שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה
31 באוגוסט 2013
כאן אנו מתארים שיטה כללית להקרנת מטריצת microseed אקראית. טכניקה זו מוצגת להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ניסויי הקרנת התגבשות חלבון, להפחית את הצורך באופטימיזציה, ולספק אספקה אמינה של גבישים לאיסוף נתונים וניסויים יגנד שרייה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את המספר ואיכות העקיפה של גבישי חלבון המתקבלים מניסוי סינון התגבשות. לשם כך, מזוהה חומר גבישי או משוקע מניסוי סינון התגבשות חלבון קיים שהוקם באמצעות חלבון מטרה מעניין, החומר הגבישי או המשקע נקצר ולאחר מכן משמש ליצירת מלאי זרעי גביש. לאחר מכן, נוצרת סדרה של מסכי התגבשות המכילים הן את חלבון המטרה המעניין והן את זרעי הגביש.
לבסוף, מסכי ההתגבשות הזרעים מנוטרים להיווצרות גבישים ומאופיינים גבישי חלבון חדשים. בסופו של דבר, יישום הליך זה יכול לגרום לעלייה בגודל המספר ובאיכות העקיפה של גבישי חלבון המתקבלים מניסויי סינון התגבשות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, למשל, זריעה מיקרו מסורתית או זריעה מאקרו, הם שניתן לבצע אותה במהירות, ניתנת להרחבה גבוהה ולדגום שטח התגבשות משמעותי יותר משיטות זריעה אחרות.
יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שימוש בחומר מוצא גבישי איכותי לייצור מלאי זרעים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרשת מידה משמעותית של מיומנות ידנית במהלך שלבי קצירת הגבישים והמניפולציה. הדגמה ויזואלית של שיטת אם קריטית כמיקרו זריעה אקראית של מטריצה חורגת באופן משמעותי משיטות אחרות של זריעת גבישים.
הדקויות של שיטה זו הן המפתח להצלחה, וכמה מהן מאתגרות לתקשר במדויק בצורת טקסט. התחל הליך זה רק עם מגש התגבשות יושב באמצעות מיקרוסקופ דו-עיני או מערכת הדמיית גבישים. בדוק את המגש כל יום בשבוע הראשון.
לאחר מכן, פעם בשבוע לאחר מכן, רשום את גודל הגביש. ברגע שאין עדות לצמיחה נוספת, בחר באר מתאימה אחת או יותר מהמגש שממנו ניתן לקצור חומר גבישי. ליצירת מלאי זרעים, ניתן להשתמש בכל חומר, כולל מחטים עדינות, אורות ריגול, מיקרו גבישים וגבישים לא סדירים שנוצרו בצורה גרועה.
חומר ישן יותר נוטה להיות מקושר חלקית ופחות מתאים לשימוש בניסויי זריעה. ביום הקציר, השתמש בלחמניות מודלקות כדי ליצור בדיקה מעוגלת מפיפטה מרעה מזכוכית. לשם כך יש לחמם את הפיפטה ליד האמצע עד שהיא הופכת רכה.
לאחר מכן הסר אותו במהירות מהלהבה ומשוך אותו החוצה על ידי משיכת הקצוות זה מזה. שאפו למשוך את הזכוכית לקוטר של פחות מ-0.25 מילימטרים בנקודה שבה היא כ-0.25 מילימטרים. שוברים את הכוס וצוללים לזמן קצר את הקצה השבור לתוך הלהבה.
חזור על תהליך זה עד שנוצר חצי כדור זכוכית בקצה בקוטר של כ- 0.75 מילימטרים. הניחו צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל חרוז זרעים על קרח. לאחר מכן, פתח את מגש ההתגבשות שנבחר.
ובכן, עבור 24 מגשי טיפה תלויים היטב. השתמש בזוג פינצטה כדי להסיר את החלקת הכיסוי. לאחר מכן הפוך את החלקת הכיסוי והנח אותה על משטח נקי ויציב.
ל-96 מגשי טיפה יושבים היטב. השתמש באזמל כדי לחתוך סביב סרט תקרת הפלסטיק בחלק העליון של הבאר שנבחרה ולאחר מכן הסר את החלק הכרות של סרט התקרה באמצעות פינצטה. הסר 50 מיקרוליטר מתמיסת המאגר והעביר את הנוזל הזה לצינור המיקרו צנטריפוגה המכיל את חרוז הזרע, וודא שהצינור יישאר על קרח לאורך כל ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הכנת מלאי הזרעים.
חשוב לבצע זאת בדיוק כפי שמתואר ובמהירות האפשרית. הקפד לרסק היטב את חומר הזרע בעזרת הגשושית ולהתאושש ככל האפשר תוך כדי צפייה בדגימה במיקרוסקופ. השתמש בבדיקת הזכוכית שהוכנה קודם לכן כדי לרסק היטב את הגבישים שעל הכיסוי.
טיפות החלקה. גבישים קטנים עשויים לקחת מספר דקות למעוך ביסודיות. גבישים שקל לכתוש אינם צולבים ואינם גבישי מלח.
בעוד שגבישי מלח מייצרים קליק ייחודי שניתן לשמוע ולהרגיש כאשר הם נמעכים. לאחר מכן, הסר חמישה מיקרוליטר מתמיסת המאגר מצינור חרוז הזרע והעביר לבאר המשנה המקבילה לניסוי טיפת ישיבה או החלקת כיסוי לניסוי טיפה תלויה המכילה את החומר הגבישי שיש לקצור. פיפטו את הנוזל הזה למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים כדי להשעות כמה שיותר מבאר המשנה או לכסות את תכולת החלקה.
החזר את התרחיף לצינור חרוז הזרע וחזור על שלב זה פעמיים נוספות, כדי להבטיח שכמה שיותר חומר גבישי ייקצר. מערבולת, חרוז הזרע למשך שתי דקות, עוצר כל 30 שניות כדי לקרר את הצינור על קרח. בצינורות של 1.5 מיליליטר המכילים תמיסת מאגר.
הכינו סדרת דילול לארכיון דילול מלאי הזרעים בתמיסת המאגר בפקטור של ארבעה עד 10 בכל שלב. אם הזרע, הציר והדילולים לא ישמשו באופן מיידי, הניחו 10 עד 20 מיקרוליטר במקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס או שלילי 80 מעלות צלזיוס לאחסון. לאחר הקפאה, ניתן לשמור את מלאי הזרעים ללא הגבלת זמן עד לצורך.
ניתן לבצע סינון התגבשות RMMS באמצעות מגשי 24 בארות המשתמשים בשיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויה או מגשי 96 בארות בשיטת דיפוזיה של אדי טיפה בישיבה. כדי לבצע את בדיקת ה-MMS שלנו ב-24 מגשי טיפה תלויים היטב, השתמש בפיפטה כדי להעביר ידנית 300 מיקרוליטר מכל מצב ממסך התגבשות של 96 תנאים ב-10 מיליליטר. פורמט צינור יחיד לכל באר של 4 24.
מגשי התגבשות משומנים מראש היטב מכל מאגר של 300 מיקרוליטר מעבירים מיקרוליטר אחד מכל מצב התגבשות אל פני השטח של מעטפת כיסוי פלסטיק מתאימה שממנה הוסרו רצועות גיבוי מגן קדמיות ואחוריות למיקרוליטר אחד. על פתק הכיסוי, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת חלבון, ואז 0.5 מיקרוליטר מלאי זרעי קריסטל. בסבב הראשון של RMMS, חשוב לא להשתמש בתמיסת מלאי הזרעים המדולל.
מכיוון שככל שריכוז הזרעים גדול יותר, כך יתקבלו יותר פגיעות התגבשות. הפוך כל החלקת כיסוי כך שטיפת הנוזל פונה כלפי מטה וממוקמת מעל המתאים. לחץ היטב כלפי מטה על החלקת הכיסוי, דחס את שומן התקרה וצור אטימה מאובטחת.
לאחר הקמת כל 96 הטיפות, העבירו את המגש לחממה בטמפרטורה של ארבע עד 18 מעלות צלזיוס או לחדר טמפרטורה קבועה לאחסון. כדי לבצע את הקרנת ה-MMS שלנו ב-96, מגשי טיפה יושבים היטב. השתמש ברובוט התגבשות או בפיפטה בת שמונה ערוצים כדי להעביר 20 עד 50 מיקרוליטר מכל מצב ממסך התגבשות של 96 מצבים בפורמט בלוק באר עמוק לכל באר מתאימה של מגש ההתגבשות.
לאחר מכן, העבר 1.0 מיקרוליטר תמיסת חלבון, 1.0 מיקרוליטר מצב התגבשות ו -0.5 מיקרוליטר מלאי זרעים לטיפות. אטמו את המגש באמצעות יריעת תקרה שקופה והעבירו אותו לאינקובטור בטמפרטורה של ארבע עד 18 מעלות צלזיוס או חדר טמפרטורה קבועה לניסויי אחסון יש לבדוק אחת ל-24 שעות במשך חמישה ימים לאחר ההקמה, ולאחר מכן אחת לשבעה ימים למשך עד ארבעה שבועות באמצעות מיקרוסקופ דו-עיני או מערכת הדמיה גבישית. בדוק כל תת-באר או החלקת כיסוי ברצף ורשום כל עדות להיווצרות גבישים.
השוו את התוצאות מניסויי סינון ה-MMS שלנו לאלו ממסכים שאינם ED ורשמו את כל ההבדלים. ייתכן שיידרשו מחזורים מרובים של RMMS. לפני עקיפה אופטימלית מיוצרים גבישים איכותיים למחזורים נוספים.
השתמש במלאי הזרעים המדולל בארכיון לפי הצורך כדי לשלוט במספר הגבישים לבאר. כדי להדגים את היעילות של RMMS. שיטות סינון יושמו להתגבשות של חינה, ליזוזים לבן וזרז כבד בקר עבור כל מצב חלבון 3 96.
נעשה שימוש במסכי התגבשות J-C-S-G-P-A-C-T ומורפיאוס. לאחר חמישה ימים, נבחר מצב יחיד מכל מגש שנמצא תומך בצמיחת חומר גבישי ושימש לייצור מלאי זרעים. לאחר חמישה ימים נבדקו מגשי ההתגבשות ונרשם מספר הטיפות עם הגבישים.
איור זה מסכם את תוצאות הניסוי הזה ומספק ניתוח כמותי לליזוזים של חלבון ביצת תרנגולת. עלייה של פי ארבעה עד עשרה בשיעור הצלחת ההתגבשות בהשוואה למגשים שאינם ED נצפתה כאשר RMMS הוחל על חלבון זה. יש לציין כי עבור קטלאז כבד בקר, רק מצב אחד במסך מורפיאוס נמצא מניב גבישים, בהשוואה ל-55 מצבים שזוהו בעקבות השימוש ב-RMMS.
יתר על כן, חלה עלייה של פי שלושה וכפול בשיעור ההצלחה של התגבשות פחיות כבד בקר באמצעות מסכי JCSG ו-PACT בהתאמה בכל המקרים, וללא קשר למסך ההתגבשות בו נעשה שימוש, בדיקת ה-MMS שלנו הניבה מספר כולל גדול משמעותית של גבישים מאשר סקר שאינו RMMS. אנו מסיקים כי ה-MMS שלנו היא גישה פשוטה אך רבת עוצמה, שיכולה להגדיל משמעותית את שיעור ההצלחה של ניסויי סינון התגבשות חלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע ניסוי סינון מטריצה זרעי מיקרו אקראי מזיהוי וקציר של חומר גבישי דרך הכנת מלאי זרעי קריסטל, ולבסוף, הקמת התגבשות זרעים לאחר שליטה.
ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה. לניסויי סינון מיקרו-זריעה אקראיים של מטריצה שבוצעו באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים או תוך כשלוש שעות לניסויים המבוצעים ביד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שכל מסכי ההתגבשות הזרעים אטומים היטב לפני האחסון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לסריקת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית שמטרתה להעלות את שיעורי ההצלחה של קריסטליזציה של חלבונים. הטכניקה מפחיתה את הצורך באופטימיזציה ומבטיחה אספקה רציפה של קריסטלים עבור ניסויים המשך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- גביש חלבון
- ביולוגיה מבנית
- טכניקות קריסטלוגרפיה
רקע
- הגבשה של חלבונים היא קריטית לניתוח מבני.
- שיטות מסורתיות דורשות לעיתים קרובות אופטימיזציה נרחבת.
- הגבשה עם גרעיני התגבשות (Seeded crystallization) יכולה לשפר את איכות הגבישים.
- סריקת מטריצת מיקרו-גרעינים אקראית מציעה גישה חדשנית.
מטרת המחקר
- להגדיל את מספר גבישי החלבון המתקבלים.
- לשפר את איכות העקיפה של הגבישים.
- לייעל את תהליך סריקת ההתגבשות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זיהוי חומר גבישי או משקעים מניסויים קיימים.
- איסוף חומר ליצירת מלאי זרעי גביש.
- הקמת סריקות התגבשות עם חלבוני מטרה וזרעי גביש.
- ניטור סריקות עם זריעה לצורך זיהוי התגבשות ואפיון הגבישים.
תוצאות עיקריות
- עלייה במספר ובגודל של גבישי חלבון.
- שיפור באיכות הדיפרקציה של הגבישים שהתקבלו.
- ביצוע מהיר יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- גישה ניתנת להרחבה (Scalable) הדוגמת מרחב התגבשות רחב יותר.
מסקנות
- השיטה משפרת באופן משמעותי את תוצאות הגביש של החלבון.
- היא מספקת אספקה מהימנה של גבישים למחקרים המשכיים.
- טכניקה זו עשויה להחליף שיטות זריעה מסורתיות ביישומים רבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גבישוב חלבונים נותר צוואר בקבוק קריטי בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות, שבו שיעורי הצלחה נמוכים מעכבים את תיקוף המטרה ואת התכנון המבוסס על מבנה. סריקת מטריצת מיקרו-גרעינים אקראית (rMMS) משפרת את שיעורי ההצלחה בגבישוב ואת איכות הגבישים ללא צורך באופטימיזציה נרחבת, ובכך תומכת ישירות בהפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של מטרות טיפוליות. על ידי אפשור ייצור מהימן של גבישים לניסויי עקיפה וספיגה, rMMS משפרת את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים ובקידום פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות גישה משופרת לגבישים איכותיים של חלבונים לצורך ניתוח מבני.
- ערך תפעולי: מפחית את צריכת הזמן והחומרים בסריקת גבישון על ידי הגברת שיעורי ההצלחה במגוון מערכי תנאים.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון במטרה על ידי אספקת נתוני דיפרקציה מהימנים לעיצוב תרופות מונחה-מבנה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצרי גבישים הניתנים לשחזור המאפשרים ספיגה עקבית של תרכובות ומסעות סריקה של פרגמנטים.
- ערך תפעולי: תואם לרובוטיקה של טיפול בנוזלים ולפורמטים סטנדרטיים של 96 בארות או 24 בארות, מה שמבטיח סקילביליות וסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך שחזור: מפיק עליות כמותיות במספר ובגודל הגבישים, ובכך תומך בהתקדמות חסונה משלב ה-hit-to-lead.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקל על אופטימיזציה מבוססת מבנה באמצעות אספקת גבישים להשריה של ליגנדים ואפיון של אתרי קשירה.
- ערך פרה-קליני: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות נתונים ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות בין המטרה לליגנד.
- ערך רציפות: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי הבטחת אספקה קבועה של גבישים באיכות דיפרקציה למחזורי תכנון איטרטיביים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
rMMS משתלב בזרימת העבודה של קריסטלוגרפיה של חלבונים לאחר הסריקה הראשונית ולפני איסוף הנתונים, ובכך משפר את מהימנות הקלטים המבניים לקבלת החלטאות בשלבי האופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: מעלה את הסבירות להשגת גבישים באיכות דיפרקציה, המאפשרים קביעה מדויקת של מבנה המטרה לצורך תיקוף היפותזות.
- סריקה: משפרת את המוכנות של הבדיקה על ידי ייצור תנובה גבוהה יותר של גבישים המתאימים לסריקת פרגמנטים או תרכובות.
- אנליזה: מספקת פלטיים מדידים כגון מספר הגבישים, גודלם ורזולוציית הדיפרקציה, המשמשים לקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות המטרה (go/no-go).
- מחקר תרגומי: תומך בהמשכיות פרה-קלינית על ידי אפשור זיקוק מבוסס-מבנה של תרכובות מובילות באמצעות ניסויי השרייה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן בנק זרעים בר-שימוש חוזר מחומר גבישי באיכות נמוכה, ובכך מפחית את התלות באופטימיזציה נרחבת עבור כל מטרה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הגברת הגישה לנתונים מבניים ברזולוציה גבוהה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי גבישה בפלטפורמות ידניות ואוטומטיות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ את זיהוי המוליכים (leads) על ידי צמצום צווארי בקבוק ביצירת נתונים מבניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון באמצעות תוצאות גבישה מהירות ואמינות יותר.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בגבישים ובמיקרוסקופיה לצורך הכנה יעילה של מלאי זרעים.
- תלוי בגישה למערכות דימות של התגבשות ולאחסון בטמפרטורה מבוקרת לצורך ניטור הסריקה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת זרעים ולדילול כדי להבטיח שחזור בין צוותים.
- חייב להביא בחשבון שונות ביעילות הזרעים בהתבסס על איכות הגביש ומצב חומר המקור.
- מרוויח מהדרכה בשלבים הדורשים זריזות ידנית, כגון הכנת גשש זכוכית וריסוק גבישים.
