מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה בvivo
July 9th, 2013
הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה ב In vivo הקשר. מכתים Immunofluorescent לדמיין במדויק מקלעת כלי הדם הוא מכריע להצלחה של סוגים של מחקרים אלה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור אנגיוגנזה ברשתית העכבר היילוד. זה מושג תחילה על ידי גרעין עיניים לאחר הלידה, ולאחר מכן יישום קיבוע של השלב השלישי הוא לנתח בזהירות את הרשתית לאחר הלידה לצורת עלי כותרת, והשלב האחרון הוא צביעת כלי הדם ברשתית. בסופו של דבר, הדמיה של כלי הדם ברשתית העכבר מושגת באמצעות צביעה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
ידגימו את ההליך הזה ד"ר סיימון טלו, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, וקתלין אלינסון, חברה לשעבר במעבדה שלי. לאורך הליך זה, טמפרטורת ברירת המחדל היא טמפרטורת החדר. התחל בהנחת גור עכבר שנהרג באופן אנושי על צדו עם מספריים.
הסר את העור המכסה את העין. לאחר מכן, כשהמספריים ממוקמים מתחת לעין, חתכו את עצב הראייה והרקמות שמסביב והרימו את העין. העבירו את העין הגרעינית לצלחת 24 בארות המכילה קיבוע, שהוא 4% PFA בפעמיים.
PBS ממשיכים בניתוח העין הבאה בזמן שאחד מהם נמצא בקיבעון. התנודה בין שתי נתיחות העיניים תהיה חצי דקה. עם תרגול.
יש לאפשר לכל עין לתקן במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן העבירו אותם לקור פעמיים PBS על קרח למשך חמש עד 10 דקות לפחות. לפני בידוד הרשתית, אספו כמה עיניים לתוך ה-PBS כרצונכם, באמצעות פיפטת מרעה מפלסטיק שנחתכה כדי להרחיב את החזיר.
העבירו את העיניים לצלחת פטרי המכילה פי 2 PBS תחת מיקרוסקופ מנתח. הסר כל שומן סביב העין באמצעות מלקחיים ומספריים. חודרים את קצה הקרנית במספריים חדים וחותכים סביב הקרנית והקשתית, זורקים את הרקמות הללו.
לאחר מכן, הכנס את המלקחיים בין הרשתית לסקלרה. הסר את הסקלרה תוך הקפדה לא לקרוע את הרשתית. ניתן להסיר את שכבת הכורואיד גם כל עוד אין סיכון לפגיעה ברשתית.
השארת שכבת הכורואיד דולקת לא אמורה להשפיע באופן משמעותי על איכות הצביעה החיסונית. כעת באמצעות מלקחיים, הסר את העדשה ואת ההומור הזגוגי. לאחר מכן יש להסיר את כלי האלואיד.
השתמש במלקחיים עדינים כדי לאסוף אותם יחד במרכז העין. לאחר מכן משוך אותם במהירות ממרכז הרשתית. הקפד במיוחד להסיר את כל הגדילן הצהוב מכיוון שאם תשאיר כמה מאחור, הם עלולים לטשטש את תוצאות העמידה שלך.
כעת יש להעביר את הרשתית בצורת לצלחת פטרי נקייה ולשטוף אותה עם PBS. עכשיו לתוך הרשתית. בצע ארבעה עד חמישה חתכים רדיאליים המגיעים לכשני שליש מהדרך לכיוון המרכז.
השתמש במספריים קפיציים כדי ליצור רשתית בצורת דוושה. שלב זה דורש סבלנות ותרגול כדי לשלם. כעת משוך את רוב ה-PBS באמצעות פיפטת מרעה.
זה ישטיח את הרשתית. לאחר מכן הסר את כל עודפי PBS בעזרת פיסת נייר סופגת קטנה. לאחר מכן, מרחו מינוס 20 מעלות מתנול טיפה אחר טיפה על פני הרשתית עד שהיא שקועה ברובה, ולאחר מכן הוסיפו מתנול בנדיבות.
הרשתית תהפוך ללבנה. שלב זה עוזר לתקן את הרשתית ויקל על החלחול. העבירו את הרשתית במתנול הקר לצינור קטן.
בעזרת פיפטה מפלסטיק רחבה. אפשר להם לדגור במתנול הקר לפחות 20 דקות במידת הצורך, הרשתית יכולה להישאר במתנול במינוס 20 מעלות למשך מספר חודשים. הנוגדנים משתמשים רק כאן.
לא ניתן להשתמש בהצלחה בסינוס על הרשתית הקבועה האימהית. במקרה זה, הרשתית צריכה להמשיך ישר לצביעה חיסונית לאחר ששטחה אותם לצורת עלי כותרת. התחל בסילוק זהיר של המתנול מהרשתית.
לאחר מכן יש לשטוף את הרשתית במהירות ובעדינות בפעם אחת PBS. הסר את ה-PBS וכסה את הרשתית ב-100 מיקרוליטר של תמיסת בלוק סלסול עם 5% מהסרום המתאים. הניחו את הרשתית לנער בעדינות במשך שעה לאחר מכן.
הסר את תמיסת בלוק הסלסול עם פיפטה והחלף אותה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת בלוק סלסול המכילה את הנוגדן העיקרי או נבחר לפני. לאחר מכן הגדר את הרשתית לדגור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד למחרת בבוקר. שטפו את הרשתית ארבע פעמים ב-PBS TX למשך 10 דקות בכל כביסה.
יש למרוח נדנוד עדין במהלך כל שלבי הכביסה. אם הנוגדן הראשוני אינו מצומד, הוסף 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים, מדולל אחד עד 200 ב-PBS tx. דגרו את הרשתית למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה כדי להסיר את הנוגדן המשני.
שטפו את הרשתית ארבע פעמים ב-PBS TX עם נדנוד עדין במשך 15 דקות בכל שטיפה. כעת המשך בהרכבה. העבירו את הרשתית למגלשות באמצעות פיפטה מפלסטיק עם קדח רחב והסירו את כל ה-P-B-S-T-X עם טישו.
לאחר מכן הרכיבו את הרשתית ב-50 מיקרוליטר זהב ממושך וכסו בעדינות את התמיסה עם פתק כיסוי. כדי לאפשר את סט הזהב הממושך יש לקרר את המגלשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, מוגנות מאור למחרת. המשך בהדמיית הרשתית לאחר הדיסקציה.
הרשתית צריכה להיראות כמו פרח שטוח באמצעות ISO selectin B four Alexa 4 88. תאי האנדותל היו מוכתמים ונראים בצבע ירוק. תאי שריר כלי דם תומכים הודגמו באמצעות שריר חלק אנטיפה, פעלו בתצוגת הכוח הנמוך באמצעות מטרה פי חמישה, אפשרו סקירה כללית של ארגון כלי הדם של הרשתית על ידי שימוש בשילוב שונה של נוגדנים.
ניתן לראות תאי אנדותל באמצעות צביעה חיסונית נגד CD 31, התומכים בטפילים כאשר הם נראים באמצעות נוגדן נגד NG 2. לחלופין, הטפילים התומכים הוכתמו באנטי דסמין. צביעת אנטי דסמין מדמיינת את התהליכים דמויי האצבע של הטפילים ועוזרת לקבוע אם הם קשורים קשר הדוק לתאי האנדותל.
לעומת זאת, צביעה נגד NG 2 מתארת את הגרעינים של כל טפיל, מה ששימושי בעת כימות מספר תאי הטפיל בכלי הדם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מלגעת ולפגוע במשטח הרשתית עם כלי החיתוך שלך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעת BD על מנת לחקור התפשטות של תאים ספציפיים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
נוהל זה חוקר אנגיוגנזה ברשתית של עכבר ניאו-נטלי, מודל מאופיין היטב לחקר התפתחות כלי דם. הוא כולל ניתוק מוקפד וצביעה של כלי הדם ברשתית כדי לדמיין אנגיוגנזה in vivo.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אנגיוגנזה
- התפתחות רשתית
רקע
- רשתית העכבר הניאו-נטלית היא מודל מבוסס למחקרי אנגיוגנזה.
- הבנת תפקידי גנים ותרופות באנגיוגנזה חיונית לפיתוח טיפולים.
- צביעה אימונופלואורוסצנטית היא חיונית לדמיית רשת כלי הדם.
- מודל זה מאפשר חקירות in vivo של מודולציה כלי דם.
מטרת המחקר
- לחקור את המנגנונים של אנגיוגנזה ברשתית של עכבר ניאו-נטלי.
- לדמיין את כלי הדם ברשתית באמצעות טכניקות צביעה פלואורוסצנטית.
- להדגים את הנוהל ליישומים עתידיים של מחקר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הסרת עיניים לאחר לידה מעכברים צעירים.
- מריחת חומר משמר כדי לשמר את מבנה הרקמה.
- ניתוק הרשתית לצורת פריחה לצביעה אופטימלית.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לדמיית כלי הדם הצבועים.
תוצאות עיקריות
- דמייה מוצלחת של רשת כלי הדם ברשתית.
- הדגמה של התהליך האנגיוגנטי בסביבה מבוקרת.
- תובנות לגבי מודולציה של אנגיוגנזה על ידי גורמים שונים.
- הקמה של שיטה אמינה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הרשתית של עכבר ניאו-נטלי משמשת כמודל יעיל למחקר אנגיוגנזה.
- צביעה פלואורוסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית הם חיוניים לדמיית מבני כלי הדם.
- נוהל זה יכול לסייע בהבנת ההשפעות הגנטיות והפרמקולוגיות על אנגיוגנזה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
