Name: מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה בvivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: חקור מנגנוני אנגיוגנזה ברשתית עכבר ילודים באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל וצביעת Immunofluorescent. שיטה זו מאפשרת חקירת התפתחות כלי הדם והשפעת גורמים גנטיים ותרופתיים על תהליכי אנגיוגנזה בגוף החי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome וקרן הלב הבריטית.

כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוינו אחרת. 1. Enucleation וקיבוע של עיניים אחרי לידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר הרג גור אנושי בצד שלה, להסיר את העור מכסה את העין עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים ומלקחיים לenucleate העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים מקום מתחת לעין enucleated, חתכו את עצב הראייה ורקמות הסובבות ולהרים את העין. מעבירים לצלחת 24 גם מכילה paraformaldehyde 4% (PFA) מורכבים ב2x PBS בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לכל עין כדי לתקן עבור 10 - 15 דקות, ולאחר מכן להעביר לקור 2x PBS על קרח במשך 5 - 10 דקות. עדיף להתנודד enucleations וקיבעון שלאחר מכן על מנת להבטיח את מידת הקיבעון היא שווה לכל עין. </li></ol> 2. Dissection של רשתיות Murine אחרי לידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיניים להעביר לתוך צלחת פטרי המכילה 2x PBS באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק שנחתך להרחיב את השעם והמקום תחת dissecting מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל שומן סביב העין באמצעות מלקחיים ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס הקצה של הקרנית במספריים חדים ולחתוך סביב הקרנית וקשתית העין וזורקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלקחיים בין רשתית ולובן עין ולהסיר את לובן העין נזהרת שלא לקרוע את הרשתית. ניתן גם להסיר את השכבה דמית העין, אבל אם יש סיכון לנזק לרשתית המתרחשת במהלך שלב זה, ניתן להשאיר את השכבה דמה כבזה לא אמור להשפיע על איכות immunostaining באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העדשה ואת הומור הזגוגית באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כלי hyaloids על ידי איסוף אותם יחד במרכז עין עם מלקחיים עדינים ואז למשוך משם במהירות ממרכז הרשתית (לחלופין חיתוך בבסיס של כלי hyaloid עם מספריים עדינים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרשתית בצורת הגביע עם PBS בצלחת פטרי נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 4 עד 5 חתכים רדיאליים המגיעים לכ 2/3 מהרדיוס של הרשתית באמצעות קפיץ scissoRS כדי ליצור צורה &quot;כותרת&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את PBS באמצעות פיפטה פסטר כדי לשטח את הרשתית, ולאחר מכן להסיר כל PBS עודף עם חתיכה קטנה של נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט טפטפת קר (-20 מעלות צלזיוס) טיפה אחר טיפת מתנול על פני השטח של רשתית עד מכוסה לחלוטין ולאחר מכן מבול עם מתנול נוסף. זה יעזור לתקן את הרשתיות ויאפשר permeabilization. את הרשתיות יהפכו לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר צינור 2 מ&quot;ל בעזרת פיפטה פסטר פלסטיק שנחתכה להרחיב את הקידוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר רשתית במתנול הקר במשך לפחות 20 דקות לפני שתמשיך עם immunostaining. מהנוגדנים המשמשים כאן, לא ניתן להשתמש רק VE-cadherin בהצלחה על רשתית קבועה מתנול. במקרה זה רשתיות צריכים להמשיך ישר לimmunostaining לאחר שלב 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, ניתן לאחסן ברשתיות מתנול ב -20 ° C עד כמה חודשים לפני מכתים. </li></ol> 3. חיסוני / מכתים isolectin של Vascu הרשתיתlature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות / לשפוך את מתנול ולשטוף בעדינות רשתיות בקצרה ב PBS (בשלב זה היא עדיין הרשתית באותו צינור 2 מ&quot;ל מצעד 11 לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ורשתיות כיסוי עם 100 μl של הפתרון פרם / בלוק (PBS + 0.3% + טריטון 0.2% BSA) + 5% מהסרום המתאים (ראה טבלת מס &#39;1) וללחוץ בעדינות במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Perm / חסום ודגירת רשתיות עם עדין רועד הלילה בשעה 4 ° C עם 100 μl של נוגדנים עיקריים שנבחרו (ראה טבלת מס &#39;1) ו / או IsolectinB4, כל שהוכן על ידי דילול בפרם / חסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן / isolectin ולשטוף רשתיות 4 X 10 דקות בPBS + 0.3% טריטון (PBSTX). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים, למשל עם הכתמים הבאים IsolectinB4-Alexa488 או נוגדן ראשוני ישירות מצומדת, נוגדנים משני אינם נדרשים ויכולות להיות מותקנים באופן ישיר רשתיות (שלב 7). כאשר נוגדן ראשוני unconjugated נעשה שימוש בשלב 3, ולאחר מכן 100 μl של פלואוריד המתאיםנוגדנים משני escent (בדילול 1/200 בPBSTX) הוא הוסיף ועזבו לדגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים משני ולשטוף דקות רשתיות 4 X 15 ב2 מ&quot;ל PBSTX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשתיות על גבי שקופיות באמצעות רחבה משעממת פלסטיק פיפטה פסטר ולהסיר PBSTX העודף עם רקמה סופגת. רשתיות הר על ידי הוספת 50 μl של להאריך mountant על coverslip ועדינות עמדה על הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות למקרר למשך הלילה ב 4 ° C, על מנת להבטיח שהם שטוחים ומוגנים מפני אור, כדי לאפשר להאריך mountant להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתית תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ epifluorescence. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li>
<li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336(2012).</li>
<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li>
<li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li>
<li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה שהוצגה כאן מציעה דרך פשוטה ויעילה כדי להשיג תמונות של כל הכנות הר מוכתמות של רשתית עכבר ילוד, מה שהופך אותו מודל בקלות לכימות ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית של אנגיוגנזה. בתחילה, עין העכבר יכולה להיות די קשה לנתח בשל גודלו הקטן וצורת גלובוס, ולכן חלק באימון וכלים טובים לנתיחה דרושים לתוצאות אמינות. Dissection של עיניים שהוכנו בריכוז 2x של PBS הוא חשוב כי זה גורם לכמות קטנה של אובדן מים מהעין ומפחית את לחץ התוך מסלולית, המאפשר לנתיחה. הכנה טובה של הרשתית היא חשובה מכמה סיבות. ראש...

אנגיוגנזה היא תהליך התפתחותי מורכב שהוגדר על ידי היווצרות של כלי דם חדשים מרשת כלי קיים והוא מוסדר על ידי מספר מסלולי איתות. הבולט ביותר של אלה הוא מסלול VEGF. VEGF הוא שוחרר על ידי תאי איסכמי ומוביל לייזום של angiogenic הנבטה בכלי דם סמוכים. התא האנדותל בכלי הדם המוביל מחיטה חדש הוא התא &#39;קצה&#39;, אשר מייצר filopodia שלהושיט יד לעבר המקור של VEGF, ואחריו מתרבה תאי האנדותל &quot;גבעול&quot;. בדרך זו, תאי האנדותל המופעלים להגר ומתרבים לכיוון אזור בו הם יוצרים avascular צינורות כלי דם חדשים. על מנת לייצב את הצינורות אלה כדי לתמוך בזרימת דם, תאי האנדותל אינטראקציה עם pericytes ותאי שריר חלק, המקיפים את כלי הדם החדשים 1. אנגיוגנזה היא חיונית לכלי דם של העובר ורקמות גדלות. עם זאת, היא גם תורמת לרבים pathologiהפרעות cal כגון סרטן, ואילו פגמים באנגיוגנזה קשורים למחלות איסכמי. הפיתוח של טיפולים תרופתיים יעילים לויסות אנגיוגנזה כאמצעי לטיפול במחלה הוא אפוא עניין רב. לדוגמה, גורמים אנטי angiogenic יעילים יפחיתו צמיחת סרטן, בעוד אסטרטגיות פרו angiogenic יכולות לשמש לטיפול במחל איסכמית. לפיכך, מודלים של אנגיוגנזה הם חיוניים כדי להבין טוב יותר את הרגולציה של היווצרות כלי חדשה ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי לשפר או להקטין צמיחת כלי דם. אלמנט בסיסי של מחקר אנגיוגנזה הוא הבחירה של דגם כלי דם מתאים. רבים במודלים חוץ גופית כבר נועדו לשחזר את הצעדים הבסיסיים של אנגיוגנזה כגון תא האנדותל הגירה, שגשוג והישרדות 2,3. שימוש תכוף בassay חוץ גופית היא היווצרותה של רשת מסועפת של תאי האנדותל במטריצת Matrigel, אם כי לאשלו אינו ספציפי לתאי אנדותל, ואינו בדרך כלל לשלב תמיכה של pericytes או תאי שריר חלק. הערכה של אנגיוגנזה הנבטה vivo לשעבר באמצעות תרבות איבר עכבר כגון assay embryoid הגוף, assay טבעת אב העורקים ואת assay כף הרגל העוברי מאפשרת הניתוח של אנגיוגנזה של תאי האנדותל בהקשר של תאי תומכים נוספים. עם זאת, המגבלות העיקריות של מבחני אלה כוללים את חוסר זרימת דם ורגרסיה של כלי לאורך זמן, נותנים חלון מוגבל לניתוח. לכן, כדי להבין את הרגולציה של אנגיוגנזה בצורה מדויקת יותר, במודלי vivo נדרשים כגון אלו שפותחו בעכבר באמצעות ספוגים מושתלים מתחת לעור או תקעי Matrigel, כמו גם את מודל איסכמיה האיבר האחורי. עם זאת, המודלים האלה הם מאתגרים לנתח בשל ארכיטקטורת 3D המורכבת של neovessels. לעומת זאת, בעובר דג הזברה הוכיח מודל מצוין לאנגיוגנזה חזותית בכלהאורגניזם 4. עם זאת, את העכבר הוא קשור אבולוציונית הרבה יותר הדוק לאדם מאשר דג הזברה, מה שהופך את עכבר מודל מועדף במקרים רבים. כתוצאה מכך אנגיוגנזה של רשתית העכבר לאחר הלידה מייצגת שיטה מאופיינת היטב של בחירה עבור מחקר אנגיוגנזה. זה לא רק מספק הגדרה פיזיולוגית, אלא גם כלי דם מקלעת 2D, שניתן בקלות דמיין באמצעות כתמי ניאון מתאימים. הארכיטקטורה של רשת הכלי, התפשטות האנדותל, הנבטה, גיוס תא perivascular ושיפוץ כלי כל יכולה להיחקר באמצעות טכניקה זו. ברשתית עכבר הילוד, פיתוח של כלי דם ברשתית מתרחש בשבוע הראשון של חיים לאחר לידה. עכברים, שלא כמו בני אדם, נולדים עיוורים ואת הרשתיות הפכו vascularized רק לאחר לידה. להתעורר כלי רשתית ממרכז הרשתית הקרוב לעצב הראייה ביום הלידה 0 (P0), ולפתח על ידי אנגיוגנזה כדי ליצור מאוד לארגןד כלי דם המגיעה למקלעת הפריפריה הרשתית בכ P8 5. כלי דם לפתח בצורה אופיינית עם מקלעת הנימים גדלה בהדרגה החוצה מהדיסק האופטי לכיוון הפריפריה כדי ליצור דפוס קבוע לסירוגין של עורקים וורידים עם רשת נימים להתערב. כלי הדם ברשתית מספק מודל אידיאלי ללמוד אנגיוגנזה כפי שניתן לזהות בקלות את כלי כפי שהם גדלים במה הוא בעצם מטוס 2D, ובכך הופכים אותו קל יחסית לבחון את כלי הדם ברשתית בהר שטוח הכנות 5. שיטה לבידוד רשתית ילוד העכבר לניתוח של תגובות תא אנדותל טיפ על כמה שעות vivo לשעבר כבר דווח 6. לחלופין, בחקירה מפורטת יותר של כלי הדם ברשתית השלם וכלי דם סמנים הקשורים דורשת immunostaining של דגימות רשתית קבועות בשלבים שונים של פיתוח. כאן אנו מספקיםתיאור מפורט של שיטה אמינה וטכנית ישר קדימה, כי אנו משתמשים עבור כל צביעת הר כלי הדם ברשתית העכברית מקלעת, מenucleation הראשוני של העין לאחר הלידה (ראה גם 7) באמצעות פרוטוקולי הצביעה להדמיה סופית מתחת למיקרוסקופ.

<table><tr><tbody><td colspan="4" ><חזק>חומר</חזק</td></tr><tr><td>>פיפטות פלסטיק 3 מ"ל</td><td>ציוד מעבדה מדעי</td><td>PIP4210</td><td>הסר את הקצה עם מספריים ליצירת צלחות BD Falcon 24 בארות עם קדח רחב</td></tr><tr><td></td><td>353226</td><td></td><td>צלחות מעבדה מדעיות</td></tr><tr><td>נבחרות טלוויזיה 90 מ"מ</td><td>ציוד מעבדה מדעית</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות היסטובונד</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים 22 x 22 מ"מ</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה דומונט #5</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים באורך 10.5 ס"מ, עם להבים ישרים 8 מ"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501235</td><td>משמש להסרת גרעין</td></tr><tr><td>מספריים Vannas באורך 8.5 ס"מ, עם להבים ישרים של 7 מ"מ, וקצות עדינות של 0.025 x 0.015 מ"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500086</td><td>משמש לניתוח רשתית</td></tr><tr><td>מספריים ואנה סופר עדינים באורך 8 ס"מ עם להבים ישרים 3 מ"מ, וקצות סופר עדינות 0.015 x 0.015 מ"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501778</td><td>משמש לניתוח רשתית</td></tr><tr><td>צלולה קריסטל &#8217; צינורות 2 מ"ל</td><td>Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>נתרן פוספט dibasic</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>מגיב PBS</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>PBS נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S9625</td><td>מגיב PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>להרכיב ב-2x PBS ולאחסן ב -20 & #176; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>סרום עזים</td><td></td><td>וקטור S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold מגיב נגד דהייה</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>מגיב הרכבה</td></tr><tr><td>איזולקטין GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>שימוש ב דילול 1:200</td></tr><tr><td>איזולקטין GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>שימוש ב-1:200 דילול</td></tr><tr><td colspan="4" ><נוגדנים חזקים>ראשוניים</חזקים></td></tr><tr><td>אנטי-NG2 (רב-שבטי ארנב)</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>מזהה פריציטים</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (שיבוט GA5, חד-שבטי של עכבר)</td><td>Millipore</td><td>MAB360</td><td>מזהה אסטרוציטים</td></tr><tr><td>אנטי-דסמין (שיבוט Y66, ארנב חד שבטי)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>מזהה פריציטים</td></tr><tr><td>אנטי-קולגן IV (רב-שבטי ארנב)Chemicon</td><td></td> <td>AB756P</td><td>מזהה קרום בסיס כלי דם</td></tr><tr><td>אנטי-אלפא שריר חלק אקטין-Cy3 (שיבוט 1A4, חד-שבטי עכבר)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>מזהה תאי שריר חלק בכלי הדם.</td></tr><tr><td>אנטי-אנדוגלין (שיבוט MJ7/18, חד-שבטי של חולדות)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>מזהה תאי אנדותל</td></tr><tr><td>אנטי-CD31 (שיבוט MEC13.3, חד-שבטי של חולדות)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>מזהה תאי אנדותל</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin (שיבוט 11D4.1, חד-שבטי של חולדות)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>מזהה צמתים של תאי אנדותל</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (רב-שבטי עז)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>מזהה תאי</td></tr><tr> אנדותל<td colspan="4"><נוגדנים חזקים>משניים</חזקים></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>כל הנוגדנים המשניים נקלטים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 &#176;C.</td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>כל הנוגדנים המשניים נקבעים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 &#176;C.</td></tr><tr><td>עז נגד חולדות-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>כל הנוגדנים המשניים נקבעים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 &#176;C.</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>כל הנוגדנים המשניים מצוטטים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 &#176;C.</td></tr><tr><td>חמור נגד עזים-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>כל הנוגדנים המשניים נקלטים מיד עם הגעתם ומאוחסנים ב-20 &#176;C.</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>מיקרוסקופים</חזקים></td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>מצלמה למיקרוסקופ</td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager עם מצלמת אפוטום</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מצלמת Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td><td>עבור אקסיואימג'ר</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>ניקון</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

מכתים immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

אנגיוגנזה היא התהליך המורכב של היווצרות כלי דם חדשה שהוגדרה על ידי ההנבטה של ​​כלי דם חדשים מכלי רשת קיימת מראש. אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מרכזי לא רק בהתפתחות נורמלית של איברים ורקמות, אלא גם במחלות רבות שבן היווצרות כלי דם היא dysregulated, כגון סרטן, עיוורון ומחלות איסכמי. בחייו בוגרים, כלי דם הם בדרך כלל שקטים כל כך אנגיוגנזה היא היעד חשוב לפיתוח תרופה חדשני כדי לנסות ולווסת את היווצרות כלי חדשה במיוחד במחלה. כדי להבין טוב יותר את אנגיוגנזה ולפתח אסטרטגיות מתאימות כדי להסדיר את זה, מודלים נדרשים שמשקפים במדויק את הפעולות הביולוגיות השונות כי הם מעורבים. רשתית ילוד העכבר מספקת מודל מצוין של אנגיוגנזה כי עורקים, ורידים ונימים לפתח כדי ליצור מקלעת כלי דם בשבוע הראשון לאחר לידה. מודל זה יש גם את היתרון שיש שתי דימבנה mensional (2D) מה שהופך את הניתוח פשוט לעומת האנטומיה 3D המורכבת של רשתות כלי דם אחרות. על ידי ניתוח של כלי דם ברשתית מקלעת בזמנים שונים לאחר לידה, ניתן לקיים את השלבים השונים של אנגיוגנזה מתחת למיקרוסקופ. מאמר זה מדגים הליך פשוט לניתוח בכלי הדם של רשתית באמצעות עכבר מכתים ניאון עם נוגדנים ספציפיים isolectin וכלי דם.

לאחר נתיחת הרשתית צריכה להיראות כמו פרח שטוח (איור 1). על ידי שימוש בפרוטוקול, שתואר לעיל, ניתן לראות תאי האנדותל באמצעות מכתים B4-Alexa488 isolectin ותמיכה בתאי שריר לב וכלי דם הם דמיינו באמצעות אקטין שריר חלק אנטי אלפא (איור 2). צפה בצריכת החשמל הנמוכה באמצעות מטרת 5X באיור 2 מאפשרת סקירה של ארגון כלי הדם של הרשתית. כמו כן, על ידי שימוש בשילוב של נוגדנים שניתנו בפרוטוקול לעיל שונה, ניתן לראות תאי האנדותל באמצעות immunostaining א...

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה ב<em&gt; In vivo</em&gt; הקשר. מכתים Immunofluorescent לדמיין במדויק מקלעת כלי הדם הוא מכריע להצלחה של סוגים של מחקרים אלה.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון אנגיוגנזה ברשתית של עכבר יילוד. הדבר מושג תחילה על ידי גרעיון של עיניים לאחר הלידה, ולאחר מכן על ידי החלת חומר מקבע. השלב השלישי הוא להוציא בזהירות את רשתית העכבר לאחר הלידה בצורת עלה, והשלב הסופי הוא לצבוע את כלי הדם ברשתית. בסופו של דבר, הדמיה של כלי הדם ברשתית העכבר מושגת באמצעות צביעה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית.את הפרוצדורה הזו ידגימו ד"ר Simon Tlo, פוסט-דוקטור במעבדה שלי, ו-Kathleen Allenson, חברה לשעבר במעבדה שלי. לאורך פרוצדורה זו, טמפרטורת ברירת המחדג היא טמפרטורת החדר. התחילו במיקום גור של עכבר שהורג באופן הומני על צדו בעזרת מספריים.הסר את העור המכסה את העין. לאחר מכן, כאשר המספריים ממוקמות מתחת לעין, גזור את העצב האופטי ואת הרקמות שסביבו והוצא את העין. העבר את העין שהוצאה ללוחית 24 בארות המכילה חומר מקבע, שהוא 4%PFA בריכוז פי שניים.PBS, המשיכו בניתוח העין הבאה בזמן שאחת נמצאת במקבע. ההפרש בין שני ניתוחי העיניים יהיה חצי דקה. עם תרגול.אפשרו לכל עין להתרחע (fix) במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, העבירו אותן ל-PBS קר בריכוז פי 2 על קרח למשך חמש עד 10 דקות לפחות. לפני בידוד הרשתיות, אספו כמה עיניים שתרצו לתוך ה-PBS, באמצעות פיפטת פסטור פלסטית שנקצצה כדי להרחיב את הפיה.העבירו את העיניים לצלוחית פטרי המכילה פי שניים PBS תחת מיקרוסקופ סטריאו. הסירו כל רקמת שומן סביב העין באמצעות פינצטה ומספריים. נקבו את קצה הקרנית בעזרת מספריים חדים וגזרו מסביב לקרנית ולקשתית, והשליכו רקמות אלו.לאחר מכן, הכניסו את הפינצטה בין הרשתית ללובן העין (sclera). הסירו את לובן העין תוך הקפדה לא לקרוע את הרשתית. ניתן להסיר גם את שכבת הכורואיד (choroid), כל עוד אין סיכון לפגיעה ברשתית.השארת שכבת הכורואיד (choroid) אינה אמורה להשפיע באופן משמעותי על איכות הצביעה האימונוהיסטוכימית. כעת, בעזרת פינצטה, הסירו את העדשה ואת הגוף הזجاجי. לאחר מכן, הסירו את כלי הדם של הרשתית.השתמשו בפינצטה עדינה כדי לאסוף אותם יחד במרכז העין. לאחר מכן, משכו אותם במהירות הרחק ממרכז הרשתית. הקפידו במיוחד להסיר את כל ה-yellow thistle, כיוון ששאריות שיישארו עלולות להסתיר את תוצאות המדידה.יש להעביר כעת את הרשתית, שנראית כגביע, לצלוחית פטרי נקייה ולשטוף אותה ב-PBS. כעת, בתוך הרשתית, בצעו ארבעה עד חמישה חתכים רדיאליים המגיעים לכשני שלישים מהדרך לעבר המרכז.השתמשו במספרי קפיץ כדי ליצור רשתית בצורת עלה. שלב זה דורש סבלנות ותרגול כדי להגיע לביצוע מושלם. כעת, שאבו את רוב ה-PBS באמצעות פיפטת פסטור.פעולה זו תגרום להשטחה של הרשתית. לאחר מכן, הסיר שאריות של PBS באמצעות פיסת נייר סופג קטנה. בשלב הבא, טפטף מנול בתמיסות של 20- מעלות על פני השטח של הרשתית עד שהיא תהיה שקועה ברובה, ולאחר מכן הוסף מנול באופן נדיב.הרשתיות יהפכו ללבנות. שלב זה מסייע בקיבוע הרשתיות ויקל על החדירה. העבר את הרשתיות מהמתנול הקר למבחנה קטנה.השתמשו בפיפטת פלסטיק בעלת פיה רחבה. אפשרו להם להדגר במתנול קר למשך 20 דקות לפחות; במידת הצורך, ניתן להשאיר את הרשתיות במתנול בטמפרטורה של 20- מעלות למשך מספר חודשים. השתמשו בנוגדן זה בלבד.לא ניתן להשתמש בצילום הקינמטי (cine) בהצלחה ברשתית אימהית מקובעת. במקרה זה, יש להעביר את הרשתית ישירות לצביעה אימונוהיסטוכימית לאחר פריסתה לצורת עלי כותרת. התחילו בשאיבה זהירה של המתנול מהרשתיות באמצעות פיפטה.לאחר מכן, שטפו את הרשתיות באופן מהיר ועדין ב-1x PBS. הסירו את ה-PBS וכסו את הרשתיות ב-100 µL של תמיסת perm block עם 5% מהסרום המתאים. הניחו לרשתיות להתנער בעדינות למשך שעה.הסיר את תמיסת ה-perm block באמצעות פיפטה והחלפה אותה ב-100 µL של תמיסת perm block המכילה את הנוגדן הראשוני או is selectin לפני כן. לאחר מכן, הגדר את הרשתות לדגירה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי ניעור. שטוף את הרשתות ארבע פעמים ב-PBS TX למשך 10 דקות לכל שטיפה.בצעו נעירה עדינה במהלך כל שלבי השטיפה. אם הנוגדן הראשוני אינו מצומד, הוסיפו 100 µL של הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים, מדולל ביחס של 1:200 ב-PBS tx. דגרו את הרשתות ללילה בטמפרטורה של 4 °C או למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין, ולאחר מכן הסירו את הנוגדן המשני.שטפו את הרשתיות ארבע פעמים ב-PBS TX תוך נדנוד עדין למשך 15 דקות לכל שטיפה. כעת עברו לשלב ההטמעה. העבירו את הרשתיות למשקופיות באמצעות פיפטת פלסטיק בעלת פיה רחבה והסירו שאריות של P-B-S-T-X בעזרת טישיו.לאחר מכן, רכסו את הרשתיות ב-50 µL של Prolong Gold וכסו בעדינות את התמיסה באמצעות זכוכית כיסוי. כדי לאפשר ל-Prolong Gold להתקשות, קיררו את השקופיות במקרר למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C, כשהן מוגנות מאור. למחרת, המשיכו בדימוג של הרשתיות לאחר הניתוח.הרשתית צריכה להיראות כפרח שטוח בשימוש ב-ISO selectin B four Alexa 4 88. התאים האנדותליאליים נצבעו ומופיעים בצבע ירוק. תאי שריר וסקולריים תומכים הודגמו באמצעות Antifa smooth muscle, actin. תצפית בהגדלה נמוכה באמצעות עדשה פי 5 אפשרה סקירה כללית של הארגון הוסקולרי של הרשתית באמצעות שילוב שונה של נוגדנים.ניתן לראות תאי אנדותל באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית ב-anti CD 31, ואילו טפילים תומכים הודגמו באמצעות נוגדן נגד NG two. לחלופין, הטפילים התומכים נצבעו ב-anti desmin. צביעת anti desmin מדגימה את הבליטות דמויות האצבע של הטפילים ומסייעת לקבוע אם הם קשורי קשר הדוק לתאי האנדותל.לעומת זאת, צביעת anti NG two מדגישה את הגרעינים של כל טפיל, דבר המועיל בעת כימות מספר תאי הטפילים בכלי הדם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע ממגע עם פני השטח של הרשתית ומגרימת נזק להם באמצעות כלי הניתוח. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון צביעת BD, כדי לחקור פרוליפרציה של תאים ספציפיים.

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. Exp. (2021). סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית רשתית in vivo באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. עכברים מורדמים מוכנים להדמיה על ידי אבטחת ראשם, מריחת חומר סיכה לעיניים והנחת כיסוי על העין. תאי גנגליון רשתית (RGCs) המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים מוצגים לראשונה באמצעות אפיפלואורסצנציה ליישור. לבסוף, נעשה שימוש בהדמיה דו-פוטונית, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של RGCs.

הדמיית שני פוטונים in vivo של רשתית העכבר

מקור: בוסקו, א., .  In vivo דינמיקה של הפעלת מיקרוגליה ברשתית במהלך ניוון עצבי: הדמיה אופטלמוסקופית קונפוקלית ומורפומטריית תאים בגלאוקומה של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)} סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה. עכבר טרנסגני עם מיקרוגליה ברשתית המבטאת חלבון פלואורסצנטי ממוקם מתחת לאופטלמוסקופ. תאורת אינפרא אדום משמשת לאיתור ראש עצב הראייה (ONH), ומישור המוקד נוצר באמצעות כלי דם ברשתית כציוני דרך. לאחר מכן משתמשים בהדמיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את המיקרוגליה...

הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה

ציטומגלווירוס זיהום (HCMV) אנושי של ילודים מייצג גורם חשוב של פיגור שכלי, אולם האירועים המולקולריים המובילים להיווצרות מחלה הנגרמת וירוס עדיין הם הבינו היטב. כדי לחקור את הדינמיקה של דלקת המוח, התאמנו כל הבעלים...

שימוש<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה למעקב אחר ההתקדמות של זיהום ציטומגלווירוס עכבר ניסיוני בילודים

הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הניאו-וסקולריזציה הכורואידלית (CNV) המושרה על ידי לייזר עכבר, מודל ניסיוני המשחזר את סימני ההיכר של כלי הדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל ניאו-וסקולרי (AMD). לאחר שליטה, הוא יכול לגרום באופן אמין ויעיל ל-CNV כמערכת מודל לבדיקת אמצעים ניסיוניים שונים.

מודל עכבר לneovascularization Choroidal מושרה לייזר

כאן, אנו מציגים את התועלת של האורך ויוו הדמיה מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית בעכברים.

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

כלי דם ברשתית עכבר מעניינים במיוחד בהבנת המנגנונים של היווצרות תבניות כלי דם. פרוטוקול זה מודד באופן אוטומטי את הקוטר של כלי הדם ברשתית העכבר מתמונות פונדוס אנגיוגרפיה פלואורסצנטית במרחק קבוע מהדיסק האופטי.

מדידת קוטר כלי הדם ברשתית מתמונות אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של עכבר

הפריציטים בכלי הדם ברשתית נבדקו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי. הרשתית המסומנת טופלה עוד בשיטת ניקוי הרקמות והותקנה בשלמותה להמחשת התצוגות התלת מימדיות של פריציטים המקיפים את כלי הדם ברשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית 

חקור מנגנוני אנגיוגנזה ברשתית עכבר ילודים באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל וצביעת Immunofluorescent. שיטה זו מאפשרת חקירת התפתחות כלי הדם והשפעת גורמים גנטיים ותרופתיים על תהליכי אנגיוגנזה בגוף החי.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה

גלה סרטונים נוספים