סינתזה, משלוח נייד ו בvivo יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer
September 10th, 2013
חיישני הקרינה הם כלים רבי עוצמה בתחום מדעי חיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה לסנתז ולהשתמש בחיישני ניאון מבוסס dendrimer למדוד pH בתאים חיים וin vivo. הפיגום הדנדריטים משפר את תכונותיהם של צבעי ניאון מצומדות המובילים למאפייני חישה משופרים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח חיישנים פלואורסצנטיים חדשים המבוססים על מתופפי Dun עם תכונות משופרות להדמיית pH במבחנה בתאים חיים וב-vivo. זה מושג על ידי צימוד צבעים רגישים ל-pH לפיגום דנדריטי יחד עם חלקים אחרים, כגון קבוצות מיקוד או pH בצבעים רגישים. ומדידות במבחנה נלקחות כדי ליצור עקומת כיול pH לצד pH תמונה בתאים חיים.
החיישן מועבר על ידי אלקטרופורציה ומפות pH נוצרות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיית pH בחלל החוץ-תאי של המוח. במהלך פעילות עצבית פיזיולוגית ופתולוגית, החיישן מוזרק מיקרו למוחם של עכברים מורדמים. לאחר מכן נרכשים נתוני הקרינה באמצעות שני מיקרוסקופ פוטונים.
התוצאות שהתקבלו מראות כי חיישנים מבוססי טפטוף מצליחים למדוד שינויים ב-pH ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, הן בתאים חיים והן ב-vivo. למרות שכבר נעשה שימוש בכמה צבעי ארובות עם התנהגות רגישה ל-pH, הם סובלים ממספר חסרונות, כגון ניידות לקויה ודליפת תאים. יתר על כן, הם אינם מאפשרים מדידה מוחלטת של מדד פריחה.
כאן הדגמנו את החיבור של צבעים רגישים ל-pH לפיגום גנטי D, ומכיוון שהביצועים מאפשרים מדידה מדויקת ברזולוציה המיוחדת והזמנית, שיטה זו יכולה להיות כלי שימושי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים המווסתים על ידי pH בתאים חיים. ההפרעה בוויסות ה-pH במערכת העצבים קשורה למספר מצבים כמו שבץ ואפילפסיה, וחיישן ה-pH הזמין הוכיח את עצמו כיעיל בצורה גרועה שהוביל לתכנון החיישן המוצג. למרות שמפגש זה יושם כאן הדמיית pH h, זוהי גישה כללית וניתן ליישם אותה על מינים רלוונטיים ביולוגיים אחרים.
על ידי בחירת צבע חישת הרווח, הגישה הסינתטית הקלה והרב-תכליתית הופכת את ההליכים הללו לפשוטים. מדגימים את ההליך היום יהיו ג'ובאני רה, ברברה טי, מרקו ברודי וסבסטיאן סולי כדי להצמיד מדדי pH לפיאם דמרס. התחל בהמסת הרימר ב-DMSO נטול מים בריכוז סופי של 50 מיקרומולר.
הכן 10 תמיסות מלאי מיקרוטולריות של פלואורסצאין NHS וטטראתיל RUMINE NHS, הידוע גם בשם TMR בנטול מים, DMSO בצינור מיקרו צנטריפוגה משולב, מיליליטר אחד של תמיסת G ארבעה פרם דדרר עם שמונה שווי ערך, או 40 מיקרוליטר פלואורסצאין ושמונה שווה ערך, או 40 מיקרוליטר TMR. היחס הטוחנת בתערובת ישקף את כמות הצבעים שנטענו על הדמר. מערבבים את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
לאחר מכן, יש לדלל את התערובת מ-1 עד 10 במים נטולי יונים ולהעמיס את תערובת התגובה בשקית דיאליזה עם חיתוך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון דיאליזה כנגד מים נטולי יונים ולהחליף את המים במאגר שלוש פעמים במשך 24 שעות. למחרת מעבירים את התמיסה לבקבוקון זכוכית ומקפיאים אותה במינוס 80 למספר שעות. כאשר התמיסה קפואה לחלוטין, העבירו את הבקבוקון לליופילייזר והקפיא יבש למשך 24 שעות.
יש להשיג אבקה סגולה, לקבל גלי מוצק, ולהמיס אותה במי mqe. בריכוז סופי של 10 מיקרומולר. הוצא את התמיסה ב-50 מיקרוליטר בצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר, ואחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לכיול במבחנה, הכינו תמיסה של 500 ננו-מולרית של מתופף D בשני PBS מילי-מולארי בווטרינר קוורץ Q. מאגר PBS מדולל מאוד משמש כדי למנוע שינויים פתאומיים ב-pH במהלך הטיטרציה. מדוד את ספקטרום הפליטה של פלואורסצאין ו-TMR ובצע אופטימיזציה של ההגדרות האופטיות של הפלואורידמטר כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.
לאחר מכן, בצע טיטרציה של pH על ידי הוספת כמויות קטנות של 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל ו-0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה. לאחר כל הוספה, יש לנער את וטרינר ה-Q כדי לערבב. המתן דקה אחת לשיווי משקל ולאחר מכן מדוד את ה-pH באמצעות pH.
יש לרשום ספקטרום פליטת מיקרו אלקטרודות של פלואורסצאין ו-TMR עבור כל שלב ללא כל שינוי. בהגדרות האופטיות, שרטט את עוצמת הקרינה לעומת ה-pH. עבור הטיטרציה, אות הדומין של המוט לא אמור להיות מושפע מ-pH.
אות הפלואורסצאין צריך להיות עקומה סיגמואידית ויש לצייד אותו במודל מחייב יחיד עם PK של 6.4 לאלקטרופורציה. העבירו שש פעמים 10 לתאי ההלה החמישיים ב-72 מיקרוליטר לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לתאים המרחפים. הוסף דנדרי או תמיסה מימית בריכוז של שתי מיקרומולר, הוסף שלושה מיליליטר, מאגר אלקטרופורציה לצינור טיהור מיקרו.
לאחר מכן, בעזרת קצה אלקטרופורציה של 10 מיקרוליטר, שאפו את תערובות התאים והרימר. לאחר מכן, הכנס את המיקרו פיפטה לתחנת הפיפטה והגדר את תנאי דופק המיקרו טיהור כאן. מתח הדופק מוגדר ל 1005 וולט.
רוחב הדופק מוגדר ל-35 אלפיות השנייה, ומספר הדופק מוגדר לשניים לאחר לוחית הדופק. 20 מיקרוליטר של התאים האלקטרופורטיים על צלחות עם תחתית זכוכית עם מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה. 12 שעות לאחר האלקטרופורציה הדמו את התאים במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות סט מסננים סטנדרטי לפלואורסצאין ו-R דומין.
התמקד בדגימה והתאם את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי כדי למקסם את יחס האות לרעש. אם האלקטרופורציה הצליחה, התאים צריכים להיות פלואורסצנטיים בהירים בשני הערוצים. הלוקליזציה תלויה בגודל ובמטען של ה- D משמשים. לעיתים קרובות.
לוקליזציה ליזוזומלית של השמש, הנראית כשלפוחיות פרי-גרעיניות קטנות קיימת עקב אנדוציטוזיס או מידור קומפליזציה. אם לוקליזציה ליזוזומלית שולטת בה רוב הקרינה ממוקמת בתוך שלפוחיות ונצפה אות נקבוביות בציטוזול. זה מסמל רעילות ויש להשליך מדידות.
רכוש את שני הערוצים ברצף, רכוש מספר תמונות וממוצע התמונות כדי לשפר את איכות התמונה. כדי ליצור עקומת כיול pH, השתמש במאגרים עם אופור ב-phs שונים כדי לגבש את ה-pH התוך-תאי והחוץ-תאי באותו ערך. רכוש לפחות 20 תמונות תאים לכל pH ומדוד לפחות חמש נקודות מ-pH 5.5 עד pH 7.5.
זה מזכיר ש-pH B 6 רעיל לתאים אך ניתן לסבול אותו לפרק זמן קצר, אז רכוש תמונות קצרות ככל האפשר. אם אתה רואה סימן לאפופטוזיס, השלך את התאים והפעל מחדש. לאחר הרכישה.
השתמש בתמונה J או בתוכנה אנלוגית לניתוח נתונים. ראשית, קבע את היחס בין ירוק לאדום. לאחר מכן שרטט את היחס מול ה-pH כדי לייצר מגמה ליניארית שתיתן עקומת כיול שניתן להשתמש בה כדי להמיר יחס ל-pH בניסויים עתידיים.
להכנת דגימה in vivo, התחל עם C 57 שחור שש J ועכברים נקבות בין היום 28 ל-70 לאחר הלידה. לאחר הרדמת העכברים עם אורטן, בצע צביטה בבוהן כדי להבטיח שהחיה מורדמת לחלוטין ומרח משחת עיניים כדי להפחית את תגובת הלחץ בקליפת המוח ואת הבצקת המוחית. במהלך הניתוח יש להזריק שני מיליגרם לק"ג משקל גוף של דקסמתזון, נתרן פוספט תוך שרירי.
לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים, גלחו את ראש החיה, ואז הניחו וילון כירורגי ומרחו ג'ל לידוקאין 2.5% על הקרקפת. השתמש במספריים כדי לחתוך את דש העור המכסה את הגולגולת של שתי ההמיספרות. שוטפים את העצם החשופה במי מלח ובעזרת מלקחיים, מסירים בעדינות את הפריאוסטאום.
זה יספק משטח הידבקות טוב יותר. עבור דבק ומלט דנטלי, יש למרוח עמוד ראש פלדה בהתאמה אישית עם תא הדמיה מרכזי ובאמצעות ציאנואקרילט, הדביקו אותו למקומו במישור המקביל בערך לגולגולת מעל אזור קליפת המוח המבוקש. תקן את העמוד למקומו בעזרת מלט שיניים לבן.
תקן את ראש העכבר ובצע קרניוטומיה בקוטר שניים עד שלושה מילימטרים על ידי קידוח מעל אזור העניין. לעתים קרובות לאורך הליך הקידוח משתמש במזרק כדי למרוח CSF סטרילי טרי על הגולגולת כדי למזער את חימום קליפת המוח במהלך הניתוח. לאחר הגולגולת, העבירו את החיה לשלב ההדמיה כדי לשמור על הראש עדיין מתחת למטרה.
הברג את תא ההדמיה לעמוד המתכוונן. החל לוע פלסטיק בהתאמה אישית המחובר לחמצן. זה יספק אוויר מועשר בחמצן במהלך הניסוי כדי לסייע לנשימה של בעלי חיים.
כדי להזריק את החיישן לקליפת המוח, טען פיפטת זכוכית בקוטר קצה של ארבעה מילימטרים ואלקטרודת כלוריד כסף. עם פתרון ה-ER של ה-ER המיקרו-מולרי האחד, האלקטרודה תקל על רישום פוטנציאל השדה החוץ-תאי עם הגדרת מיקרו-הזרקה. הכנס את הפיפטה לקליפת המוח בעומק של כ -150 מיקרון.
הזרקו למשך דקה עד שתיים בלחץ של 0.5 פאונד לאינץ' רבוע כדי לייעל את ההגדרה האופטית להדמיה. כוונן את עוצמת הלייזר כדי למזער הלבנת תמונות ונזק לצילום. בדרך כלל, הספק הלייזר המופעל הוא בסביבות 20 מילי-וואט, ורווח ה-PMT נשמר קבוע על 667 וולט.
הגדר את אורך גל הלייזר כדי לעורר את החיישן ב-820 ננומטר וכוון את התוכנה לזהות פלואורסצין ומוט דומין פלואורסצנטי בו זמנית באמצעות מסנני FTSE ו-trit סטנדרטיים. הגדר גם את תדר הרכישה לקצב פריימים של שני הרץ לתיקון רקע. רכוש מסגרת כהה עם תריס הלייזר סגור כדי למדוד את הרעש התרמי הממוצע הנוצר ב-PMT ובכן.
לבסוף, רכוש תמונות פלואורסצנטיות תלויות pH ואחסן אותן לניתוח לאחר מכן. נתח את הנתונים כמו קודם כדי להעריך את ההתנהגות במבחנה של פלואורסצאין ורומין. הועמס על הרימר, טיטרציה של pH בוצעה באמצעות פלואורמטר.
איור זה מציג טיטרציה אופיינית של חיישן pH. ניתן לעורר פלואורסצאין ורמין בנפרד ב-488 ננומטר ו-550 ננומטר בהתאמה, מה שמאפשר מינימום דיבור צולב בין שני הערוצים כפי שניתן לראות בבירור. פלואורסצאין מראה התנהגות תלוית pH בעוד שאות R דומין אינו משתנה באופן משמעותי בטווח ה-pH הפיזיולוגי.
לכן, היחס בין שני האותות הללו אינו תלוי בריכוז החיישן, אלא רק ב-pH. לאחר מכן, כדי לספק את המחוון, תאי הלה תוך-תאיים עברו אלקטרופוציה עם חיישני הדדרר ובוצעה הדמיה קונפוקלית כמתואר בסרטון זה. תמונות קונפוקליות אלה מציגות את התאים בתעלת הפלואורסצאין משמאל, את תעלת הדומין R באמצע, ומוצגות כמפה מטרית של יחס pH מימין.
נצפים אותות פלואורסצאין ו-r דומין חזקים, אשר מתמקמים יחד ומדגימים את שלמות מבנה החיישן. מפת יחס מטרית משוחזרת על ידי חלוקת שתי התמונות פיקסל אחר פיקסל ומיוצגת בסולם צבעים מדומה. כדי לכייל את תגובת החיישן בתוך התאים, בוצעה הידוק pH עם יונופורים כפי שמוצג כאן.
אינדיקטורים מגיבים בקלות ל-pH עם שינוי היחס בין ירוק לאדום. הנתונים שהתקבלו שימשו ליצירת עקומת כיול למדידות pH מדויקות. המגמה הליניארית בכיול מדגימה את יכולתו של החיישן להגיב ל-pH ללא כל הפרעה מהסביבה התאית.
כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בחיישנים מבוססי דנדרי להדמיה in vivo, בוצעה הדמיית pH במוחו של דנדרי או עכבר מורדם מוזרק. אותות פלואורסצאין ו-r דומין התקבלו בו זמנית עם עירור של 820 ננומטר, ומפת היחס נבנתה על בסיס פיקסל אחר פיקסל בדומה למדידות תאים חיים. יש לציין כי האינדיקטורים ממוקמים בחלל החוץ-תאי, האזורים הלא פלואורסצנטיים בתמונה מזהים גופים תאיים או כלי דם קטנים כדי לאמת את תגובת החיישן ל-pH.
השתמשנו בשימוש בהיפרקפנה. ואכן, ידוע כי פחמן דו חמצני משנה את שיווי המשקל של מאגרי הקרבונט בדם וברקמות וכתוצאה מכך מחמצת הרקמה. כפי שניתן לראות בתרשים זה, שאיפת 30% פחמן דו חמצני מספיקה כדי לגרום לתגובה חזקה של החיישן שהיא הפיכה לחלוטין עם אוורור סיבוב העכבר.
תוצאות אלה מדגימות את הפוטנציאל של חיישנים מבוססי עופר להדגיש שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים של pH בתאים חיים וב-vivo. ת, ההליך שלנו תואם למדידות אחרות כמו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. זה איפשר להשיג בו זמנית מידע משלים על התהליך הביולוגי המתמשך.
שיטה זו, לאחר פיתוחה, סללה את דרכו של חוקר בביולוגיה של התא ונוירוביולוגיה לחקור תהליכים מווסתים של pH בתאי תרבית וב-vivo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה לסינתזה של חיישנים פלואורסנטיים מבוססי דנדרימר שמטרתם למדוד רמות pH בתאים חיים וב-vivo. השימוש במסגרת דנדריטית משפר את המאפיינים של צבעי פלואורסצנטיים מצומדים, ומביא ליכולות חישה משופרות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- הדמיית פלואורסצנציה
- ביולוגיה תאית
- מדעי המוח
רקע
- חיישני פלואורסצנציה הם כלים חיוניים במדעי החיים.
- דנדרימרים יכולים לשפר את הביצועים של צבעי פלואורסצנטיים.
- מדידת pH היא חיונית להבנת סביבות תאיות.
- שיטות קיימות עשויות לחסר רגישות או ספציפיות.
מטרת המחקר
- לפתח חיישנים פלואורסצנטיים חדשים לדמיית pH.
- לשפר את המאפיינים של צבעים רגישים ל-pH באמצעות מסגרות דנדריטיות.
- לאפשר מדידות pH in vitro ו-in vivo בתאים חיים.
שיטות ששימשו
- צימוד של צבעים רגישים ל-pH למסגרות דנדריטיות.
- מדידות in vitro ליצירת עקומת כיול pH.
- אלקטרופורציה למסירת חיישנים לתאים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדמיית pH בחלל החוץ-תאי.
תוצאות עיקריות
- סינתזה מוצלחת של חיישנים פלואורסצנטיים מבוססי דנדרימר.
- רגישות וספציפיות משופרות במדידות pH.
- דמיית pH יעילה בתאים חיים ורקמת מוח.
- שימושיות מוכחת בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
מסקנות
- חיישנים מבוססי דנדרימר מייצגים התקדמות משמעותית בדמיית pH.
- חיישנים אלו יכולים לשמש בהקשרים ביולוגיים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים לחקור יישומים נוספים במדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Dendrimer-based pH sensors address a key challenge in discovery biology: the need for reliable, ratiometric pH measurements in complex biological systems. By improving intracellular targeting and reducing dye leakage, these sensors enhance predictive confidence in pathway interrogation and target validation studies. Their compatibility with live-cell and in vivo imaging supports translational continuity from mechanistic de-risking to preclinical biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of pH-dependent therapeutic hypotheses in live cells.
- Scientific Value: Supports functional target validation by correlating pH fluctuations with pathway activity.
- Operational Value: Reduces false positives from dye leakage and nonspecific signaling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, ratiometric readouts for high-confidence assay normalization.
- Operational Value: Improves assay reproducibility through stable intracellular retention of the sensor.
- Operational Value: Facilitates multiplexing with other fluorescent readouts due to distinct excitation/emission profiles.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links pH dysregulation to disease models in vivo, supporting biomarker relevance.
- Scientific Value: Enables longitudinal monitoring of pH changes during physiological and pathological challenges.
- Operational Value: Compatible with electrophysiological recordings for multimodal data integration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in cultured cells to target engagement validation in disease-relevant systems, particularly where pH modulates target function or drug response.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying pH’s role in signaling cascades and organelle function.
- Screening: Delivers ratiometric, concentration-independent readouts that improve hit validation confidence.
- Analytics: Provides dual-channel fluorescence ratio outputs enabling robust data normalization across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro pH responses to in vivo tissue-level changes, aiding preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Represents a modular sensor platform adaptable to other analytes via dye conjugation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in pH-sensitive pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized sensor synthesis and delivery protocols.
- Strategic Value: Supports earlier go/no-go decisions by flagging pH-related liabilities in lead candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on pH-dependent activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic conjugation, fluorescence spectroscopy, and microscopy.
- Needs access to dialysis, lyophilization, electroporation, and confocal/two-photon imaging systems.
- Demands cross-team standardization for sensor preparation, storage, and quality control.
- Must account for dendrimer size and charge effects on localization and toxicity in different cell types.
- Limited by the pKa range of the conjugated dye, requiring analyte-specific sensor design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:30
Synthesis of the Sensors
4:20
In vitro pH Measurements
5:36
Cell Culture and Electroporation
6:38
pH Sensing in Living HeLa Cells
8:47
In vivo Sample Preparation
10:30
pH Imaging in Mouse Brain
12:24
Representative Analysis of Dendrimer-based pH Sensor Fluorescence
15:45
Conclusion
