35 מ&quot;מ (GWSt-3522 WILLCO צלחת) עם מדיום חדש w / o אנטיביוטיקה. </li></ol> 4. חישה pH בתאים חי הלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה עם מיקרוסקופ 12 שעה confocal לאחר electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להשתמש בו להגדיר מסנן סטנדרטי ולהעמסה וrhodamine. אם מסננים מתכונן הם סט זמין ערוץ ירוק 500-550 ננומטר ומסלול אדום מ580 ננומטר ל650 ננומטר. עירור ב 488nm הוא אופטימלי להעמסה תוך rhodamine יכולה להיות צילמה גם עם 543nm או קו הלייזר 561. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגש על הדגימה ולהתאים את כוח לייזר וגלאים לזכות למקסם את יחס אות לרעש. אם electroporation היה תאים מוצלחים צריכים להיות ניאון בהיר בשני הערוצים.לוקליזציה תלוי בגודל ואחראי על dendrimer בשימוש. לעתים קרובות כמה לוקליזציה lysosomal (שלפוחית ​​perinuclear קטנה) היא הווה בשל אנדוציטוזה או מידור. רעילות ומדידה אם לוקליזציה lysosomal הוא השולט, כלומר רוב הקרינה הוא מקומי בתוך שלפוחית ​​ואות עניות הוא ציינה בcytosol, מסמן צריכה להיות מושלכת. לרכוש ברצף שני ערוצים, אם יש צורך כמה תמונות לרכוש וממוצע התמונות כדי לשפר את איכות תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחומציות תא מהדק כיול באמצעות מאגרים עם יונופורים ב-pH שונה ולרכוש לפחות 20 תאים לכל pH כפי שתוארה לעיל. לתיאור מפורט של ההליך ואת ההרכב של המאגרים עיינו Bizzarri ועמיתים לעבודה. 16 אנו מציעים למדוד לפחות 5 נקודות מpH = 5.5 ל-pH = 7.5. pH מתחת ל -6 הם רעילים לתאים, אך נסבל לזמן קצר, אנו ממליצים לרכוש את התמונות מהר ככל האפשר. אם תאיםמראה סימנים של אפופטוזיס, לבטל את התאים ולהפעיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ImageJ או תוכנה מקבילה לניתוח נתונים. ייבא את התמונות של הערוץ הירוק ואדום, לחסר רקע וליצור פיקסל על ידי הדמיה יחס פיקסל עם האפשרות &quot;מחשבון תמונה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) בחירת התא הרצוי ולמדוד את היחס הירוק לאדום תוך תאיים. לנתח את כל התמונות שנרכשו ולאחר מכן לתכנן את היחס מול ה-pH. בטווח 5.5-7.5 המגמה צריכה להיות ליניארי. נכון ליניארי של הנקודות שהושגו ייתן את עקומת הכיול שישמש להמרת יחס ירוק לאדום לחומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבקרה נוספת לרכוש כמה תאים שלא טופלו (אין יונופורים) ומנסה לחשב pH עם עקומת הכיול שהושגה. יש לקבל ערך בין 7.2 ו7.4. </li></ol> 5. בVivo לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים בוצעו על C57BL/6J (זכרים ונקבות) בין ד לאחר הלידהאיי 28 ו70. הרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של Urethane (כלומר אתיל carbamate) (20% w / v בתמיסת מלח פיסיולוגי, 20 מ&quot;ג / urethane ק&quot;ג). בעלי חיים הוקרבו לאחר ניסוי עם מנת יתר של urethane ואחרי הזרקת intracardiac מאותו חומר ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זריקה תוך שרירית של נתרן זרחה dexamethasone (2 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) כדי להפחית את תגובת לחץ בקליפת המוח ובצקת מוחית במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את ראשו של בעל החיים ולהחיל 2.5% ג&#39;ל לידוקאין לקרקפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך את קפל עור המכסה את הגולגולת של שני ההמיספרות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את העצם החשוף עם מי מלח ובעדינות להסיר את קרום העצם באמצעות מלקחיים. זה יספק בסיס טוב יותר לדבק ומלט שיניים לדבוק בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הודעה ראש פלדת מחוייט עם חדר הדמיה מרכזי ולהדביק אותו עם cyanoacrylate במטוס כ מקביל עם הגולגולת מעל האזור בקליפת המוח של interest ולתקן אותה במקום עם מלט לבן שיניים (Paladur). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הראש של העכבר על מנת לבצע את פתיחת גולגולת של 2-3 מ&quot;מ בקוטר קדח מעל האזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסה למזער את החימום של קליפת המוח במהלך ניתוח, דמעות dural, או דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקליפה superfused עם ACSF סטרילי (126 mM NaCl, 3 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 1.3 מ&quot;מ MgSO 4, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 2.4 מ&quot;מ CaCl 2, 15 גלוקוז מ&quot;מ, 1.2 HEPES מ&quot;מ במזוקק H 2 O , PH = 7.4). </li></ol> 6. ההדמיה pH במוח העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הנשימה Animal Aid ניסוי מתן O אוויר מועשר-2. חמצן מועשר עד 80%. O 2 לחץ וזרימה חלקיים לעתים קרובות מותאם לקבלת סיוע נשימה נכונה. שמור על טמפרטורה קבועה בגוף על 37 מעלות צלזיוס בשמיכת חימום משוב מבוקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את בעלי החיים באמצעות דואר הפלדה תחת המטרה של שתי תמונותהתקנת ההדמיה n. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להזריק את החיישן בקליפת המוח לטעון פיפטה זכוכית המכילה אלקטרודה AgCl (קוטר קצה 4 מ&quot;מ) עם פתרון dendrimer (1 מיקרומטר). האלקטרודה תאפשר להקליט פוטנציאלים בתחום תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התקנת microinjection להכניס את פיפטה בקליפת המוח בכ 150 עומק מיקרומטר. הזרק ל1-2 דקות בלחץ של 0.5 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את ההתקנה האופטית להדמיה. כוח הלייזר צריך להיות מותאם כדי למזער photobleaching וניזקים. בדרך כלל כוח הלייזר המועסק הוא בסביבות 20 mW ורווח PMT נשמרו קבועים ב667 V מאז הכיולים הקודמים הראו כי מתח זה נותן יחס S / N הטוב ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה להלהיב את החיישן ב820 ננומטר ולזהות בו זמנית והעמסת וקרינת rhodamine דרך מסנני FITC וTRITC סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזמן מדידות נפתרו סדרת זמן לשגות לרכוש ב2 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיקון רקע לרכוש מסגרת כהה עם laseתריס r סגור כדי למדוד את הרעש התרמי הממוצע הנובע בPMTs והכן מתווסף בדרך כלל על ידי האלקטרוניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים לבצע את אותו ההליך שדווח בסעיף 4. </li></ol>

<ol><li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Toolbox+for+Assessing+Protein+Location+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li>
<li>Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+imaging+using+fluorescent+dyes%3A+artefacts+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution.</a> Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).</li>
<li>Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+and+Subcellular+Targeting+of+Dendrimer-Based+Fluorescent+pH+Sensors+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+dendrimers+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Designing dendrimers for biological applications.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).</li>
<li>Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+doxorubicin-functionalized+bow-tie+dendrimer+cures+mice+bearing+C-26+colon+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).</li>
<li>Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimers+and+DNA%3A+combinations+of+two+special+topologies+for+nanomaterials+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).</li>
<li>Rakow, N. A., Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+sensor+array+for+odour+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A colorimetric sensor array for odour visualization.</a> Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).</li>
<li>Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocatalytical+properties+of+polymethylferrocenyl+dendrimers+and+their+applications+in+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing.</a> Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).</li>
<li>Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyrin+and+tetrabenzoporphyrin+dendrimers%3A+tunable+membrane-impermeable+fluorescent+pH+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).</li>
<li>Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer+internalization+and+intracellular+trafficking+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells.</a> Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).</li>
<li>Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bioactivity+of+internally+functionalized+cationic+dendrimers+with+PEG+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores.</a> Biomacromolecules. , (2012).</li>
<li>Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Functionalization+of+Dendrimers+Regulates+Internalization+and+Intracellular+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells.</a> Bioconjugate chemistry. , (2012).</li>
<li>Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nature. 7 (9), 755-759 (2010).</li>
<li>Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+GFP-based+ratiometric+excitation+and+emission+pH+indicator+for+intracellular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies.</a> Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).</li>
<li>Albertazzi, L., Brondi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+fluorescent+indicators%3A+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications.</a> PloS one. 6 (12), e28450(2011).</li>
<li>Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Trackable+Dendritic+Scaffolds+and+Delivery+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).</li>
<li>Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intracellular+chloride+and+pH+measurements+using+a+GFP-based+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor.</a> Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).</li>
<li>Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+Needle+in+a+Haystack%3A+Identification+of+EGFP+Tagged+Neurons+during+Calcium+Imaging+by+Means+of+Two-Photon+Spectral+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+molecular+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96(2012).</li>
<li>Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+Probes+Handbook%2C+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, (2010).</li>
</ol>

ברירת מחדל: יש לי מחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים עבור הדמיה pH מוצלחת עם חיישנים מבוססי dendrimer הם: א) הבחירה של פיגום הדנדריטים הנכון ומספר אינדיקטורים מצומדת אליו וii) אופטימיזציה של פרוטוקול מסירה חיישן בתאים או בגוף חי. ההליך הסינתטי הוא קל למדי וניתן ליישם כמעט על כל פולימר hyperbranched נושאות אמין. ניתן להשיג החיישנים מdendrimers זמין מסחרי וצבעים הופעלו-NHS בצעד אחד. אנו מאמינים כי הליך מודולרית וברור שזה יהיה מועיל עבור היישו...

השימוש במולקולות ניאון לתייג מולקולות ביולוגיות רלוונטיות ספציפיות השתנתה לחלוטין את הדרך בה אנו לומדים במערכות ביולוגיות. Widefield ומיקרוסקופיה confocal אפשרה להדמיה בזמן אמת ברזולוציה הגבוהה של תהליכים ביולוגיים וכיום הם בין הטכניקות הפופולריות ביותר ללמוד אירועים ביולוגיים במבחנה, בתאי in vivo. 1 שיפור רלוונטי היה מיוצג על ידי הפיתוח של אינדיקטורים הקרינה , צבעים כלומר הקרינה שתלויה בריכוזה של ישות מולקולרית ספציפית. מדדי ה-pH וסידן בפרט היו השפעה דרמטית על המחקר של פיזיולוגיה של תא עקב הרלוונטיות עצומות של H + ו Ca 2 + יונים בביולוגיה. 2,3 עם זאת, רוב צבעי החישה הנוכחיים כמה מגבלות פנימיות הקשורים להתנהגות המולקולה הקטנה שלהם, כגון: א) קשיים בtargeti subcellularng; ii) מסיסות עניות במים וכתוצאה מכך biocompatibility עניים;. וiii) דליפת תא ובכך חוסר היכולת הארוכה זמן לשגות הדמיה 4 יתר על כן, את האות של בדיקות רבות לא ניתן לתקן עבור התלות בריכוז הצבע (שאינה ההדמיה ratiometric) ולכן, מדידה מוחלטת בתאים או בvivo היא לא אפשרית. לאחרונה תוארו המתודולוגיה פשוטה ויעילה כדי להתגבר על המגבלות האלה, המבוססות על נטיה של צבעי חישה על פיגום dendrimer. 5 Dendrimers הם פולימרים hyperbranched monodisperse עם מאפיינים מאוד מושך עבור יישומים ביולוגיים. 6 בפרט כמה ארכיטקטורות הדנדריטים פותחו ומשמשות לתרופה 7 ומסירת גן. 8 רק לאחרונה מספר קבוצות התחילו לחקור את הפוטנציאל של מולקולות אלה כפיגום למכשירי חישה. 9,10,11 אנחנו בעברתאר מסלול קל סינטטי כלפי functionalization של polyamidoamine שונה פיגומים (Pamam) המבוסס על אסטרים הופעלו-NHS. ניתן להשיג 12 Conjugates בשלב אחד בדרך של דיאליזה כטיהור בלבד. מעניין גישה זו יכולה בקלות להיות מיושמת על מגוון רחב של פיגומים הדנדריטים או פולימרים. 13,14 כדי להשיג dendrimers ההדמיה ratiometric היו עם שני סטים של צבעים שכותרתו כפולים: א) אינדיקטור pH (כלומר העמסה) וii) מחצית pH עצמאי ניאון (כלומר rhodamine). זה אפשר לנו לבצע הדמיה מדויקת של pH כיחס בין ההעמסה וrhodamine הוא רק תלוי בחומציות ולא יותר על הריכוז של החללית. גישה מעניינת נוספת לנושא זה מיוצגת על ידי השימוש בבדיקות המבוססים על חייו. 15 כחיים אינם תלויות בריכוז בדיקה מדידות אלה לא צריכים תיקון ratiometric. עם זאת, lifמדידות etime דורשות התקנת אינסטרומנטלי מסובכת יותר והרזולוציה של הזמן שלהם היא תת אופטימלית לתהליכים פיסיולוגיים במהירות, ובכך להגביל היישומים הפוטנציאליים שלהם. על מנת לבצע הדמיה תאית, החללית צריכה להיות מועברת על פני קרום הפלזמה לתוך cytosol. כdendrimers לא קרום חדיר בשל הגודל וhydrophilicity, משלוח תאיים יכול להיות מושגת באמצעות electroporation. באמצעות טכניקה זו, בשימוש נרחב בביולוגיה לtransfection, מקרומולקולות שכותרתו יכולה להיות מועברות בצורה יעילה לתאים לבצע הדמיה באיכות גבוהה. יתר על כן, עם electroporation ניתן להימנע מסיבוכים הקשורים לאנדוציטוזה dendrimer כמקרומולקולות מועברות ישירות לציטופלסמה. מעניין אחרי dendrimers שונה electroporation תערוכות מגוירים מובחן בתוך התאים גם בהיעדרו של כל רצף מיקוד ספציפי. 5 passiv זהדואר מיקוד, רק בשל מאפייני physicochemical של dendrimer, ניתן לנצל כדי להשיג הדמיה pH אברון הספציפי. הדמיה ratiometric יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ההעמסה וrhodamine, קוולנטית מצומדת לפיגום הדנדריטים, היו צילמו בנפרד ומפת יחס פיקסל אחר פיקסל נוצרה. כמה נהלים כדי לשלוט ברמת חומציות תוך תאית בתאים חיים באמצעות יונופורים דווחו. יונופורים הם מולקולות קטנות הידרופובי מסוגלים להעביר יונים על פני קרום הפלזמה; יונופורים עבור H + יון, כגון nigericin, זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכייל את החיישנים מבוססי dendrimer 16 מדידות אלה חשפו תגובה ליניארי ל-pH באופן דומה למה שנצפה. במבחנה. על בסיס ה-pH תאית כיול ניתן היה למדוד באופן מדויק. מדידות אלה הראו כי חיישן מבוסס dendrimer יכול להיות כלי רב ערך במחקר H + homeostאס בתאים חיים ובתהליכים פתולוגיים שכרוך בתקלות ויסות רמת חומציות. לאחרונה הוכיחו כי יכולים להיות מיושמים גם חיישני pH מבוסס dendrimer in vivo, ביצוע ההדמיה pH במוח של עכברים מורדמים. 17 בשל הסביבה המורכבת של רקמות חיות באיכות גבוהה בחישת vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית. כאן אנו מראים תיאור מפורט של ההליך ניסיוני להדמית pH in vivo עם דגש של הסוגיות מכריעות לטפל לבצע הדמיה מדויקת של pH במוח. שני הפוטונים במיקרוסקופ כבר מועסק משתי סיבות עיקריות: א) השימוש באור אינפרא אדום מאפשר להתגבר על חוסר חדירה לרקמות של מיקרוסקופיה confocal הסטנדרטי; ii) את ספיגת שני פוטונים הרחב של העמסה וrhodamine מאפשרת העירור בו זמנית שלהם הימנעות סיבוכים הקשורים לשימוש בשני אורכי גל לעירור. מדידות pH במוח עכבר היוביצע בהצלחה החוצה; חיישנים בקלות להגיב להיפוקסיה לגרום לשינוי של ה-pH במרחב תאי במוח. מדידות אלו מראות כי אינדיקטורים המבוסס על dendrimer יכולים לשמש בהצלחה כדי להדגיש את השינוי פיסיולוגי ופתולוגיים של pH in vivo במודל חיה.

<table><tbody><tr><td>PAMAM G4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>412449</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein NHS אסטר</td><td>Life technologies</td><td>C-1311</td><td></td></tr><tr><td>TMR NHS ester</td><td>Life technologies</td><td>C-1171</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dyalsis שקיות</td><td>ספקטרום לאבס</td><td>132117</td><td></td></tr><tr><td>WillCo Dishes</td><td>WillCo Wells</td><td>GWSt-3512</td><td></td></tr><tr><td>אורטן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U2500</td><td></td></tr></tbody></table>

סינתזה, משלוח נייד ו<em&gt; בvivo</em&gt; יישום של חיישני ph מבוססי dendrimer

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

הפיתוח של אינדיקטורים ניאון ייצג מהפכה למדעי חיים. מבחינה גנטית מקודד וfluorophores הסינתטי עם יכולות חישה אפשר להדמיה של מינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. צבעים סינטטיים הם של עניין מיוחד הודות לtunability הגבוה שלהם ואת מגוון הרחב של analytes למדידה. עם זאת, מולקולות אלה סובלים מספר מגבלות הקשורות להתנהגות מולקולה קטנה (מסיסות ירודה, קשיים במיקוד, לעתים קרובות אין הדמיה ratiometric מותרת). בעבודה זו אנו מציגים את הפיתוח של חיישנים מבוססי dendrimer ולהציג את הליך למדידת רמת חומציות במבחנה, בתאים חיים וin vivo. אנחנו בוחרים dendrimers כפלטפורמה אידיאלית עבור החיישנים שלנו עבור רבים תכונותיהם רצויות (monodispersity, תכונות מתכונן, multivalency) שגרמו להם פיגום בשימוש נרחב לכמה מכשירים ביו. נטיה של pH הניאוןאינדיקטורים לפיגום dendrimer הובילו לשיפור של הופעות החישה שלהם. בפרט תערוכת dendrimers הקטינה זליגת תא, מיקוד תאיים משופר ויאפשר מדידות ratiometric. חיישנים אלה רומן הועסקו בהצלחה למדידת רמת חומציות בתאים חי הלה ובחי במוח עכבר.

איור 1 מציג ייצוג סכמטי של נטיה של חישת צבעים לפיגומים הדנדריטים שונים. ניתן להשיג אינדיקטורים וכתוצאה מכך צעד סינטטי קל אחד ממוצרים זמינים מסחרי. dendrimers אמין נושאות הם הגיבו בצבעים הופעלו-NHS בDMSO ומטוהר על ידי דיאליזה. נוהל כללי זו כבר שימש בהצלחה עבור תיוג של מספר dendrimers: i) dendrimer Pamam דור 2, 4 ו -6; 12 dendrimers pegylated Pamam 17 וכלאיים PEG-הדנדריטים 18. כdendrimers הברור להראות אינטראקציות שונות עם תאים ורקמות...

חיישני הקרינה הם כלים רבי עוצמה בתחום מדעי חיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה לסנתז ולהשתמש בחיישני ניאון מבוסס dendrimer למדוד pH בתאים חיים וin vivo. הפיגום הדנדריטים משפר את תכונותיהם של צבעי ניאון מצומדות המובילים למאפייני חישה משופרים.

סינתזה, משלוח נייד ו<em&gt; בvivo</em&gt; יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לפתח חיישנים פלואורסצנטיים חדשים המבוססים על דנדרימרים עם תכונות משופרות לדימות pH in vitro בתאים חיים ו-in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי הצמדה של צבעים רגישים ל-pH לפיגום דנדריטי יחד עם רכיבים אחרים, כגון קבוצות מיקוד או צבעים שאינם רגישים ל-pH. לאחר מכן, נבצעות מדידות in vitro ליצירת עקומת כיול pH לצורך דימות pH בתאים חיים.החיישן מוחדר באמצעות אלקטרופורציה ומפות pH נוצרות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמות את ה-pH במרווח החוץ-תאי של המוח. במהלך פעילות עצבית פיזיולוגית ופתולוגית, החיישן מוזרק במיקרו-הזרקה למוחן של עכברים תחת הרדמה. נתוני פלואורסצנציה נאספים לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולים.התוצאות שהתקבלו מראות כי חיישנים המבוססים על drimmer מצליחים למדוד שינויי pH ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, הן בתאים חיים והן in vivo. למרות שנעשה כבר שימוש במספר צבעי פלואורסצנציה בעלי התנהגות רגישה ל-pH, הם סובלים ממספר חסרונות, כגון ניידות נמוכה ודליפה מהתא. יתרה מכך, הם אינם מאפשרים מדידה מוחלטת מדויקת.כאן הדגמנו את הצמדתם של צבעים רגישים ל-pH לפיגום גנטי D, ומכיוון שהביצועים מאפשרים מדידה מדויקת ברזולוציה מרחבית וזמנית, שיטה זו עשויה להוות כלי שימושי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים המהווסים על ידי pH בתאים חיים. שיבושים בבקרת ה-pH במערכת העצבית קשורים למספר מצבים כמו שבץ ואפילפסיה, וחיישני pH זמינים הוכחו כבעלי יעילות נמוכה, מה שהוביל לתכנון החיישן המוצג. למרות ששיטה זו יושמה כאן לדימות pH, זוהי גישה כללית שניתן ליישמה על מינים ביולוגיים רלוונטיים אחרים.בבחירת צבע הגילוי של הרווח, הגישה הסינתטית הפשוטה והורסטילית הופכת את ההליכים הללו לישירים. היום ידגימו את ההליך Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody ו-Sebastian Suli לצורך הצמדה של אינדיקטורים של pH ל-Piam Demers. התחילו בהמסה של ה-rimer ב-DMSO אנहाइडרי בריכוז סופי של 50 micromolar.הכינו תמיסות סטוק בריכוז 10 micromolar של fluorescein NHS ו-Tetraethyl RUMINE NHS, הידוע גם כ-TMR, ב-DMSO אנहाइडרי בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה; שלבו מיליליטר אחד של תמיסת g four peram dederer עם שמונה שוויות, או 40 microliters של fluorescein ושמונה שוויות, או 40 microliters של TMR. היחס המולרי בתערובת ישקף את כמות הצבעים שנטענו על ה-demer. ערבבו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.בשלב הבא, דללו את התערובת ביחס של 1:10 במים דה-יוניים והעבירו את תערובת התגובה לשקית דיאליזה עם סף משקל מולקולרי של 10 kilodaltons; בצעו דיאליזה אל מול מים דה-יוניים והחליפו את המים במאגר שלוש פעמים במהלך 24 שעות. למחרת, העבירו את התמיסה לבקבוק זכוכית והקפיאו בטמפרטורה של minus 80 למשך מספר שעות. כאשר התמיסה קפואה לחלוטין, העבירו את הבקבוק לליופיליזר ובצעו ייבוש בהקפאה למשך 24 שעות.יש לקבל אבקה סגולה, להניח שהמוצק שהתקבל הוא גלי, ולהמיס אותו במים מסוג mqe. בריכוז סופי של 10 micromolar. יש לחלק את התמיסה למנות של 50 microliter באבובות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter, ולאחסן אותן בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.עבור כיול in vitro, הכין תמיסה של 500 nanomolar של D drummer ב-PBS בריכוז two millimolar בתוך קוביית קוורץ Q vet. נעשה שימוש בבופר PBS מדולל מאוד כדי למנוע שינויים חדים ב-pH במהלך הטיטרציה. מדוד את ספקטרומי הפליטה של fluorescein ו-TMR ובצע אופטימיזציה להגדרות האופטיות של הפלורימטר כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.בשלב הבא, בצעו תיתוּר pH על ידי הוספה של נפחים קטנים של sodium hydroxide בריכוז 0.1 normal ושל hydrochloric acid בריכוז 0.1 normal. לאחר כל הוספה, נערו את ה-Q vet כדי לערבב. המתינו דקה אחת להשגת שיווי משקל ולאחר מכן מדדו את ה-pH באמצעות מד pH.יש להקליט ספקטראי פליטה של מיקרו-אלקטרודה עבור fluorescein ו-TMR עבור כל שלב ללא כל שינוי. בהגדרות האופטיות, יש לשרטט את עוצמת הפלואורסצנציה כפונקציה של pH. עבור הטיטרציה, אות ה-rod domine לא אמור להיות מושפע מה-pH.אות הפלואורסצאין צריך להיות עקומת סיגמואיד ויש להתאימו למודל קישור בודד עם PK של 6.4 עבור אלקטרופורציה. העבר שש פעמים 10 בחזקת 5 תאי hela ב-72 µL למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL של תאים שהושעו. הוסף dendri או תמיסה מימית בריכוז של 2 µM, הוסף 3 mL של באפר אלקטרופורציה למבחנת מיקרו-פורציה.לאחר מכן, בעזרת טיפ electroporation של 10 µL, שאבו את תערובות התאים והפראימרים. בשלב הבא, הכניסו את המיקרו-פיפט לתחנת הפיפטינג והגדירו כאן את תנאי פולס ה-micro puration. מתח הפולס נקבע ל-1005 volts.רוחב הפולס נקבע ל-35 milliseconds, ומספר הפולסים נקבע לשניים לאחר לוח הפולסים. העברו 20 µL של התאים שעברו אלקטרופורציה לצלחות עם תחתית זכוכית המכילות מצע טרי ללא אנטיביוטיקה. 12 שעות לאחר האלקטרופורציה, דגמו את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תוך שימוש בסט פילטרים סטנדרטי עבור fluorescein ו-rhodamine.התמקדו בדגימה וכוונו את הספק הלייזר ואת הגבר הגלאי כדי למקסם את יחס אות לרעש. אם האלקטרופורציה הצליחה, התאים אמורים להפגין פלואורסצנציה חזקה בשני הערוצים. הלוקליזציה תלויה בגודל ובמטען של ה-D שנעשה בהם שימוש. לעיתים קרובות.לוקליזציה ליזוזומלית של Sun, הנראית כשלפוחיות פרי-נוקליאריות קטנות, קיימת עקב אנדוציטוזה או מדוריות משותפת (compartmentalization). אם הלוקליזציה הליזוזומלית היא הדומיננטית, כאשר מרבית הפלואורסצנציה ממוקמת בתוך שלפוחיות ואות נקבובי נצפה בציטוזול, הדבר מעיד על רעילות ויש להשליך את המדידות.רכשו את שני הערוצים באופן רציף, רכשו מספר תמונות ובצעו ממוצע של התמונות כדי לשפר את איכות התמונה. כדי ליצור עקומת כיול pH, השתמשו בבופרים עם opfor בערכי pH שונים כדי להשוות את ה-pH התו-תאי והחוץ-תאי לאותו ערך. רכשו לפחות 20 תמונות תאים לכל pH ומדדו לפחות חמש נקודות מ-pH 5.5 עד pH 7.5.יש לזכור כי pH B six רעיל לתאים אך ניתן לסבול אותו למשך זמן קצר, ולכן יש להשיג תמונות בפרק הזמן הקצר ביותר האפשרי. אם נראים סימנים לאפופטוזיס, יש להשליך את התאים ולהתחיל מחדש. לאחר ההשגה.השתמש ב-Image J או בתוכנה מקבילה לצורך ניתוח הנתונים. ראשית, קבע את היחס בין הצבע הירוק לאדום. לאחר מכן, שרטט את היחס כפונקציה של pH כדי להפיק מגמה ליניארית שתספק עקומת כיול, שניתן יהיה להשתמש בה להמרת יחס ל-pH בניסויים עתידיים.להכנת דגימות in vivo, התחילו עם עכברים זכרים ונקבות מזן C 57 black six J בין היום ה-28 ל-70 לאחר הלידה. לאחר הרדמת העכברים באמצעות urethane, בצעו צביטה בבהו למינוי שהחיה מורדמת לחלוטין, ומרחו משחה לעיניים כדי להפחית את תגובת הסטרס הקורטיקלית ואת הבצקת המוחית. במהלך הניתוח, והזריקו שתי מיליגרם לקילוגרם משקל גוף של dexamethasone, sodium phosphate באופן תוך-שרירי.בשלב הבא, גלחו את ראש החיה באמצעות מספריים כירורגיים, לאחר מכן הניחו סדין כירורגי ומריחו ג'ל lidocaine 2.5% על הקרקפת. השתמשו במספריים כדי לחתוך את שלפית העור המכסה את הגולגולת בשני ההמיספרים. שטפו את העצם החשופה בתמיסת סלין והסירו בעדינות את הפריאוסטאום (periosteum) באמצעות פינצטה.פעולה זו תספק משטח הידבקות טוב יותר. עבור הדבק ומלט השיניים, יש להשתמש בפין ראש פלדה בהתאמה אישית עם תא דימות מרכזי, ולהדביקו למקומו באמצעות cyanoacrylate במישור המקביל בקירוב לגולגולת מעל אזור העניין הקורטיקלי. קבעו את הפין למקומו באמצעות מלט שיניים לבן.קבע את ראשו של העכבר ובצע קרניוטומיה (פתח בגולגולת) בקוטר של שני עד שלושה מילימטרים באמצעות קידוח מעל אזור העניין. במהלך תהליך הקידוח, השתמש לעיתים קרובות במזרק להחלת A CSF סטרילי וטרי על הגולגולת כדי למזער את חימום הקורטקס במהלך הניתוח. לאחר הקרניוטומיה, העבר את החיה לבמת הדימוג כדי לשמור על ראשו של העכבר ללא תנועה תחת העדשה.הברג את תא ההדמיה לעמוד המתכוונן. התקן מחסום פלסטיק בהתאמה אישית המחובר לחמצן. דבר זה יספק אוויר מועשר בחמצן במהלך הניסוי כדי לסייע בנשימת בעל החיים.כדי להזריק את החיישן לקליפת המוח, טענו פיפטת זכוכית בעלת קוטר קצה של ארבעה מילימטרים ואלקטרודת כסף כלוריד. באמצעות תמיסת drimmer ER בריכוז one micromolar, האלקטרודה תסייע בהקלטת פוטנציאלי שדה חוץ-תאיים באמצעות מערך למיקרו-הזרקה. הכניסו את הפיפטה לקליפת המוח לעומק של כ-150 microns.הזרק למשך דקה עד שתי דקות בלחץ של 0.5 pounds per square inch כדי לייעל את המערך האופטי לצילום. כוונן את עוצמת הלייזר כדי למזער פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching) ונזק פוטו-כימי. בדרך כלל, עוצמת הלייזר בשימוש היא כ-20 milliwatts, והגבר ה-PMT נשמר קבוע על 667 volts.הגדירו את אורך גל הלייזר כך שיעורר את החיישן ב-820 nanometers והנחו את התוכנה לזהות פלואורסצנציה של fluorescein ושל rod domine בו-זמנית באמצעות מסנני FTSE ו-trit סטנדרטיים. כמו כן, הגדירו את תדירות הרכישה לקצב פריימים של two hertz לצורך תיקון רקע. רכשו פריים חשוך כאשר תריס הלייזר סגור כדי למדוד את רעש התרמי הממוצע הנוצר ב-PMTs וב-pedestal.לבסוף, רכשו תמונות פלואורסצנציה תלויות pH ושמרו אותן לצורך ניתוח עוקב. נתחו את הנתונים כפי שבוצע קודם לכן כדי להעריך את ההתנהגות in vitro של fluorescein ו-rumine. לאחר הטענה על ה-rimer, בוצעה טיטרציית pH באמצעות פלואורימטר.איור זה מציג טיטרציה טיפוסית של חיישן pH. ניתן לעורר באופן נפרד Fluorescein ו-rhodamine באורכי גל של 488 nanometers ו-550 nanometers בהתאמה, מה שמאפשר מינימום crosstalk בין שני הערוצים, כפי שניתן לראות בבירור. Fluorescein מראה התנהגות תלוית pH, בעוד שאות ה-rhodamine אינו משתנה באופן משמעותי בטווח ה-pH הפיזיולוגי.לפיכך, היחס בין שני אותות אלו אינו תלוי בריכוז החיישן, אלא ב-pH בלבד. כדי להחדיר את האינדיקטור לתאי HeLa, התאים עברו אלקטרופורציה עם חיישני ה-dederer, ובוצע דימוי קונפוקאלי כפי שמתואר בסרטון זה. תמונות קונפוקאליות אלו מציגות את התאים בערוץ הפלואורסצאין משמאל, בערוץ ה-R domine במרכז, וכמפה רציומטרית של pH מימין.נצפו אותות פלואורסצאין ו-r domine חזקים, אשר מראים קולוקליזציה המעידה על שלמות מבנה החיישן. מפת יחס (ratiometric map) נבנית על ידי חלוקה של שתי התמונות פיקסל אחר פיקסל, ומוצגת באמצעות סולם צבעי פסאודו. כדי לכייל את תגובת החיישן בתוך תאים, בוצע קיבוע pH באמצעות יוניפורים כפי שמוצג כאן.אינדיקטורים מגיבים במהירות ל-pH באמצעות שינוי ביחס שבין הצבע הירוק לאדום. הנתונים שהתקבלו שימשו ליצירת עקומת כיול למדידות pH מדויקות. המגמה הליניארית בכיול מדגימה את יכולתו של החיישן להגיב ל-pH ללא כל הפרעה מהסביבה התאית.כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בחיישנים מבוססי דנדרימרים להדמיה in vivo, בוצעה הדמיית pH במוחו של עכבר הרדום שזורק לו דנדרימר. אותות של פלואורסצאין ורודמין התקבלו בו-זמנית בעזרת עירור של 820 ננומטר, ומפת היחס נבנתה על בסיס פיקסל אחרי פיקסל באופן דומה למדידות בתאים חיים. ראוי לציין כי האינדיקטורים ממוקמים במרווח הבין-תאי; האזורים שאינם פלואורסצנטיים בתמונה מזהים גופי תאים או כלי דם קטנים, וזאת כדי לאמת את תגובת החיישן ל-pH.השתמשנו בהיפרקפניה (hypercapnea). ידוע כי פחמן דו-חמצני משנה את שיווי המשקל של בופרי הפחמתיות בדם וברקמות, דבר המוביל להחמצת הרקמה. כפי שניתן לראות בתרשים זה, שאיפה של 30% carbon dioxide מספיקה כדי להשרות תגובה חזקה של החיישן, אשר הפיכה לחלוטין עם חזרתו של העכבר לנשימה רגילה.תוצאות אלו מדגימות את הפוטנציאל של חיישנים מבוססי ofer להדגשת שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב-pH בתאים חיים וב-in vivo. בנוסף, הפרוצדורה שלנו תואמת למדידות אחרות, כגון רישומים אלקטרופיזיולוגיים. דבר זה אפשר להשיג בו-זמנית מידע משלים על התהליך הביולוגי המתרחש.שיטה זו, לאחר פיתוחה, סללה את הדרך עבור חוקרים בביולוגיה של התא ובנוירוביולוגיה לחקר תהליכים המוסדרים על ידי pH בתאי תרבית וב-in vivo.

synthesis-cellular-delivery-vivo-application-dendrimer-based-ph

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מציגים עקרונות של מדידות חמצן על ידי מרווה זרחני ועיצוב סקירה של porphyrin מבוססי nanosensors הדנדריטים הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות.

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

מאמר זה מפרט את הבנייה של חיישן microneedle מבוסס multiplexed. המכשיר מפותח עבור בדגימה באתרו וניתוח אלקטרוכימי של analytes מרובים בצורה מהירה סלקטיבית. אנחנו מדמיינים ברפואה קלינית מחקר ביו משתמש עבור אלה microneedle מבוססי חיישנים.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

הסינתזה של מינים אסימטריים של פרוקן מאתגרת באמצעות טכניקות תמיסה.  דוח זה מתמקד בשיטות שבוצעו לייצור ביו-מצומד פרוקן-ביוטין באמצעות תגובות קלות ונקיות המושגות באמצעות סינתזה בשלב מוצק.  שילוב של חלק תיולט הוכח כמקנה את היכולת לקיבוע על משטחי זהב.

מתודולוגיה סינתטית למערכות ביו-המצומד Asymmetric Ferrocene נגזרו באמצעות מתודולוגיה המבוססת על שרף שלב מוצקה

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה ואפיון של תהודה מגנטית dendrimeric חומר ניגוד (MRI) שנושא chelates macrocyclic המבוסס cyclen תיאום יוני גדוליניום פאראמגנטיים. בסדרת ניסויי MRI במבחנה, סוכן זה מיוצר אות MRI מוגברת בהשוואה האנלוגית monomeric הזמין המסחרי.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון חומרי ניגוד מבוססי dendrimer עבור דימות תהודה מגנטית

אנו מציגים פרוטוקול להנדסת שלב העטרה של ננו-צינורות פחמן פלואורסצנטיים קרובים לאינפרא אדום (SWNTs) באמצעות פולימרים אמפיפיליים ו-DNA לפיתוח חיישנים למטרות מולקולריות ללא אלמנטים ידועים לזיהוי.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

שיטה להשיג nanopatterns לא אחידה מבוססי דנדרימר כי היתר שליטה ננו של מקומיים ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה (RGD) משטח צפיפות תיאר, הוחל על המחקר של תאית התמיינות אדהזיה ו- chondrogenic.

דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של מולקולות בשפע נמוך פתרונות מורכבים באמצעות מולקולרית החתמה בשילוב ביוסנסור קיבול.

זיהוי העדינה של סמנים ביולוגיים באמצעות הטבעה מולקולרית מבוסס ביוסנסור קיבולי

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

העבודה הנוכחית שואפת לשמש כמדריך מעשי המאפשר לחוקרים להכין מכשירי DMAP משלהם באמצעות שיטת יציקת הממס, הידועה גם כמיקרו-molding, ולבצע אפיון בסיסי.

מערך מערך מיקרו-מחטים הממוסס המיוצר בטכניקת יציקת ממס ואפיון חיוני של מכשירים ביומדיים מבוססי מיקרו-מחטים

למדו סינתזה ויישום של חיישני pH פלואורסצנטיים מבוססי דנדרימר לדימות תאים חיים ומוח בעכברים. השיטה משתמשת באלקטרופורציה ומיקרוסקופיית קונפוקל לדיוק גבוה.

סינתזה, משלוח נייד ו

גלה סרטונים נוספים