סינתזה, משלוח נייד ו בvivo יישום של חיישני pH מבוססי dendrimer
10 בספטמבר 2013
חיישני הקרינה הם כלים רבי עוצמה בתחום מדעי חיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה לסנתז ולהשתמש בחיישני ניאון מבוסס dendrimer למדוד pH בתאים חיים וin vivo. הפיגום הדנדריטים משפר את תכונותיהם של צבעי ניאון מצומדות המובילים למאפייני חישה משופרים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח חיישנים פלואורסצנטיים חדשים המבוססים על מתופפי Dun עם תכונות משופרות להדמיית pH במבחנה בתאים חיים וב-vivo. זה מושג על ידי צימוד צבעים רגישים ל-pH לפיגום דנדריטי יחד עם חלקים אחרים, כגון קבוצות מיקוד או pH בצבעים רגישים. ומדידות במבחנה נלקחות כדי ליצור עקומת כיול pH לצד pH תמונה בתאים חיים.
החיישן מועבר על ידי אלקטרופורציה ומפות pH נוצרות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיית pH בחלל החוץ-תאי של המוח. במהלך פעילות עצבית פיזיולוגית ופתולוגית, החיישן מוזרק מיקרו למוחם של עכברים מורדמים. לאחר מכן נרכשים נתוני הקרינה באמצעות שני מיקרוסקופ פוטונים.
התוצאות שהתקבלו מראות כי חיישנים מבוססי טפטוף מצליחים למדוד שינויים ב-pH ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, הן בתאים חיים והן ב-vivo. למרות שכבר נעשה שימוש בכמה צבעי ארובות עם התנהגות רגישה ל-pH, הם סובלים ממספר חסרונות, כגון ניידות לקויה ודליפת תאים. יתר על כן, הם אינם מאפשרים מדידה מוחלטת של מדד פריחה.
כאן הדגמנו את החיבור של צבעים רגישים ל-pH לפיגום גנטי D, ומכיוון שהביצועים מאפשרים מדידה מדויקת ברזולוציה המיוחדת והזמנית, שיטה זו יכולה להיות כלי שימושי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים המווסתים על ידי pH בתאים חיים. ההפרעה בוויסות ה-pH במערכת העצבים קשורה למספר מצבים כמו שבץ ואפילפסיה, וחיישן ה-pH הזמין הוכיח את עצמו כיעיל בצורה גרועה שהוביל לתכנון החיישן המוצג. למרות שמפגש זה יושם כאן הדמיית pH h, זוהי גישה כללית וניתן ליישם אותה על מינים רלוונטיים ביולוגיים אחרים.
על ידי בחירת צבע חישת הרווח, הגישה הסינתטית הקלה והרב-תכליתית הופכת את ההליכים הללו לפשוטים. מדגימים את ההליך היום יהיו ג'ובאני רה, ברברה טי, מרקו ברודי וסבסטיאן סולי כדי להצמיד מדדי pH לפיאם דמרס. התחל בהמסת הרימר ב-DMSO נטול מים בריכוז סופי של 50 מיקרומולר.
הכן 10 תמיסות מלאי מיקרוטולריות של פלואורסצאין NHS וטטראתיל RUMINE NHS, הידוע גם בשם TMR בנטול מים, DMSO בצינור מיקרו צנטריפוגה משולב, מיליליטר אחד של תמיסת G ארבעה פרם דדרר עם שמונה שווי ערך, או 40 מיקרוליטר פלואורסצאין ושמונה שווה ערך, או 40 מיקרוליטר TMR. היחס הטוחנת בתערובת ישקף את כמות הצבעים שנטענו על הדמר. מערבבים את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
לאחר מכן, יש לדלל את התערובת מ-1 עד 10 במים נטולי יונים ולהעמיס את תערובת התגובה בשקית דיאליזה עם חיתוך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון דיאליזה כנגד מים נטולי יונים ולהחליף את המים במאגר שלוש פעמים במשך 24 שעות. למחרת מעבירים את התמיסה לבקבוקון זכוכית ומקפיאים אותה במינוס 80 למספר שעות. כאשר התמיסה קפואה לחלוטין, העבירו את הבקבוקון לליופילייזר והקפיא יבש למשך 24 שעות.
יש להשיג אבקה סגולה, לקבל גלי מוצק, ולהמיס אותה במי mqe. בריכוז סופי של 10 מיקרומולר. הוצא את התמיסה ב-50 מיקרוליטר בצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר, ואחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.
לכיול במבחנה, הכינו תמיסה של 500 ננו-מולרית של מתופף D בשני PBS מילי-מולארי בווטרינר קוורץ Q. מאגר PBS מדולל מאוד משמש כדי למנוע שינויים פתאומיים ב-pH במהלך הטיטרציה. מדוד את ספקטרום הפליטה של פלואורסצאין ו-TMR ובצע אופטימיזציה של ההגדרות האופטיות של הפלואורידמטר כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.
לאחר מכן, בצע טיטרציה של pH על ידי הוספת כמויות קטנות של 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל ו-0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה. לאחר כל הוספה, יש לנער את וטרינר ה-Q כדי לערבב. המתן דקה אחת לשיווי משקל ולאחר מכן מדוד את ה-pH באמצעות pH.
יש לרשום ספקטרום פליטת מיקרו אלקטרודות של פלואורסצאין ו-TMR עבור כל שלב ללא כל שינוי. בהגדרות האופטיות, שרטט את עוצמת הקרינה לעומת ה-pH. עבור הטיטרציה, אות הדומין של המוט לא אמור להיות מושפע מ-pH.
אות הפלואורסצאין צריך להיות עקומה סיגמואידית ויש לצייד אותו במודל מחייב יחיד עם PK של 6.4 לאלקטרופורציה. העבירו שש פעמים 10 לתאי ההלה החמישיים ב-72 מיקרוליטר לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לתאים המרחפים. הוסף דנדרי או תמיסה מימית בריכוז של שתי מיקרומולר, הוסף שלושה מיליליטר, מאגר אלקטרופורציה לצינור טיהור מיקרו.
לאחר מכן, בעזרת קצה אלקטרופורציה של 10 מיקרוליטר, שאפו את תערובות התאים והרימר. לאחר מכן, הכנס את המיקרו פיפטה לתחנת הפיפטה והגדר את תנאי דופק המיקרו טיהור כאן. מתח הדופק מוגדר ל 1005 וולט.
רוחב הדופק מוגדר ל-35 אלפיות השנייה, ומספר הדופק מוגדר לשניים לאחר לוחית הדופק. 20 מיקרוליטר של התאים האלקטרופורטיים על צלחות עם תחתית זכוכית עם מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה. 12 שעות לאחר האלקטרופורציה הדמו את התאים במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות סט מסננים סטנדרטי לפלואורסצאין ו-R דומין.
התמקד בדגימה והתאם את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי כדי למקסם את יחס האות לרעש. אם האלקטרופורציה הצליחה, התאים צריכים להיות פלואורסצנטיים בהירים בשני הערוצים. הלוקליזציה תלויה בגודל ובמטען של ה- D משמשים. לעיתים קרובות.
לוקליזציה ליזוזומלית של השמש, הנראית כשלפוחיות פרי-גרעיניות קטנות קיימת עקב אנדוציטוזיס או מידור קומפליזציה. אם לוקליזציה ליזוזומלית שולטת בה רוב הקרינה ממוקמת בתוך שלפוחיות ונצפה אות נקבוביות בציטוזול. זה מסמל רעילות ויש להשליך מדידות.
רכוש את שני הערוצים ברצף, רכוש מספר תמונות וממוצע התמונות כדי לשפר את איכות התמונה. כדי ליצור עקומת כיול pH, השתמש במאגרים עם אופור ב-phs שונים כדי לגבש את ה-pH התוך-תאי והחוץ-תאי באותו ערך. רכוש לפחות 20 תמונות תאים לכל pH ומדוד לפחות חמש נקודות מ-pH 5.5 עד pH 7.5.
זה מזכיר ש-pH B 6 רעיל לתאים אך ניתן לסבול אותו לפרק זמן קצר, אז רכוש תמונות קצרות ככל האפשר. אם אתה רואה סימן לאפופטוזיס, השלך את התאים והפעל מחדש. לאחר הרכישה.
השתמש בתמונה J או בתוכנה אנלוגית לניתוח נתונים. ראשית, קבע את היחס בין ירוק לאדום. לאחר מכן שרטט את היחס מול ה-pH כדי לייצר מגמה ליניארית שתיתן עקומת כיול שניתן להשתמש בה כדי להמיר יחס ל-pH בניסויים עתידיים.
להכנת דגימה in vivo, התחל עם C 57 שחור שש J ועכברים נקבות בין היום 28 ל-70 לאחר הלידה. לאחר הרדמת העכברים עם אורטן, בצע צביטה בבוהן כדי להבטיח שהחיה מורדמת לחלוטין ומרח משחת עיניים כדי להפחית את תגובת הלחץ בקליפת המוח ואת הבצקת המוחית. במהלך הניתוח יש להזריק שני מיליגרם לק"ג משקל גוף של דקסמתזון, נתרן פוספט תוך שרירי.
לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים, גלחו את ראש החיה, ואז הניחו וילון כירורגי ומרחו ג'ל לידוקאין 2.5% על הקרקפת. השתמש במספריים כדי לחתוך את דש העור המכסה את הגולגולת של שתי ההמיספרות. שוטפים את העצם החשופה במי מלח ובעזרת מלקחיים, מסירים בעדינות את הפריאוסטאום.
זה יספק משטח הידבקות טוב יותר. עבור דבק ומלט דנטלי, יש למרוח עמוד ראש פלדה בהתאמה אישית עם תא הדמיה מרכזי ובאמצעות ציאנואקרילט, הדביקו אותו למקומו במישור המקביל בערך לגולגולת מעל אזור קליפת המוח המבוקש. תקן את העמוד למקומו בעזרת מלט שיניים לבן.
תקן את ראש העכבר ובצע קרניוטומיה בקוטר שניים עד שלושה מילימטרים על ידי קידוח מעל אזור העניין. לעתים קרובות לאורך הליך הקידוח משתמש במזרק כדי למרוח CSF סטרילי טרי על הגולגולת כדי למזער את חימום קליפת המוח במהלך הניתוח. לאחר הגולגולת, העבירו את החיה לשלב ההדמיה כדי לשמור על הראש עדיין מתחת למטרה.
הברג את תא ההדמיה לעמוד המתכוונן. החל לוע פלסטיק בהתאמה אישית המחובר לחמצן. זה יספק אוויר מועשר בחמצן במהלך הניסוי כדי לסייע לנשימה של בעלי חיים.
כדי להזריק את החיישן לקליפת המוח, טען פיפטת זכוכית בקוטר קצה של ארבעה מילימטרים ואלקטרודת כלוריד כסף. עם פתרון ה-ER של ה-ER המיקרו-מולרי האחד, האלקטרודה תקל על רישום פוטנציאל השדה החוץ-תאי עם הגדרת מיקרו-הזרקה. הכנס את הפיפטה לקליפת המוח בעומק של כ -150 מיקרון.
הזרקו למשך דקה עד שתיים בלחץ של 0.5 פאונד לאינץ' רבוע כדי לייעל את ההגדרה האופטית להדמיה. כוונן את עוצמת הלייזר כדי למזער הלבנת תמונות ונזק לצילום. בדרך כלל, הספק הלייזר המופעל הוא בסביבות 20 מילי-וואט, ורווח ה-PMT נשמר קבוע על 667 וולט.
הגדר את אורך גל הלייזר כדי לעורר את החיישן ב-820 ננומטר וכוון את התוכנה לזהות פלואורסצין ומוט דומין פלואורסצנטי בו זמנית באמצעות מסנני FTSE ו-trit סטנדרטיים. הגדר גם את תדר הרכישה לקצב פריימים של שני הרץ לתיקון רקע. רכוש מסגרת כהה עם תריס הלייזר סגור כדי למדוד את הרעש התרמי הממוצע הנוצר ב-PMT ובכן.
לבסוף, רכוש תמונות פלואורסצנטיות תלויות pH ואחסן אותן לניתוח לאחר מכן. נתח את הנתונים כמו קודם כדי להעריך את ההתנהגות במבחנה של פלואורסצאין ורומין. הועמס על הרימר, טיטרציה של pH בוצעה באמצעות פלואורמטר.
איור זה מציג טיטרציה אופיינית של חיישן pH. ניתן לעורר פלואורסצאין ורמין בנפרד ב-488 ננומטר ו-550 ננומטר בהתאמה, מה שמאפשר מינימום דיבור צולב בין שני הערוצים כפי שניתן לראות בבירור. פלואורסצאין מראה התנהגות תלוית pH בעוד שאות R דומין אינו משתנה באופן משמעותי בטווח ה-pH הפיזיולוגי.
לכן, היחס בין שני האותות הללו אינו תלוי בריכוז החיישן, אלא רק ב-pH. לאחר מכן, כדי לספק את המחוון, תאי הלה תוך-תאיים עברו אלקטרופוציה עם חיישני הדדרר ובוצעה הדמיה קונפוקלית כמתואר בסרטון זה. תמונות קונפוקליות אלה מציגות את התאים בתעלת הפלואורסצאין משמאל, את תעלת הדומין R באמצע, ומוצגות כמפה מטרית של יחס pH מימין.
נצפים אותות פלואורסצאין ו-r דומין חזקים, אשר מתמקמים יחד ומדגימים את שלמות מבנה החיישן. מפת יחס מטרית משוחזרת על ידי חלוקת שתי התמונות פיקסל אחר פיקסל ומיוצגת בסולם צבעים מדומה. כדי לכייל את תגובת החיישן בתוך התאים, בוצעה הידוק pH עם יונופורים כפי שמוצג כאן.
אינדיקטורים מגיבים בקלות ל-pH עם שינוי היחס בין ירוק לאדום. הנתונים שהתקבלו שימשו ליצירת עקומת כיול למדידות pH מדויקות. המגמה הליניארית בכיול מדגימה את יכולתו של החיישן להגיב ל-pH ללא כל הפרעה מהסביבה התאית.
כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בחיישנים מבוססי דנדרי להדמיה in vivo, בוצעה הדמיית pH במוחו של דנדרי או עכבר מורדם מוזרק. אותות פלואורסצאין ו-r דומין התקבלו בו זמנית עם עירור של 820 ננומטר, ומפת היחס נבנתה על בסיס פיקסל אחר פיקסל בדומה למדידות תאים חיים. יש לציין כי האינדיקטורים ממוקמים בחלל החוץ-תאי, האזורים הלא פלואורסצנטיים בתמונה מזהים גופים תאיים או כלי דם קטנים כדי לאמת את תגובת החיישן ל-pH.
השתמשנו בשימוש בהיפרקפנה. ואכן, ידוע כי פחמן דו חמצני משנה את שיווי המשקל של מאגרי הקרבונט בדם וברקמות וכתוצאה מכך מחמצת הרקמה. כפי שניתן לראות בתרשים זה, שאיפת 30% פחמן דו חמצני מספיקה כדי לגרום לתגובה חזקה של החיישן שהיא הפיכה לחלוטין עם אוורור סיבוב העכבר.
תוצאות אלה מדגימות את הפוטנציאל של חיישנים מבוססי עופר להדגיש שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים של pH בתאים חיים וב-vivo. ת, ההליך שלנו תואם למדידות אחרות כמו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. זה איפשר להשיג בו זמנית מידע משלים על התהליך הביולוגי המתמשך.
שיטה זו, לאחר פיתוחה, סללה את דרכו של חוקר בביולוגיה של התא ונוירוביולוגיה לחקור תהליכים מווסתים של pH בתאי תרבית וב-vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה לסינתזה של חיישנים פלואורסצנטיים מבוססי דנדרימר, המיועדים למדידת רמות pH בתאים חיים וב-in vivo. השימוש בשלד דנדריטי משפר את תכונותיהם של צבעים פלואורסצנטיים מצומדים, מה שמוביל ליכולות חישוש משופרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- דימות פלואורסצנציה
- ביולוגיה תאית
- מדעי המוח
רקע
- חיישני פלואורסצנציה הם כלים חיוניים במדעי החיים.
- דנדרימרים יכולים לשפר את ביצועיהם של צבעים פלואורסצנטיים.
- מדידת pH היא קריטית להבנת סביבות תאיות.
- שיטות קיימות עשויות להיות חסרות רגישות או ספציפיות.
מטרת המחקר
- פיתוח חיישנים פלואורסצנטיים חדשים לדימות pH.
- שיפור התכונות של צבעים רגישים ל-pH באמצעות פיגומים דנדריטיים.
- מתן אפשרות למדידות pH in vitro ו-in vivo בתאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שזירה של צבעים רגישים ל-pH למסבים דנדריטיים.
- מדידות in vitro ליצירת עקומת כיול pH.
- אלקטרופורציה להחדרת החיישנים לתאים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדימוי pH בחלל החוץ-תאי.
תוצאים עיקריים
- סינתזה מוצלחת של חיישנים פלואורסצנטיים מבוססי דנדרימר.
- רגישות וסגוליות משופרות במדידות pH.
- דימוי יעיל של pH בתאים חיים וברקמת מוח.
- הוכחת יעילות במהלך תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
מסקנות
- חיישנים המבוססים על דנדרימרים מהווים התקדמות משמעותית בדימות pH.
- ניתן ליישם חיישנים אלו בהקשרים ביולוגיים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים נוספים במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חיישני pH מבוססי דנדרימר פותרים אתגר מרכזי בביולוגיה של הגילוי: הצורך במדידות pH רציומטריות ואמינות במערכות ביולוגיות מורכבות. באמצעות שיפור הפנייה התוך-תאית והפחתת דליפת צבע, חיישנים אלו מגבירים את הביטחון החזוי בחקירת מסלולים ובמחקרי תיקוף מטרות. התאימות שלהם לדימוי תאי חיים ודימוי in vivo תומכת ברצף תרגומי, החל מהסרת סיכונים מכניסטיים ועד להתאמה של סמנים ביולוגיים בשלב הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות התלויות ב-pH בתאים חיים.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הצלבה של תנודות ב-pH עם פעילות מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מפחית תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מדליפה של צבע ומאיתות לא ספציפית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות ורציומטריות לצורך נורמליזציה של בדיקות ברמת ביטחון גבוהה.
- ערך תפעולי: משפר את שחזוריות הבדיקה באמצעות שימור תוך-תאי יציב של החיישן.
- ערך תפעולי: מקל על ביצוע מולטיפלקס עם קריאות פלואורסצנטיות אחרות הודות לפרופילי עירור/פליטה מובחנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הפרעות בבקרת ה-pH לבין מודלים של מחלות in vivo, ובכך תומך ברלוונטיות של סממנים ביולוגיים.
- ערך מדעי: מאפשר ניטור אורכי של שינויי pH במהלך אתגרים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
- ערך תפעולי: תואם להקלטות אלקטרופיזיולוגיות לצורך אינטגרציה של נתונים מולטי-מודאליים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות בתאים בתרבית ועד לתיקוף מעורבות המטרה במערכות הרלוונטיות למחלה, במיוחד במקרים בהם pH מווסת את תפקוד המטרה או את התגובה לתרופה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת תפקידו של ה-pH ברשראות איתות ובתפקוד אברונים.
- סריקה: מספקת קריאות רציומטריות, שאינן תלויות בריכוז, המשפרות את רמת הביטחון באימות הפגיעות (hits).
- אנליטיקה: מספקת פלטי יחס פלואורסצנציה בערוץ כפול, המאפשרים נורמליזציה חסונה של נתונים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תגובות pH in vitro לשינויים ברמת הרקמה in vivo, ובכך מסייעת להמשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמת חיישנים מודולרית הניתנת להתאמה לאנליטים אחרים באמצעות צימוד צבעים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים הרגישים ל-pH.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של סינתזה ואספקה של חיישנים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מוקדמת יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי זיהוי סיכונים הקשורים ל-pH במועמדים מובילים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעוד של תרכובות המותאם לסיכון, בהתבסס על פרופילי פעילות התלויים ב-pH.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בצימוד אורגני, ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה ומיקרוסקופיה.
- נדרשת גישה למערכות דיאליזה, ליופיליזציה, אלקטרופורציה ודימות קונפוקאלי/דו-פוטוני.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת החיישנים, אחסונם ובקרת איכות.
- יש להתחשב בהשפעות גודל ומטען הדנדרימר על הלוקליזציה והרעילות בסוגים שונים של תאים.
- מוגבל על ידי טווח ה-pKa של הצבע המצומד, דבר הדורש תכנון חיישן ספציפי לאנליט.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:30
Synthesis of the Sensors
4:20
In vitro pH Measurements
5:36
Cell Culture and Electroporation
6:38
pH Sensing in Living HeLa Cells
8:47
In vivo Sample Preparation
10:30
pH Imaging in Mouse Brain
12:24
Representative Analysis of Dendrimer-based pH Sensor Fluorescence
15:45
Conclusion
