Name: Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למדו את פרוטוקול הפרביוזיס בעכברים ליצירת מערכת דם משותפת ללא דיכוי חיסוני. שיטה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח בחימריזם דם באמצעות ציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לAdriane מוזלי וLibuse ג&#39;רבק (סטנפורד) לקבלת סיוע בטכניקה הניתוחית.

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימוש של UCLA והמכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. משך הזמן של ההליך המתואר להלן הוא כ 45-60 דקות מהתחלה ועד הסוף. 1. הכנה של שדה כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך בחדר ניתוח של בעלי החיים נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד: מאדה isoflurane, Gaymer T משאבה עם כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים סטריליים: שני מלקחיים מעוקלים, מספריים בסדר, בעל מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפפות סטריליות יש להשתמש במהלך ההליך כולו. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני עכברי זכר או נקבה, מאותו הרקע גנטי, של משקל וגודל דומים באותו הכלוב ולפקח לשבועות לפחות, כדי להבטיח חיים משותפים והרמוניים. נקבות עכברים הם העדיפו בשל ההתנהגות פחות האגרסיבית שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידיבאמצעות אידוי isoflurane. מקום עכברים בPOSI-חותם אינדוקציה הלשכה מחוברים לאידוי isoflurane (4-5% V / V). לאחר ההרדמה מושרה, להעביר את בעלי החיים לאזור גילוח הפרווה ולשמור על ההרדמה בכל ההליך באמצעות חרטומו מחובר לisoflurane (1.5-2% V / V). החל משחת עיניים עם Q-טיפ כדי למנוע יובש בעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה. יסודיות לגלח את צד השמאל של העכבר ממוקם בצד השמאל וצד ימין של העכבר ממוקם בצד הימין מתחיל בכ 1 סנטימטר מעל המרפק עד 1 סנטימטר מתחת לברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים ידי ניגוב יסודי (2-3x) עם מגבונים ספוגים פולידין ואחרי מגבוני אלכוהול. מניחים את העכברים על משטח מחומם המכוסה במשטח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם ו0.1 מ&quot;ג / קילוגרם בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים בצד שלהם, גב אל גב, עםdjacent אזורים מגולחים פונים כלפי מעלה. כדי להימנע מכל זיהום של אזור הניתוח, לכסות את העכברים עם וילון סטרילי חושף רק את אזור הניתוח. ליצור פתח וילון קטן להישאר סטרילי בעת ביצוע הניתוח. אנחנו עשינו את חלון הווילון גדול שתהיינה לי צפייה טובה יותר בצילום וידאו. </li></ol> 3. Parabiosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים חדים, לבצע חתכים בעור אורך לצדדים המגולחים של כל התחלה של בעלי חיים ב0.5 סנטימטר מעל המרפק כל הדרך ל0.5 סנטימטר מתחת למפרק הברך (איור 1). בעקבות החתך, בעדינות לנתק את העור מfascia תת עורית על ידי מחזיק את העור עם זוג מלקחיים מעוקלים ולהפריד את fascia עם זוג שני כדי ליצור 0.5 סנטימטר של עור בחינם. לבצע הפרדה זו לכל אורך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הצטרפותו על ידי הצמדת olecranon השמאלית של חיה אחת לolecranon זכותו של האחר. olecranons ומפרקי הברך שניהם בצורה ברורה ה הבאה להבחיןחתך בעור דואר. כדי להקל על הצטרפותו, לכופף את המרפק של העכבר הראשון ולהעביר את המחט של 3-0 התפר שאינו נספג מתחת olecranon. בדומה לכך, לכופף את המרפק של העכבר השני ולהעביר את אותו התפר מתחתיה. צרף מפרקים בחוזקה על ידי קשר כפול כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מפרקי הברך בעקבות אותו ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות החיבור של המפרקים, לחבר את העור של שתי חיות עם תפר נספג רציף 5-0 Vicryl מתחיל ventrally מהמרפק לכיוון הברך. כדי למנוע קרע בעור והפרדה לבצע סגירת תפר הדוקה של העור באזור שסביב המרפקים והברכיים האזור. ברגע שהקובץ מצורף עור הגחון הושלם, לבצע קשר כפול כירורגית. מקם את העכברים במצב המועדים ולהמשיך dorsally התפר שהסתיימה עם קשר כפול כירורגית. בדוק את ההמשכיות של התפר ולאשר את חוסר פתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% NaCl תת עורי לכל עכבר כדי למנוע dehydration. </li></ol> 4. החלמה לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התאוששות, לספק carprofen משככי כאבים ועצירות. חזור intraperitoneally או תת עורי כל שעה 24 ו12, בהתאמה, עבור 48 שעות באותו המינון שתואר לעיל (שלב 2.5). לפקח על בעלי חיים לסימנים של כאב ומצוקה, כגון טלטול, עייפות, לעיסה של זנב, קימר את גבה, חוסר הטיפוח, וכו &#39;ביום למשך שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prophylactically, טיפול בעכברים עם השעיה אוראלית sulfamethoxazole / Trimethoprim בבקבוק המים שלהם 2 מ&quot;ג סולפה / מיליליטר +0.4 מ&quot;ג לקצץ מיליליטר / ל10 ימים כדי למנוע זיהומים חיידקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית כל זוג parabiotic בכלוב נקי עם חומר מונוליטי מצעים (מגבת נייר למשל או משטח סטרילי סופג) כדי למנוע שאיפה של חומר מצעים. להחזיר את בעלי החיים לכלוב מצעים מלאים כאשר הם מסוגלים לשמור על עינת חזה עם הראש שלהם למעלה. כדי למזער את המתחלהגיע למזון, תוך התאמה לקיום parabiotic, הנח את כדורי מזון הרטיב על רצפת הכלוב. לספק חומר קינון. ב1-2 שבועות יש עכברים parabiotic יכולת ambulate בדרך כלל על קדמיים ואחורי-גפיים לזווג בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> chimerism הדם מתרחש 10-14 ימים שלאחר הניתוח. </li></ol> 5. אישור והליך הפוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבועיים להקיז דם מורידי הזנב של כל עכבר לניתוח הזרימה cytometric כדי לאשר chimerism דם (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד דם לצורך ניתוח התזרים cytometric: לדלל 2-3 טיפות של דם ב500 μl של 10 mM EDTA. הוסף 500 μl של דקסטראן 2% (בדילול מלא PBS), ומערבב היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מעביר את supernatant בצינור חדש, ספין על 1,200 סל&quot;ד במשך 5 דקות ו resuspend תאי pelleted ב PBS (או חיץ אחר) לניתוח התזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לתכנון ניסוי, ניתן להפריד את זוג parabiotict נקודות זמן מאוחר יותר. מניסיוננו, יש לנו לשמור זוגות parabiosed לתקופה של עד 9 חודשים ללא כל סיבוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך הפוך על משטח כירורגי סטרילי. הרדימי עכברים ידי הצבת אותם בחדר אינדוקציה המחובר לאידוי isoflurane (4-5%) ולשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5-2%, כפי שתואר לעיל (שלב 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שיער מהאזור המקיף את התפר הראשוני וסביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים כפי שתואר לעיל (שלבים 2.3, 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם ו0.1 מ&quot;ג / קילוגרם, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה אזור ניתוח עם וילון סטרילי כפי שתואר לעיל (שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, להפריד את העכברים דרך חתך אורכים עם התפר לרוחב ועדינות לנתק את fascia שהוקם בין שני העכברים עם זוג מלקחיים מעוקלים. כדי להפריד את המפרקים, לחתוך את קשרים של התפרהקושר אותם. חתוך את העור לאורך החתך כדי להשיג קצוות חלקים ולצרף עור עם תפר נספג רציף 5-0 מצופה Vicryl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע התייבשות, לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% מתחת לעור NaCl לכל עכבר. לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, חוזר ממשל משכך כאבים, כל (0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) 24 שעות ועצירות carprofen (10 מ&quot;ג / קילוגרם) בכל שעות 12 ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהומים חיידקיים טיפול בעכברים עם ההשעיה sulfamethoxazole / Trimethoprim אוראלי (2 סולפה מ&quot;ג / מיליליטר +0.4 מ&quot;ג לקצץ / מיליליטר) בבקבוק המים שלהם ל10 ימים. </li></ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exp%C3%A9riences+et+consid%C3%A9rations+sur+la+greffe+animale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+l%27Anatomie+et+de+la+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Expériences et considérations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.</li>
<li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+of+parabiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li>
<li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li>
<li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li>
<li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+what+is+their+exact+location%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102(2007).</li>
<li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li>
<li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li>
<li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li>
<li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li>
<li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+the+H-Y+antigen%3A+Requirement+for+male+T+cells%2C+but+not+B+cells%2C+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת parabiosis דנה כאן מציגה קשיים מינימאליים טכניים ותוצאות בשיעורי תמותה נמוכות. הקובץ המצורף של מפרקי הברך ומרפק הוא שיפור משמעותי של Bunster והטכניקה מאייר. עם זאת, ההליך נותר פולשני ובכך שמירה על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח היא הכרחית. כדי למנוע זיהום של האתר כירורגית נוסף, חשוב שבעלי החיים parabiosed יקבלו שילוב של אנטיביוטיקה ולעקוב באופן קבוע. כדי להבטיח את תמיכת משרד ולמנוע כאב, את התפר שמחבר את המרפקים וברכיים צריך להקיף את המפרקים ולא עובר דרך הרקמות. <p class="...

Parabiosis, כירורגית הצטרפותו של שני אורגניזמים, תואר לראשונה בשנת 1864 ידי פול ברט כדרך לפתח מודל ללמוד מערכות מחזור הדם משותפות וכללה את הצטרפותו של העור וקירות שריריים של שתי חולדות 1. Parabiosis מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת 3 ויש לו כמה יישומים במחקרים פיסיולוגיים, כגון תקשורת הורמונלית בין בלוטת יותרת המוח ובלוטות המין, כמו גם את תפקידו של כליות יתר לחץ דם 4. זה כבר מועסק נוסף כדי לחקור את הגיוס ושילוב של תאי אב בneovascularization 5, הגירה של תאי גזע hematopoietic 6, וסחר הלימפוציטים 7, כמו גם את התפקיד וקינטיקה של מחזורי תאים דלקתיים או תאי גזע בגרורות סרטניים 8,9, ומחלות ניווניות 10. יתרון משמעותי אחד משקרי parabiosisשבחי השותפות לשתף אנטיגנים במחזור משותפים, המאפשרים נדידת תאים וneovascularization בלי לעורר תגובה חיסונית. חשוב לציין, וייסמן ואח&#39;. הראו parabiosis שבין עכברי זכרים ונקבה אינו מביא להיווצרות של ח.י. אנטי נוגדני 11. בפרוטוקול המקורי שתואר על ידי פול ברט שני בעלי החיים חוברו יחדיו באמצעות חיבור של העור ושרירים קירות 1. שיטה זו לעומת זאת, גרמה למתח משמעותי לבעלי החיים וגרמה לתמותה גבוהה עקב זיהום של הפצע. מאז טכניקת parabiosis תוקן על ידי מספר קבוצות עם השולט ביותר להיות הפרוטוקול שהוצע על ידי Bunster ומאייר ב -1933 2. השיטה שלהם כללה הצטרפות של מפרקי עצם השכם, חללים בגוף, ועור, ומאפשר תמיכה טובה יותר ופחות כאב לבעלי החיים. במקביל, השיטה החדשה הביאה לטיפול שלאחר ניתוח מינימאלי ומובהקcantly ירידה בשיעורי תמותה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של טכניקת Bunster והמאיירת שהיא פחות פולשני ומאפשרת הצטרפות מוצקה יותר. כלומר, מחוברים עכברים דרך מפרקי מרפק והברך, כמו גם את העור. הרחבה זו מצטרפת מונעת מהעור ולכן גורמת פחות כאבים וסיבוכים. כאן אנו מתארים את הצטרפותו של סוג בר עכבר בוגר (ט &#39;) לGFP מכונן המבטא עכבר. אנו מראים כי שבועיים לאחר ניתוח אנחנו יכולים להשיג 50% מchimerism הדם הממחישים את היעילות של פרוצדורה כירורגית זו כדי ליצור מערכת דם משותפת.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane-Phoenix</td><td>Clipper</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Seal תא אינדוקציה</td><td>מוצרי הדמיה מולקולרית</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה ניידת</td><td>מוצרי הדמיה מולקולרית</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Gaymer T</td><td>Pump Gaymar Industries, Inc</td><td>TP650</td><td></td></tr><tr><td>שמיכת חימום (כרית חימום)</td> <td>קנט סיינטיפיק Corp</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כלי מדע עדינים (FST)</td> <td>FST 14063-09</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>FST</td><td>FST 12501-13</td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח חשמלית</td><td>Oster</td><td>Golden A5</td><td></td></tr></tbody></table>

parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis הוא איחוד כירורגית של שני אורגניזמים המאפשרים שיתוף של זרימת הדם. מצרף את העור של שתי חיות מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת. שותפי Parabiotic לשתף אנטיגנים במחזור שלהם ולכן הם חופשיים של תגובה חיסונית שלילית. תואר לראשונה על ידי פול ברט בשנת 1864 1, ניתוח parabiosis היה מעודן על ידי Bunster ומאייר ב -1933 כדי לשפר את ההישרדות של בעלי החיים 2. בפרוטוקול הנוכחי, שני עכברים בניתוח הצטרפו הבא שינוי של Bunster והטכניקה מאייר. בעלי חיים מחוברים באמצעות מפרקי המרפק והברך ואחרי חיבור של העור ומאפשר תמיכה איתנה המונעת עומס על העור נתפר. בזאת, אנו מתארים בפירוט את parabiotic הצטרפותו של ה-GFP בכל מקום להביע את העכבר לסוג בר עכבר (WT). שבועיים לאחר ההליך, הזוג מופרד וניתן לאתר תאי GFP החיוביים על ידי ניתוח התזרים cytometric בcirculat הדםיון של עכבר WT. Chimerism הדם מאפשר לבחון את תרומתם של התאים במחזור מחיה אחת בשנייה.

התוצאה הצפויה של parabiosis של שני אורגניזמים היא התרומה שווה של מערכת הדם של כל חיה לזרימת דם נפוצה (איור 2). אפשר בקלות לאמת את האיזון המוצלח של דמם של העכברים החיוביים parabiosed WT וה-GFP על ידי ניתוח התזרים cytometric. הנה, דם ורידים הושג מהזנבות של שני parabionts ב2 שבועות לאחר הניתוח והיה מופרד לתאי דם היקפיים (להוציא אריתרוציטים). שבריר התא שמקורם hematopoietic המופרד נותח לאחר מכן על ידי cytometry זרימה לנוכחות של תאי GFP החיובי וWT. עולה בקנה אחד עם מחקר...

Parabiotic הצטרפותו של שני אורגניזמים מוביל להתפתחותה של מערכת דם משותפת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצעדים כירורגית כדי ליצור חיבור בין parabiotic עכבר wild-type ועכבר-GFP-לבטא מכונן.

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע חיבור פארא-ביוטי (parabiotic joining) של שתי עכברים כדי לחקור מערכת מחזור דם משותפת. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חתך בצדדים הסמוכים של בעלי החיים. לאחר הפרדת הפסציה (fascia), שתי העכברים מחוברות בצורה חזקה במפרקי המרפק והברך.השלב הסופי הוא חיבור עורן של שתי החיות באמצעות תפר רציף. לבסוף, ניתוח פלוויטומטרי יכול להראות כימריזם של דם בתוך 10 עד 14 ימים לאחר הפרוצדורה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון השתקת מחית גרמית או הזרקת תאים, הוא שהיא אינה דורשת דיכוי חיסוני ומאפשרת גם שמירה על סירקולציית CX למשך תקופה ממושכת.הפרוצדורה תודגם על גבי עכברים. המנתח מהמעבדה שלי יכין לפחות שבועיים מראש מספר כלובים עם זוגות עכברים מאותו מין, רצוי נקבות, בעלי גנטיקה זהה וגודל ומשקל דומים. לאחר בחירת זוג הרמוני, יש לבצע את הפראביוזה (parabiosis) בחדר ניתוח נקי לבעלי חיים.יש לוודא שכל כלי העבודה והכפפות הבאים במגע עם הדגימה הם סטריליים. הרדימו את העכברים בתא השראה של PAI המחובר למאייד איזופלורן. לאחר השראת ההרדמה, שמרו אותה לאורך כל הפרוצדורה.בעזרת קונוס אף, תוך מתן ריכוז נמוך של isof fluorine, גלחו כעת את פרוות הבטן בצדדים מנוגדים והשריגו משחה פתלוגית. לאחר מכן, הכינו את האזורים המגולחים באופן אספטי על ידי ניגוב יסודי במטריות ספוגות betadine, ולאחריהן במטריות אלכוהול.לאחר מכן, העבירו את העכברים למשטח חימום המכוסה במשטח סטרילי. לצורך אלחוש, השתמשו ב-carprofen וב-buprenorphine. הניחו את העכברים על צדם, גב לגב, כאשר האזורים הגולחים פונים כלפי מעלה.לאחר מכן, כסו את העכברים בסדין סטרילי, כך שרק אזור הניתוח יהיה חשוף. בעזרת מספריים חדים, בצעו חתכי עור אורכיים בצדי כל חיה, החל מחצי סנטימטר מתחת למפרק הברך ועד חצי סנטימטר מעל המרפק. לאחר החיתוך, הפרדו בעדינות את העור מהפסציה התת-עורית על ידי הרמת העור עם פינצטה מעוקלת והפרדת הפסציה עם זוג פינצטות שני.כדי ליצור חצי סנטימטר של עור חופשי, ה-LECs ומפרקי הברכיים ניתנים להבחנה בבירור. לאחר חתך העור, התחילו בחיבור ה-LECs השמאלי והימני. ראשית כופפו את המרפק של העכבר הראשון והעבירו את מחט התפירה בגודל 3.0 מתחת ל-Theon.שנית, כופפו את המרפק של העכבר השני והשחילו את אותה התפרה תחתיו. הדקו את המפרקים באמצעות קשר כירורגי כפול. לאחר מכן, חברו את מפרקי הברכיים לפי אותו הליך.לאחר חיבור המפרקים, חברו את העור של שתי החיות באמצעות תפר Vicryl 5-0 ספיג ורציף. התחילו מהצד הוונטרלי של המרפק כדי למנוע קרע והפרדה של העור.בצעו סגירה הדוקה של העור באמצעות תפרים באזור סביב המרפקים והברכיים. חיבור העור של העכברים הוא שלב קריטי בהליך זה. חשוב לוודא כי העכברים מחוברים בצורה הדוקה כדי למנוע קרע והפרדה לאחר הניתוח.לכן, מדי ארבעה עד חמישה חודשים, אנו מוודאים שהעור מחובר היטב. לאחר השלמת חיבור העור הבטני, הנח את העכברים במצב שכיבה על הבטן והמשך בתפירה גבית, ובסיום קשור קשר כירורגי כפול. וודא את רציפות התפרים ואשר שאין בהם פתחים.סיימו את הניתוח על ידי הזרקה תת-עורית של 0.5 mL של 0.9% Sodium chloride לכל חיה כדי למנוע התייבשות. השאירו את בעלי החיים על משטח החימום עד להתאוששותם. שכןו כל זוג פרביוטי במכלב נקי עם כופתיות מזון רטובות, כדי לצמצם את המאמץ הכרוך בהגעה למזון בזמן ההסתגלות למצב הפרביוטי.הניחו את כופתיות המזון על רצפת הכלוב. כמו כן, ודאו שסיפקתם חומר קינון במהלך 48 השעות הראשונות שלאחר הניתוח. ניתן carprofen בכל 24 שעות ו-buprenorphine בכל 12 שעות מדי יום למשך שבועיים.יש לנטר את בעלי החיים לאיתור סימני כאב ומצוקה, כגון רעידות, רפיקות, נשכנש של הזנב, גב קשתי, היעדר טיפוח עצמי וכן הלאה. כדי למנוע זיהומים חיידקיים במהלך 10 הימים הראשונים לאחר הניתוח, יש לטפל בעכברים באמצעות תמיסות פומית של sulfamethoxazole ו-trimethoprim בבקבוק המים שלהם. דגימת דם תתבצע 10 עד 14 ימים לאחר הניתוח.אם כן, לאחר שבועיים, שאבו דם מהורידי הזנב כדי לאשר כי הדבר התרחש. השתמשו בציטומטריית זרימה כדי לנתח את הדם. דללו שתיים עד שלוש טיפות ב-500 µL של 10 mM EDTA.לאחר מכן, ערבב היטב את הדילול עם 500 µL של 2% Dextrin ב-PBS. דגור את תערובת הדם בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן סבב אותה בצנטריפוגה כדי לאסוף את supernatant. לביצוע בפועל.ניתן לשמור על זוגות של פרוביוטיקה יחד למשך תשעה חודשים ולהפרידם ללא סיבוכים. בצעו את הפרוצדורה ההפוכה על משטח כירורגי סטרילי. השתמשו בפרוטוקול ההרדמה שתואר קודם לכן, והסירו את השיער מהאזור שסביב התפר הראשוני.לאחר הכנה אספטית של העור הגולח, ניתן את המשככי הכאבים וכסו את אזור הניתוח באמצעות סדין כירורגי תוך שימוש במספריים חדות. הפרידו בין העכברים באמצעות חתך אורך לאורך התפר הלטרלי להפרדת המפרקים, וגזרו את קשרי התפר המחברים ביניהם בכל עכבר. גזרו את העור לאורך החתך כדי להחליק את הקצוות.לאחר מכן, הצמידו מחדש את העור באמצעות תפר רציף נספג מסוג Vicryl מצופה 5-0 כדי למנוע התייבשות, מזריקו תת-עורית 0.5 mL של 0.9% sodium chlorides, ולאחר מכן השאירו את בעלי החיים על פד מחומם עד להתאוששותם מההרדמה. השתמשו באותם טיפולים פוסט-אופרטיביים אנלגזיים ואנטי-בקטריאליים כפי שתוארו בעבר; התוצאה המצופה מפרביוזה (parabiosis) של שני אורגניזמים היא תרומה שווה של מערכת הדם של כל בעל חיים לסירקולציית דם משותפת. איזון הדם מעכברי Wild type ומרכבי GFP positive נבדק באמצעות אנליזה של ציטומטריה עם זרימה, בהתאם למחקרים קודמים.דם מעכבר מסוג הבר (wild type) חשף נוכחות של כימריזם, כפי שהתבטא בכך שכשמחצית מתאי הדם היו חיוביים ל-GFP ומחציתם היו מסוג הבר. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה ב-45 עד 60 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מדגים שיטות להפקת הזרע מן האשכים של זכרים ואז כשזרעו נקבות עכברים. הליך זה שימושי כאשר זמן מדויק יש צורך במחקרים התפתחותיים כמו גם עבודה מהונדס.

קצירת הזרע והזרעה מלאכותית של עכברים

פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב כיצד ליצור עוברי דג זברה פרביוטיים מרקע גנטי שונה. בשילוב עם יכולות ההדמיה שאין שני להן של עובר דג הזברה, שיטה זו מספקת אמצעי רב עוצמה ייחודי לחקור פונקציות אוטונומיות של תאים לעומת פונקציות לא אוטונומיות של תאים עבור גנים מועמדים מעניינים.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

ניזול זרע נדרש הזרע להשתחרר הג'ל הזרע. מחקר זה מספק את נהלי איסוף זרע מן באיברי הרבייה הנקביים שלאחר ההזדווגות, ומדידת זמן ניזול זרע.

אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של כירורגיה אורתופדית, שבו נעשה שימוש כדי לחקור מנגנונים של neuroinflammation לאחר הניתוח, שינויים התנהגותיים, וכאשר בשילוב עם parabiosis, ללמוד התחדשות רקמות במהלך ההזדקנות.

דגם העכבר של כירורגיה אורתופדית ללמוד לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי ו התחדשות רקמות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

כאן אנו מתארים שיטה חדשה של זיהוי הקמת מוצלח של זרימת דם משותפת של שני parabits באמצעות הזרקת וריד caudal של גלוקוז, הגורם נזק מינימלי והוא לא קטלני לתוך parabionts.

מזהה הקמת אספקת דם משותף בעכברים Parabiotic על ידי הזרקת הסוכר קאודל וריד

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

שיטת מניפולציית צוואר הרחם המוצגת יכולה לגרום לפסאודו-הריון בעכברים ללא צורך בגידול נקבות עם זכרים שעברו כריתת כלי דם. השראת פסאודו-הריון נדרשת להצלחת החזרת עוברים לא כירורגית והזרעה מלאכותית לא ניתוחית, שניהם מוצגים גם.

גרימת פסאודו-הריון בעכברות נקבות ללא צורך בזכרים שעברו כריתת כלי דם לפני החזרת עוברים לא ניתוחיים או הזרעה מלאכותית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לגידול תת-סוגים ספציפיים של תאי היפותלמוס בתרבית. ניתן לבחור את התאים על סמך סמני ממברנה אופורטוניים/ייחודיים ולהשתמש בהם ביישומים רבים, כולל בדיקות אימונופלואורסצנטיות, אלקטרופיזיולוגיות וביוכימיות.

בידוד נוירונים היפותלמיים ממוקדים למחקרים על ויסות הורמונלי, מטבולי וחשמלי

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

למדו את פרוטוקול הפרביוזיס בעכברים ליצירת מערכת דם משותפת ללא דיכוי חיסוני. שיטה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח בחימריזם דם באמצעות ציטומטריית זרימה.

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

גלה סרטונים נוספים