בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי גזע שמקורם בשומן מהשומן המתקבל בצורה של שאיבת ליפו. זה מושג על ידי הסרת התמיסה הכירורגית תחילה ושטיפת השאיבה מתאי דם אדומים מזהמים. השלב השני הוא שחרור תאי הגזע באמצעות עיכול אנזימטי של שואב הליפו השטוף עם קולגנאז.

לאחר מכן, התאים המשוחררים בצורה של שבר כלי דם סטרומלי או SVF נאספים על ידי צנטריפוגה. השלב האחרון הוא להסיר את הסופרנטנט והצלחת, תאי ה-SVF לבחירה ותרבית של ה-ASCs הדבקים. בסופו של דבר אינדוקציה במבחנה של ASCs מתורבתים אלה לעבר העצם, השומן והסחוס.

ניתן להשתמש בשושלות כדי לאשר את נוכחותם של תאים אלה בתוך התרבית בנוסף לאישור הפוטנציאל הרב שלהם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הלוגיסטיקה של עבודה עם כמויות גדולות של אספירין ליפו לפני קציר התאים. הכן קולגנאז סטרילי סוג אחד תמיסה ואמצעי בקרה סטרילי.

אוספים את השאיפה של הליפו במיכל שאיפה. שפכו בזהירות את הליפו לתוך רמקול זכוכית סטרילי של ליטר אחד. כאשר שכבות השאיבה של הליפו נפרדו על ידי כוח הכבידה, שאפו את שכבת השמן העליונה אם קיימת.

כמו כן, הסר את החלק התחתון. העריכו את נפח שכבת רקמת השומן המתקבלת. הוסף נפח שווה של אחד סטרילי XPBS וערבב עם הפיפטה המשמשת לשאיפה.

כאשר שתי השכבות התייצבו, שאפו את האינט באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר. המשך לשטוף את שבר רקמת השומן עם PBS עד שלשכבת השומן יש צבע זהב צהוב. שאפו את האינטה בפעם האחרונה, והשאירו את חלק רקמת השומן.

ברמקול הזכוכית. הניחו לשכבות השאיפה של הליפו להתייצב במשך חמש דקות לאחר הכביסה האחרונה ולפני השאיפה הסופית. ביחידת פילטר, הכינו קולגנאז סטרילי אחד תמיסה.

הוסף נפח השווה לזה של שבר השומן והמסנן הסטרילי. לאחר מכן שפכו בזהירות את שבר השומן השטוף לתמיסת הקולגנאז וסגרו היטב את הבקבוק. לאחר מכן דגרו את תערובת השומן של הקולגנאז באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם מערבולת עדינה כל חמש עד 10 דקות, העריכו את שכבת רקמת השומן למראה חלק יותר ככל שהעיכול מתקדם ובמידת הצורך, הגדילו את זמן התגובה להמסת חתיכות שומן מוצקות.

עקרו את יחידת המסנן המכילה את תערובת השומן קולגנאז המעוכלת עם 70% אתנול והחזירו אותה לארון הבטיחות הביולוגית. כעת פיפטה של 25 מיליליטר של האינט המכיל את שבר כלי הדם הסטרומי לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מיליליטר. הוסף 25 מיליליטר של אמצעי בקרה לכל צינור וטמפרטורת החדר המודגרת למשך חמש דקות כדי לנטרל את הקולגנאז.

לאחר מכן צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1, 200 פעמים G כדי לאסוף את חלק כלי הדם הסטרומלי ככדור בארון הבטיחות הביולוגית. שאפו את הסופרנטנט מכל צינור. ודא ששכבת השמן העליונה וכל אדיפוציטים צפים נשאבים עם סופרנטנט זה.

לאחר מכן, שלב את כדורי ה-SVF לצינור צנטריפוגה אחד באמצעות 30 מיליליטר של מדיה ממוזגת וחלק באופן שווה על פני שני צינורות צנטריפוגה חדשים של 50 מיליליטר לאחר שהצנטריפוגה שואבת את הסופרנטנטים משני הכדורים. אם רוצים ליזה של RBC, ניתן להשעות כל אחד את שני הכדורים הללו ב-10 מיליליטר של מאגר ליזה RBC, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנטים כדי להניב כדורים של חלק כלי הדם הסטרומלי.

שלב את שני הכדורים הללו לצינור צנטריפוגה חדש אחד. באמצעות חמישה עד 10 מיליליטר של אמצעי בקרה, ניתן לסנן חלקיקי רקמה גדולים באמצעות מסנן רשת של 100 מיקרון המונח על גבי צינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר. כעת ציטטו את החלק המסונן המכיל את תאי הגזע השומניים על צלחות תרבית רקמה.

לאחר מכן השלם כל מנה בנפח שליטה מתאים. תרבות התקשורת. התאים במשך שלושה עד ארבעה ימים ללא שינוי מדיה שואבים את התרבית, המדיה ושוטפים את התאים פעם אחת עם PBS סטרילי כדי להסיר כל תאי דם אדומים מזהמים, ואז מחדשים את המדיה וממשיכים בתרבית בעת שימוש באנזימטי ידני זה לבידוד של חלק כלי דם סטרומלי מדגימת שאיבת ליפו בנפח גדול.

אוכלוסיית ה-SC המתורבתת המתקבלת היא הומוגנית יחסית במראה ומורכבת מתאים דמויי פיברובלסטים כאמצעי האימות הפופולרי ביותר. אינדוקציה חוץ גופית של אוכלוסיית A SC באמצעות תנאי תרבית מוגדרים, מביאה להתמיינות שלהם לשושלות מזודרמליות, אקטודרמיס ואנדודרמליות. בעוד שפוטנציאל שכבת הנבט המשולש במבחנה הביא לשימוש ב-ASCs עבור מגוון רחב של מערכות מודלים רגנרטיביים.

התמיינות לתאים אדיפוגניים, אוסטאוגניים וקונגניים מספיקה בדרך כלל כדי לזהות את ה-A SC ולאשר את עוצמתו הרב-עוצמתית. בנוסף, ASCs עשויים להיות מובחנים גם לשושלות מיוגניות מיוגניות שלד ותאים מיוגניים חלקים של השושלת האקטודרמלית או שושלת תאי הכבד האנדודרמליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד שבר כלי דם סטרומלי מליפוס.

לצורך טיורינג, זה רכיב SC.