Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע חיבור פארא-ביוטי של שני עכברים כדי לחקור מערכת דם משותפת. זה מושג על ידי ביצוע חתך תחילה בצדדים הסמוכים של בעלי החיים. לאחר הפרדת הפאשיה, שני העכברים מחוברים היטב במפרקי המרפק והברך.

השלב האחרון הוא חיבור העור של שני בעלי החיים על ידי תפר רציף. בסופו של דבר, ניתוח זרימה ציטומטרי יכול להראות כימריזם בדם תוך 10 עד 14 ימים לאחר ההליך. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת, כמו השתלת מח עצם או הזרקת תאים, הוא שהיא אינה דורשת דיכוי חיסוני ומאפשרת גם שמירה על זרימת CX לאורך זמן.

הדגמת ההליך תהיה לסת פונקטו. מנתח החיות מהמעבדה שלי לפחות שבועיים מראש, הקים כמה כלובים של זוגות עכברים מאותו מין, רצוי נקבה, אותה גנטיקה וגודל ומשקל דומים. לאחר שנבחר זוג הרמוני, בצע את הפרביוזה בחדר ניתוח נקי של בעלי חיים.

ודא שכל משטחי המגע, הכלים והכפפות סטריליים. הרדמו את העכברים בתא אינדוקציה של אטם PAI המחובר למכשיר אידוי איזו פלואור. לאחר השראת ההרדמה, שמור עליה לאורך כל ההליך.

בעזרת חרוט אף, המספק ריכוז נמוך יותר של איזוף פלואור, כעת מגלחים את פרוות הבטן שלהם בצדדים מנוגדים ומורחים משחה עיניים. ואז באופן אספטי. הכינו את האזורים המגולחים על ידי ניגוב יסודי במגבונים ספוגים בטדין ואחריהם מגבוני אלכוהול.

לאחר מכן, העבירו את העכברים לכרית מחוממת המכוסה בכרית סטרילית. לשיכוך כאבים, השתמש בקרפרופן ובופרנורפין. מקם את העכברים על צידיהם גב אל גב כשהאזורים המגולחים כלפי מעלה.

לאחר מכן מכסים את העכברים בווילון סטרילי, וחושפים רק את אזור הניתוח. בעזרת מספריים חדים מבצעים חתכי עור אורכיים לצידי כל בעל חיים, מתחילים חצי סנטימטר מתחת למפרק הברך, ומסיימים חצי סנטימטר מעל המרפק. לאחר החתך, ניתק בעדינות את העור מהפאשיה התת עורית על ידי החזקת העור כלפי מעלה עם זוג מלקחיים מעוקלים והפרדת הפאשיה עם זוג שני.

כדי ליצור חצי סנטימטר של עור חופשי, ניתן להבחין בבירור בין ה-LEC ומפרקי הברכיים. לאחר חתך העור, התחל להצטרף ל-LEC השמאלי והימני. ראשית כופפו את המרפק של העכבר הראשון והעבירו את המחט של תפר 3.0 מתחת לתיאון.

שנית, כופפו את המרפק של העכבר השני והעבירו את אותו תפר מתחתיו. חבר את המפרקים בחוזקה באמצעות קשר כירורגי כפול. לאחר מכן, חבר את מפרקי הברך לאחר אותו הליך.

בעקבות הצמדת המפרקים. חבר את העור של שתי החיות עם תפר ויקריל, נספג רציף של חמישה או. התחלה בגחון מהמרפק למניעת קרע והיפרדות בעור.

בצע סגירת תפרים הדוקה של העור באזור סביב המרפקים והברכיים. חיבור עכברי העור הוא שלב קריטי בהליך זה. חשוב לוודא שהעכברים מחוברים היטב כדי למנוע קרע והיפרדות לאחר הניתוח.

לכן, כל ארבעה עד חמישה חודשים, אנו מאשרים שהעור מחובר היטב. לאחר השלמת חיבור העור הגחוני, הנח את העכברים במצב שכיבה והמשך את התפר בגב המסתיים בקשר כירורגי כפול. ודא את המשכיות התפר ואשר שחסרים לו פתחים.

סיים את הניתוח על ידי מתן חצי מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי תת עורי לכל בעל חיים כדי למנוע התייבשות. שמור את בעלי החיים על הכרית המחוממת עד שהם מתאוששים. שכן כל זוג פארא-ביוטי בכלוב נקי עם כדורי מזון לחים כדי למזער את המתח של הושטת יד למזון תוך הסתגלות לקיום הפארא-ביוטי

הניחו את כדורי המזון על רצפת הכלוב. כמו כן, הקפידו לספק חומר קינון במהלך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח. יש לתת קרפרופן כל 24 שעות ולתת בופרנורפין כל 12 שעות ביום במשך שבועיים.

עקוב אחר בעלי החיים לאיתור סימני כאב ומצוקה, כגון עייפות רועדת, לעיסת זנב, גב מקומר, חוסר טיפוח וכן הלאה. כדי למנוע זיהומים חיידקיים במהלך 10 הימים הראשונים לאחר הניתוח, טפל בעכברים בתרחיף דרך הפה של סולפאמתוקסזול וטרימתופרים בבקבוק המים שלהם. צ'יזם דם יתרחש 10 עד 14 ימים לאחר הניתוח.

אז לאחר שבועיים, שאבו דם מוורידי הזנב שלהם כדי לאשר שזה קרה. השתמש בזרימה ציטומטרית כדי לנתח את הדם. מדללים שתיים עד שלוש טיפות ב -500 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי EDTA.

לאחר מכן מערבבים היטב את הדילול עם 500 מיקרוליטר של 2% דקסטרין ב- PBS. דגרו על תערובת הדם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן סובבו אותה כדי לאסוף את הסופרנטנט. כי בפועל.

ניתן לשמור זוגות פרוביוטיים יחד במשך תשעה חודשים ולהפריד אותם ללא סיבוכים. בצע את ההליך ההפוך על משטח כירורגי סטרילי. השתמש באותו פרוטוקול הרדמה כפי שתואר קודם לכן, והסר את השיער מהאזור המקיף את התפר הראשוני.

לאחר הכנת העור המגולח, יש לתת את משככי הכאבים ולכסות את אזור הניתוח בווילון בעזרת מספריים חדים. הפרד את העכברים דרך חתך אורכי לאורך התפר הרוחבי כדי להפריד את המפרקים, חתוך את קשרי התפר המחבר ביניהם על כל עכבר. חתוך את העור לאורך החתך כדי להחליק את הקצוות.

לאחר מכן חבר מחדש את העור עם תפר ויקריל רציף הנספג בציפוי חמש OH כדי למנוע התייבשות, תן חצי מיליליטר של 0.9% נתרן כלוריד תת עורי, ולאחר מכן החזק את בעלי החיים על חיית מחמד מחוממת עד שהם מתאוששים מההרדמה. השתמש באותם טיפולים משככי כאבים ואנטיבקטריאליים לאחר הניתוח כפי שתוארו קודם לכן, התוצאה הצפויה של פרביוזה של שני אורגניזמים היא התרומה השווה של כל מערכת דם של בעלי חיים למחזור דם משותף. שיווי המשקל של הדם מעכברים מסוג Parabios Wild ו-GFP חיוביים נחקר על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי התואם למחקרים קודמים.

דם מהעכבר מסוג הבר גילה נוכחות של כימריזם כפי שצוין על ידי כמחצית תאי דם חיוביים ל-GFP וחצי תאי דם מסוג פרא לאחר ששולטים. ניתן לבצע טכניקה זו תוך 45 עד 60 דקות אם היא מבוצעת כראוי.