Name: בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: למד שיטה גנטית לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G באמצעות שילוב חומצת האמינו הלא-טבעית p-azido-L-phenylalanine. השיטה מאפשרת צילום צולב ממוקד ותיוג ביואורתוגונלי לחקירת מבנה ותפקוד GPCRs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתמיכתם הנדיבה של כמה קרנות ותורמים פילנתרופיים (ראה SakmarLab.org).

1. התאגדות גנטית אתר ספציפי של חומצות אמינו לא טבעיים לGPCRs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HEK293T בDMEM (4.5 גר &#39;/ L של גלוקוז, 2 גלוטמין מ&quot;מ) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים מבוגרים כדי מפגש 60-80% בצלחת 10 ס&quot;מ באמצעות מגיב Lipofectamine פלוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל750 DMEM μl, להוסיף 10 μl פלוס מגיב, 3.5 מיקרוגרם של GPCR cDNA (pMT4. Rho או pcDNA 3.1. CCR5) המכיל את קודון עצירת הענבר במיקום רצוי, 3.5 מיקרוגרם של מדכאי tRNA cDNA (pSVB.Yam) ו0.35 מיקרוגרם של cDNA מוטנטי אמין acyl tRNA synthetase עבור p-azido-L-פנילאלנין (pcDNA.RS). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. גם לבצע transfection דומה באמצעות WT GPCR cDNA (שאינם מכיל קודון עצירת ענבר) לשמש כביקורת. להוסיף את התערובת ל750 μl של DMEM עם 17 Lipofectamine μl. לאחר equilibrating 15 דקות בטמפרטורת חדר, להביא אתנפח הכולל עד 4 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב על צלחת 10-סנטימטר, להחיל תערובת transfection לתאים, ולחזור ל37 ° C ב 5% CO 2 אווירה. אחרי 4-6 שעות, להשלים את התאים עם 4 מיליליטר DMEM המכיל FBS 20% לבין 1 מ&quot;מ azF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את תקשורת הצמיחה עם DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ&quot;מ azF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים 48 שעות שלאחר transfection, לנתח ביטוי או להמשיך לנהלי photocrosslinking או תיוג המתואר בסעיפים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר ביטוי של המוטציה ענבר GPCR בנוכחות UAA בתקשורת הצמיחה. אנו עושים זאת על ידי זיהוי immunoblot המערבי. Lyse התא גלולה ב 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ב20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 100 מ&quot;מ NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate XG 16,000 ולפתור את supernatant תחת הפחתת תנאים ידי-SDS. העברה לקרום PVDF ולבצע את ניתוח immunoblot לזהות ביטוי הקולטן באורך מלא באמצעות הדואר 1D4 מב (Cell הלאומי מרכז תרבות), אשר מזהה אפיטופ מהונדס בC-הסופית של הקולטן. ביום 31 </li></ol></li></ol> 2. מיפוי אתר קישור ליגנד שימוש Photocrosslinking ממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר transfection 48 שעות, מדיה לשאוב מהתאים ולהחליף עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט (PBS). חזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם 1x PBS ולהעביר לצינור פלקון. צנטריפוגה ב 1,500 סל&quot;ד במשך 2 דקות עד גלולה התאים ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה שבנאגרו תמיסת מלח של 1x האנק מכיל 20 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5, BSA 0.2% ויגנד tritiated בלהרוות ריכוז מחייב לאורך הנדרש של זמן וטמפרטורה על מנת להבטיח היווצרות מורכבת קולטן ליגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא לצלחת 24 גם או 96 היטב לphotoactivation של azF ב365 ננומטר (למשל להשתמש UV-מנורה) ל15 דקות ב 4 ° C. Maintain את הצלחת על קרח, כדי למנוע חימום מדגם ותמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור Eppendorf, צנטריפוגות כדי גלולה התאים, להסיר את supernatant ולהמשיך לניתוח. ניתן לאחסן את כדורים ב-20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי התא במאגר תמוגה המכילים 1% (w / v) DDM, 20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 ומעכבי פרוטאז. לאחר דגירה 1-HR ב 4 ° C, צנטריפוגה lysate התא 10 דקות ב 16,000 XG, ולהעביר את supernatant לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שרף 2B מב-sepharose 1D4 לsupernatant ו דגירה הלילה ב 4 ° C כדי immunopurify GPCR באמצעות epitope 1D4 מב C-הסופית המהונדס. למחרת לשטוף את החרוזים כמה פעמים עם חיץ תמוגה. דגימות Elute עם SDS 1% ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר חלק מeluent לבקבוקון המכיל נוזל נצנץ 15 מיליליטר ולסמוך על מונה נצנץ בטא לכמת את כמות המחייב הספציפי של ליגנד tritiated הקולט דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור את eluent מטוהר 1D4 מב שנותר על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה סטנדרטית. אנו משתמשים ב4-12% ג&#39;ל SDS-PAGE ולאחר מכן העברת חצי יבשה לקרום PVDF לimmunoblotting. אנו גם מסלול עם סולם חלבון סטנדרטי להנחות קירוב חזותי של משקל מולקולרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את קרום PVDF עם חלב 5% ב TBS חיץ המכיל 20-Tween 0.05%. לחקור את הקרום כדי לאשר ביטוי הקולטן באורך מלא עם 1D4 מב ואחרי שני נוגדנים אנטי העכבר IgG HRP-מצומדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק עם chemiluminescence המשופרת מגיב (ECL) ולחשוף את הקרום לautoradiography סרט לדמיין להקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקרום בסכין גילוח כדי להפריד בין נתיב לדוגמה, ואחריו על ידי חיתוך בסמני משקל מולקולריים ספציפיים. העבר את מקטעי קרום למבחנות המכילות נצנץ נוזל. לכמת את הכמות של טריטיום בכל מגזר קרום על ידי ספירה על דלפק בטא נצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את חיוביphotocrosslink עם זיהוי של טריטיום במסה המולקולרית לכאורה שווה לסכום של זו של GPCR ויגנד. </li></ol> 3. ממוקד Epitope תיוג ותא שטח צמוד לאנזים immunosorbent assay (ELISA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות שלאחר transfection, לשטוף תאים עם 1 מיליליטר 1x PBS וtrypsinize עם טריפסין 1 מיליליטר 0.25% במשך 3 דקות. להשלים עם 9 מיליליטר DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ&quot;מ azF. Resuspend תאים ולספור את צפיפות התאים. אנו משתמשים hemocytometer סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לטפל צלחת מחייב גבוהה, ברורה תחתון 96 היטב עם של 0.01 מ&quot;ג / פולי-D-ליזין מיליליטר לכל טוב 100 מיליליטר. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף שוב ושוב עם 1x PBS ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 200 μl של תאי transfected בצפיפות של 6 x 04-8 אוקטובר x 10 4 תאים / היטב לצלחת 96 היטב ולחזור ל37 ° C ב 5% CO 2 אווירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת להכין את התאים לתיוג. לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 100 μl / גם לא PBS 1xo להוציא מדיה מצמיחה המכילה azF. ודא תאים נשארים דבקים, למשל, באמצעות PBS המכיל Ca 2 + ו Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50-200 מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine מיקרומטר ב1x HBSS / PBS ממניות נשמרו ב5-20 מ&quot;מ ב-PBS. החל 60 מיליליטר היטב כל אחד (בשלושת עותקים עבור כל מוטציה כתומה) ולחזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 4 שעות. שמור על סט של בארות ללא טיפול תווית ב1x HBSS / PBS. כמו כן כולל שליטת GPCR WT להשוות עם גרסאות azF-GPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם 100 μl / טוב של חיץ חסימה, BB (1x PBS, BSA 0.5%), כדי להסיר את תווית unreacted לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 100 μl / טוב של paraformaldehyde 4% (שהוכן ממניות 16% ב 1x PBS) לתאים. דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף שלוש פעמים עם BB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פרוטוקול ELISA תא השטח סטנדרטי כדי לזהות קולט שכותרתו וביטוי הקולטן. דגירה עם נוגדן ראשוני ל1.5 שעות על קרח ואחרי משנייםהדגירה tibody בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של נוגדן אנטי הדגל M2 100 μl (דילול למשל 1:2,000 של נוגדנים שנעשה בBB) כדי לזהות epitope פפטיד דגל של מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine. גם לחקור בארות מטופלים שאינם תווית כביקורת שלילית. הוספה אנטי CCR5 2D7 (אנו משתמשים 1:500 דילול) נוגדן לקבוצה של בארות נפרדת כדי לקבוע WT או ביטוי פני תא azF-GPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם BB, ודגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי העכבר IgG המשני (1:2,000 דילול) 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות תאים חמש פעמים עם BB. הוסף חוצץ איתור 50 μl: Amplex אדום, 20 מ&quot;מ H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 יחס) ו דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. לאסוף נתונים ספקטרליים על קורא צלחת רב גם הקרינה באקס λ = 530 וλ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal תיוג פלורסנט של GPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse10 7 תאים שנקטפו להביע WT או azF-Rhodopsin גרסאות במאגר solubilization 1 מיליליטר המכיל 1% (w / v) DM, 50 HEPES מ&quot;מ או טריס-HCl, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 מ&quot;מ CaCl 2 ומעכבי פרוטאז ל1 שעות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב15,000 XG עבור 10 דקות ולאסוף את החלק היחסי supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl שרף 2B sepharose 1D4-מב ללכוד קולט באמצעות epitope 1D4 הסופית C המהונדס. דגירה עבור שעה 12 ב 4 ° C. שטוף את השרף שלוש פעמים עם 0.1% (w / v) DDM במאגר M 0.1 פוספט נתרן, pH 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.1 מ&quot;מ והעמסת-phosphine בנפח כולל של 0.3-0.5 מיליליטר לתייג קולט משותק על מטריצת immunoaffinity (2B sepharose 1D4-מב). דגירה של 12 שעה בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה ולהסיר supernatant. שטוף את השרף להסרת תווית unreacted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute קולט שכותרתו עם חיץ elution 100 מיליליטר מכיל 0.1% (w / v) DDM ו0.33 מ&quot;ג / מיליליטר nonapeptide (פפטיד C9 נגד אפיטופ 1D4)ב2 חיץ פוספט מ&quot;מ, pH 6.0 על ידי דגירה על קרח במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור דגימות שכותרתו ידי-SDS תחת הפחתת תנאים. שטוף ג&#39;לים לזמן קצר ב PBS ולאחר מכן לדמיין את התיוג של azF-GPCR על ידי הקרינה בג&#39;ל. לדוגמא, השתמש בסורק הקרינה confocal עם לייזר באורך גל 488 ננומטר כדי לזהות קולט שונה עם והעמסת. </li></ol>

<ol><li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors%3A+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li>
<li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+eukaryotic+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li>
<li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li>
<li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li>
<li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li>
<li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li>
<li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li>
<li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li>
<li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li>
<li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+%28GPCR%29+using+genetically+encoded+photocrosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li>
<li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li>
<li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li>
<li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escaping+the+flatlands%3A+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li>
<li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%3A+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+%C3%85+crystal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li>
<li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , submitted (2013).</li>
<li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin%3A+characterization%2C+cross-reactivity%2C+and+application+as+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li>
<li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li>
<li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+structure%2C+dynamics%2C+and+activation%3A+A+perspective+from+crystallography%2C+site-directed+spin+labeling%2C+sulfhydryl+reactivity%2C+and+disulfide+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%3B+Membrane+Proteins%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li>
<li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking%3A+use+of+a+photoactivatable+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzophenone+photophores+in+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li>
<li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N%28epsilon%29-%28o-azidobenzyloxycarbonyl%29+lysine+for+site-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

אנו מתארים כאן המתודולוגיה חזקה לשילוב באתר הספציפי של בדיקה תגובתי, azF, לGPCRs ולהדגים שלושה יישומים שימושיים של כלי זה כדי ללמוד את המבנה ודינמיקה של GPCRs. השיטה שלנו לאתר באופן ספציפי לשלב UAAs עוקפת בעיה בסיסית עם אסטרטגיה חלופית המבוססת על תיוג כימי 32, 33 או צירוף photocrosslinkers 34 למוטצית ציסטאין נגישה אחד. אמנם, תהליכים כימיים, כי יעד קבוצות תיאול ציסטאין שימשו לצרף בדיקות ניאון, אסטרטגיה כזו מחייבת את הדור של רקע חלבון ללא ציסטאין. זו יכולה להיו...

קולטנים Heptahelical G-חלבון בשילוב (GPCRs) מהווים superfamily של חלבוני קרום דינמיים מאוד שלתווך אותות תאיים חשובים ומגוונים. בפרדיגמה הקלסית, הפעלת קולטן בשילוב עם שינויי קונפורמציה יגנד-Induced. 1, 2 פיתוחים אחרונים בתחום הביולוגיה מבנית של GPCRs סיפק תובנה משמעותית על המנגנונים המולקולריים של איתות הטרנסממברני. 3-5 עם זאת, כדי להבין בדייקנות כימית גדולה יותר מנגנון תפקודי ודינמיקה מבנית של איתות GPCR, ערכת כלים של גישות נדרש לשלב בדיקות מולקולריות וכימיות אינפורמטיבי לחקור מתחמי איתות פעילים. לשם כך, מתאמנים שיטה לאתר במיוחד להציג את אי - או מינימאלי בדיקות מביכות לקולטניים ביטא מבוססות על חומצת אמינו לא טבעית mutagenesis (UAA) באמצעות ענבר קודון טכנולוגית דיכוי חלוץ העבר על ידי ג שולץ וoworkers. 6 מותאמים המתודולוגיה mutagenesis UAA כדי להשיג מערכת mutagenesis ביטוי תשואה גבוהה ולחלבונים כגון GPCRs, שקשה לבטא במערכות Heterologous ביותר אחרות מאשר בתאי יונקים. שימוש במדכאים מהונדסים מאונך tRNA והתפתח זוג synthetase aminoacyl-tRNA לUAA ספציפי, אנחנו אתר ספציפי הצגנו UAAs בGPCRs היעד לידי ביטוי. השילוב המוצלח של UAAs, p-אצטיל-L-פנילאלנין (ACF), p-בנזואיל-L-פנילאלנין (BzF), ו-p azido-L-פנילאלנין (azF) הוכח בGPCRs המודל שלנו - רודופסין ואנושי קולט chemokine CC, CCR5. 7, 8 באופן עקרוני, UAA ניתן לקודד גנטי בכל מיקום בתוך רצף החלבון ונכס זה הוא כלי רב ערך ביוכימיים כפי שהיא מאפשרת סריקה חד קודון של GPCR יעד. אנו מתמקדים כאן דווקא ברבגוניות של UAA, azF, שבה יש עזי תגובתילעשות מחצית. בנוסף משמש כבדיקה ייחודית אינפרא אדום (IR), 8, 9 azF יכול גם לשמש כמקשר צולב photoactivatable על ידי מגיב עם אמינים ראשוניים שכנים או מימני אליפטי. בנוסף, קבוצת azido אינרטי מבחינה ביולוגית יכולה להשתתף כידית כימית סלקטיבית בתגובות תיוג bioorthogonal. כאן אנו מציגים דוגמאות הממחישות את היישומים השימושיים התאגדות אתר ספציפי של azF לGPCRs, כגון photocrosslinking הממוקד למלכודת מורכבת קולטן ליגנד, ושינוי של GPCRs ידי תיוג epitope bioorthogonal ואסטרטגיות תיוג ניאון. ריאגנטים photoactivatable שימשו ללמוד מערכות ביולוגיות מאז 1960s. 10 בתקופה זו, שפע של ניסויי crosslinking הקולטן ליגנד דווח ללמוד מתחמי GPCR, שרובם כללו שימוש בligands photoaffinity. 11, 12 עם זאת, אלה יישומים טכני מוגבלים, כפי שהם requirסינתזת דואר של ligands נושאת קבוצת crosslinking. 13-15 יתר על כן, עם מחצית crosslinker ביגנד, זה מאתגר לזהות את מיקומו של Crosslink על GPCR. אתר ספציפי בהכנסת קבוצות photocrosslinking כUAAs לחלבונים באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי היא קידום יקר. 16, 17 פיתחנו טכניקת photocrosslinking לזהות את הממשק מחייב את קולטן זה מעורב בהיווצרות קומפלקס הקולטן ליגנד ב לחיות תאים על ידי החדרת קבוצות photolabile לGPCRs. 18, 19 כאן אנו מתארים את הפרוטוקול ושיטת ניתוח נתוני ניסוי ליישום טכנולוגית photocrosslinking ממוקד זה כדי לזהות את אתר הקישור של ליגנד מולקולה קטנה, maraviroc tritiated, על CCR5. שיטה זו מנצלת את הכימות המדויק של הידית רדיואקטיביים ביגנד, בנוסף לשמירה על המבנה כימי יליד יגנד. טכניקות הקרינה מבוססת לתמוך בהבנה המדויקת של הבסיס המבני של הפעלת קולטן ישירות על ידי חיטוט מדינת קונפורמציה של הקולטן. 20, 21 עם זאת, הטכניקות בעל הגמישות להציג תוויות ניאון לGPCRs אתר ספציפיות הן מוגבלות. אנו מעוניינים בהפעלת אסטרטגיות שינוי הכימי bioorthogonal כדי להקל על זיהוי מולקולה בודדת (SMD) של קומפלקסי איתות GPCR. 22 קבוצת azido יכולה להשתתף בתהליכים כימיים bioorthogonal כגון קשירת Staudinger-Bertozzi, 23, 24 אזיד-קידם מתח ללא נחושת חיי בן אשר alkyne (SpAAC) 25 וחיי בן אשר, הייתה זרז נחושת אזיד-alkyne (CuAAC). 26 אנו מתמקדים כאן בתגובת קשירת Staudinger-Bertozzi המערבת את התגובה הספציפית בין אזיד וphosphine. אנו מדגימים את השימוש בשני נגזרי phosphine שונים, מצומדת לאפיטופ פפטיד (פפטיד FLAG) או תווית ניאון(העמסה) כדי להשיג שינוי ספציפי לאתר של GPCRs. אנו מותאמים בעבר התנאים לתיוג ספציפי לאתר של rhodopsin azF גרסאות באמצעות המבנה הגבישי רנטגן וסימולציות דינמיות לבחור אתרי יעד שהם ממס חשוף. 27, 28 אנחנו גם איירנו את ההיתכנות להשגת תיוג ללא רקע בStaudinger- קשירת Bertozzi. 29 אנו מדגימים כאן הנוהל הכללי המועסק על מנת להשיג ניאון תיוג של קולט חומר ניקוי, solubilized כי הוא משותק על מטריצת immunoaffinity ולאחר מכן דמיינו ידי הקרינה בג&#39;ל. בנוסף, אנו מדגימים הארכה שימושית על אסטרטגית תיוג זה כדי לזהות עמדות נוחות לתיוג על הקולטן של מבנה ידוע, CCR5. זו מתבצעת באמצעות אסטרטגית תיוג פפטיד epitope ממוקדת המסתמכת על שינוי bioorthogonal של azF-GPCR גרסאות בפורמט חצי תפוקה גבוהה מבוסס תאים. 30 זהשיטה מנצלת את תכונות זיהוי רב שלבים של ELISA על פני קרום תא כדי לפקח על אירועי תיוג. מתודולוגיות אנו דנים כאן הן כלליות ועקרוניים יכולות להיות מיושמות על כל GPCR משולב עם azF באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. בפרוטוקולים שהוצגו כאן פירוט אנו השלבים כרוכים בביטוי תאים היונקים של קולטנים משולבים עם UAAs כגון azF בשיטה טבעית חומצת אמינו mutagenesis והיישומים הבאים שלהם כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של GPCRs.

<table><tbody><tr><td>פלסמיד pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>pcDNA.RS פלסמיד עבור azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>פלסמידים pMT4.Rho ו-pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>אופציונלי להכיל את קודון העצירה הענבר (TAG) במיקום הרצוי</td></tr><tr><td>תאי</td><td></td><td></td> HEK 293T <td>תאים דבקים</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ תמיסת מלח</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ג'מיני ביו-פרודקטס</td><td>100-106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ליפופקטמין פלוס</td><td>אינוויטרוגן</td><td>ליפופקטמין: 18324-012 פלוס: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanine</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>טבלה 1.</חזק> שילוב גנטי ספציפי לאתר של חומצות אמינו לא טבעיות בחומרי GPCRs</td></tr><tr><td>מנורת UV-A Maxima ML-3500S</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF מופעלת על ידי אור 365 ננומטר</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת של האנק (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>אירווין סיינטיפיק</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>ליגנד <td></td><td></td><td>עם תווית טריטיום</td><td>ממשתף פעולה (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>שרף <td></td><td></td><td>1D4-sepharose</td><td>1D4 mAb משותק על ספרוז המופעל על ידי CNBr שרף 2B</td></tr><tr><td>1% (w/v) נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% ג'ל SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE בוצע על מכשיר NuPAGE</td></tr><tr><td>מכשיר Trans-Blot SD</td><td>Biorad</td><td></td><td>מכשיר להעברה חצי יבשה</td></tr><tr><td>ממברנת אימובילון פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חלב ללא שומן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>אולדריץ'</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>בקבוקוני נוזל נצנוץ</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid נצנוץ נגד</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Beta-Scintillation</td></tr><tr><td>counter Anti-rhodopsin 1D4 mAb</td><td>National Cell Culture Center</td><td>מותאם אישית</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומד נגד עכבר IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico מצע כימילומינסנט</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרט Hyblot CL AR דנוויל</td><td></td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>טבלה 2.</חזק> חומרים פוטו-צולבים ממוקדים</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין</td><td>אינוויטרוגן</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דגל-טריארילפוספין</td><td>סיגמא</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דגל M2</td><td>סיגמא</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>תחתית שקופה,</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת EIA/RIA פוספט (סידן, מגנזיום)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KPL, Inc</td>. <td>מצומד HRP</td>.<td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>DE מוצרי בריאות</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קורא צלחות פלואורסצנטי CytoFluor II רב בארות</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>טבלה 3.</חזק> תיוג פפטיד-אפיטופ ממוקד וחומרי ELISA על פני התא</td>פלואורסצאין-פוספין</tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>(Huber et al., הוגש ב-2012)</td></tr><tr><td>Nonapeptide (C9 peptide)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>פפטיד המחקה את 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>שרף <td></td><td></td><td>1D4-sepharose</td><td>1D4 mAb משותק על ספרוז המופעל על ידי CNBr שרף 2B</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% ג'ל SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE בוצע על מכשיר NuPAGE</td></tr><tr><td>סורק פלואורסצנטי קונפוקלי טייפון 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>הופסק</td><td>סורק עם לייזר באורך גל של 488 ננומטר</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><חזק>טבלה 4. חומרי תיוג </חזקים>פלואורסצנטיים</td></tr></tbody></table>

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון g

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קולטן מצמידים חלבון G (GPCR) איתות מתחמים, גישות חדשות נדרשות להציג בדיקות או תוויות אינפורמטיבי לקולטניים ביטא שלא להפריע פונקצית קולטן. אנחנו השתמשנו בטכנולוגית דיכוי קודון ענבר גנטי לקודד חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין (azF) בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs הביעה heterologously בתאי יונקים. הרבגוניות של קבוצת azido מודגמת כאן ביישומים שונים כדי ללמוד GPCRs בסביבה התאית האם שלהם או בתנאי solubilized חומרי ניקוי. ראשית, אנו מדגימים מבוסס תאי טכנולוגית photocrosslinking ממוקד כדי לזהות את השאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR בי יגנד מולקולה הקטנה שכותרתו טריטיום הוא crosslinked לחומצת אמינו azido גנטי מקודדת. לאחר מכן, אנו מדגימים שינוי ספציפי לאתר של GPCRs ידי reac קשירת Staudinger-Bertozzi bioorthogonaltion כי מטרות קבוצת azido באמצעות נגזרי phosphine. אנחנו דנים באסטרטגיה כללית לתיוג פפטיד epitope הממוקד של החלבונים בממברנה באו לידי ביטוי בתרבות ובזיהוי שלה באמצעות גישת ELISA המבוססת על כל התא. לבסוף, אנו מראים כי azF-GPCRs יכולה להיות מתויגת באופן סלקטיבי עם בדיקות ניאון. מתודולוגיות שנדונו הן כלליות, בכך שהם יכולים באופן עקרוני להיות מיושמים על כל עמדת חומצת אמינו בכל ביטוי GPCR לחקור מתחמי איתות פעילים.

אנחנו מועסקים על המתודולוגיה mutagenesis חומצת אמינו לא טבעית לאתר באופן ספציפי, להציג את הבדיקות מולקולריות לGPCR באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. ערכה באיור 1 מתארת ​​את הצעדים הבולטים של המתודולוגיה ויישומים השונים של שילוב UAA תכליתי, p-azido-L-פנילאלנין (azF), לGPCRs. ביטוי של azF-GPCRs בתאי יונקים מאפשר ממוקד photocrosslinking לליגנד, וממוקד תיוג פפטיד epitope או שינויי ניאון של GPCR באמצעות תהליכים כימיים תיוג bioorthogonal. <p cla...

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להחדיר גשש (probe) אינפורמטיבי בודד אל קולטנים המצומדים לחלבון G (G-Protein coupled receptors) כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קומפלקסים של סיגנלינג. דבר זה מושג על ידי טרנספקציה של תאים עם הפלסמידים הדרושים לביטוי המכניקה התרגומית הנחוצה לשילוב החומצת האמינו הלא-טבעית zeto, phenylalanine, או zeto fee בתוך GPCR מבוטא. ניתן לאחר מכן להשתמש בגרסת ה-zeto fee של ה-GPCR בשלושה אופנים שונים כדי לחקור את המבנה ואת התפקוד של הקולטן.ראשית, ה-zeto fee משמש כקשר צולב (crosslinker) המופעל על ידי אור ב-GPCR, מה שמאפשר זיהוי של אתר הקישור של ליגנד טריטיומי. לאחר מכן, ניתן להשתמש ב-zeto fee כידית כימית ריאקטיבית על מנת להצמיד פרובה פלואורסצנטית או פפטיד מצומד ל-GPCR באמצעות כימיה של סימון ביו-אורתוגונלי; התוצאות המתקבלות מראות כי שימוש בפרובה המולקולרית zeto fee מאפשר קישור צולב פוטו-מכוון, תיוג אפיתופ מכוון וסימון פלואורסצנטי של GPCRs, בהתבסס על שיטות ביוכימיות ובתאי חיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בליגנדים בעלי זיקה פוטו-כימית או סימון ציסטאין, הוא הגמישות להחדרה ספציפית לאתר של חומצת אמינו לא טבעית, P zeto phenol alanine, שהיא ריאקטיבית ואינרטית ביולוגית, במיקום ידוע ברצפטור המטרה.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השליחויות של GPCR, כולל מיפוי אתרי האינטראקציה בקומפלקס רצפטור-ליגנד בסביבת הממברנה הטבעית, והקלה על מחקרי פלואורסצנציה של מולקולה בודדת על ידי זיהוי מיקומים ב-GPCR המתאימים לסימון ביו-অর্থוגונלי. שלישית, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המנגנון המולקולרי של רצפטורים המצומדים לחלבון G, וניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון מגוון חלבונים תאיים וממברנליים. לפני תחילת ניסוי זה, יש לתחזק תאי HEC 293T בתווך KO's modified eagle medium, בתוספת 10% fetal bovine serum בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5% CO2.בצע טרנספקציה לתאים במידת התכנסות (confluence) של 60 עד 80% בצלحية של 10 סנטימטרים עם G pcr, r CD, NA באמצעות ריאגנט lipectomy plus כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. למחרת, החלף את מצע הגידול ב-DMEM המכיל 10% FBS ו-0.5 millimolar fee. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נתח את הביטוי כפי שמתואר בטקסט.המשיכו לנהלי הצילום, הקישור הצולב (cross linking) או הסימון כפי שמתואר בהמשך סרטון זה. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, שאבו את המצע מהתאים והחליפו אותו בארבעה מיליליטרים של phosphate buffered saline בריכוז 1x או PBS; החזירו ל-37 °C למשך 15 דקות כדי שהתאים יתנתקו מהפלטה. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים ב-1x PBS והעבירו למבחנה מסוג Falcon; צנטריפוגו במהירות של 1500 RPM למשך שתי דקות.כדי לשקע את התאים, שאבו את העל-נוזל (supernatant) לפני השעייה מחדש של משקע התאים בתוך תמיסת Hanks buffered salt solution בריכוז 1x, המכילה את הליגנד המסומן בטריטיום בריכוז קשירה רווי, שהוכנה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. דגרו את המשקע בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הנדרש כדי להבטיח היווצרות של קומפלקס רצפטור-ליגנד, התלוי ברצפטור ובליגנד הספציפיים. לאחר מכן, העבירו את תרחף התאים לפלטה בעלת 24 או 96 בארות.לאחר מכן, בצעו פוטו-אקטיבציה של ה-zeto fee באמצעות מנורת ultraviolet באורך גל של 365 nanometers למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, תוך שמירה על הפלטה על קרח כדי למנוע חימום של הדגימה וליזיס של התאים. לאחר הפוטו-אקטיבציה, העבירו את התאים למסורת einor וסובבו במסנטריפוגה כדי להשקיע את התאים. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והמשיכו לאנליזה.שחזר את משקע התאים בבופר ליזיס, והדגר את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סבב במרכזית את ליזאט התאים למשך 10 דקות ב-16,000 ×g. לפני העברת הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה, הוסף לנוזל העליון SROs modified 1D four monoclonal antibody two B resin והדגר למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C כדי לטהר אימונולוגית את ה-GPCR באמצעות האפיטופ של הנוגדן החד-שכבתי 1D four המוהנדס בקצה הקרבוקסילי (C-terminus). למחרת, שטוף את החרוזיים מספר פעמים עם בופר ליזיס. אלוט את הדגימות עם 1% SDS בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת תוך써 ניעור.העבר חלק מה-EENT למבחנה של 15 מיליליטר המכילה נוזל סינטינציה, ומדוד במונה סינטינציית בטא כדי לכמת את כמות הקישור הספציפי של הליגנד המסומן בטריטיום לקולטן. הפר את ה-EENT המטוהר שנותר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל סטנדרטית תוך שימוש בג'ל SDS בריכוז של 4% עד 12% עם סולם חלבונים סטנדרטי. לאחר מכן, בצע העברה חצי-יבשה לממברנת A-P-V-D-F לצורך אימונו-בלוטינג.חסמו את ממбраסת ה-PVDF באמצעות 5% חלב בבופר TBS המכיל 0.05% Tween 20. בדקו את הממברסה כדי לאשר ביטוי של הרצפטור באורכו המלא באמצעות נוגדן חד-שבטי 1D, ולאחר מכן השתמשו בנוגדן משני anti-US IgG המשורשר ל-HRP. לאחר מכן, טפלו בממברסה באמצעות ריאגנט כימילומינצנציה מוגבר.חשפו את הממברנה לסרט אוטו-רדיוגרפיה כדי להמיס את הפסים. לאחר מכן, חתכו את הממברנה בעזרת להב תער כדי להפריד בין נתיבי הדגימות, וחתכו בנקודות של סמני משקל מולקולרי ספציפיים. העבירו את מקטעי הממברנה למבחנות המכילות נוזל סינטילציה, וכמותו את כמות ה-tritium בכל מקטע ממברנה באמצעות ספירה במונה סינטילציית בטא.זהו את קשרי הצילום (photo cross link) החיוביים באמצעות זיהוי טריטיום במסה מולקולרית נראית השווה לסכום ה-GPCR והליגנד. לאחר שטיפה וספירת תאים, הכשיר פלטת 96 בארות בעלת קישור גבוה ותחתית שקופה באמצעות 100 µL של 10 µg/mL Poly D lycine לכל בארה; הדגרה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שטפו שוב ושוב עם 1XPBS, ולפני ההשארה לייבוש באוויר, זרעו את התאים שעברו טרנספקציה בנפח של 200 µL ובצפיפות של 60 עד 80,000 תאים לבאר, בתוך פלטת 96 בארות, והחזירו לטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5%CO2. למחרת.הכינו את התאים לסימון. שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים עם 100 µL לבאר באמצעות XPBS כדי להסיר שאריות של מצע גידול המכיל zeto fee. הכינו תמיסת באפר המכילה 50 עד 200 µM של רכיב הסימון flag Tri AAL PHOSPHINE כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.העבירו 60 µL לכל באער. שמרו על קבוצה של באערים ללא טיפול בתווית ובבופר. כללו גם בקרת GPCR מסוג wild type לצורך השוואה עם וריאנט של GPCR המוזן בזטו (zeto).החזירו את הפלטה לטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות עד ארבע שעות לאחר ההדגרה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 µL לבאר של תמיסת חסימה (blocking buffer) כדי להסיר לחלוטין את הסימון הבלתי פעיל. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 100 µL לבאר של 4% paraform aldehyde והדגריו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיצת חסימה (blocking buffer). בצעו פרוטוקול EISA סטנדרטי לפני שטח התא כדי לזהות את הרצפטור המסומן ואת ביטוי הרצפטור, ראשית על ידי דגירה עם נוגדן ראשוני למשך 1.5 שעות על קרח. לאחר מכן, בצעו דגירה עם נוגדן שני בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.בשלב הבא, הוסף 100 µL של נוגדן Anti-Flag M two מדולל כדי לזהות את האפיטופ של פפטיד ה-flag של ריאגנט סימון ה-flag. Tri AAL phosphine. כמו כן, בדוק בארות שלא עברו סימון כביקורת שלילית.לאחר מכן, הוסיפו נוגדן anti CCR5 2D7 מדולל לסדרות נפרדות של בארות כדי לקבוע את ביטוי CCR5 על פני השטח של תאי GPCR מסוג wild type או zeto fee. שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיסת חסימה (blocking buffer) והדגירו אותם עם 100 µL של נוגדן anti-US IgG מדולל המשוער ל-HRP.לאחר שטיפה קפדנית של התאים חמש פעמים עם באפר חסימה (blocking buffer), יש להוסיף 50 µL של באפר גילוי ולהדגיר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, יש לאסוף נתונים ספקטרליים באמצעות קורא לוחיות רב-בארים פלואורסצנטי באורך גל עירור של 530 nm ובאורך גל פליטה של 590 nm. התחילו את הליך הסימון על ידי ליזיס של 10 מיליון תאים שנאספו המבטאים wild type או zeto fee.דגיין של רוד-אופסין (Rod opsin) במיליליטר אחד של בופר להמסה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C. אסוף את פראקציית העל למשך סבב צנטריפוגציה של ליזאט התאים ב-15,000 ×g למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 µL של שרף 1D4 monoclonal antibody modified spheros 2B כדי ללכוד את הרצפטור באמצעות האפיטופ 1D4 המהונדס בקצה ה-C.לאחר דגירה במשך 12 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שטפו את שרף המטריצה שלוש פעמים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, סמנו את הרצפטור המקובע על מטריצת האפיניות האימונולוגית על ידי הוספת 0.1 millimolar fluorescein phosphine לנפח כולל של 0.3 עד 0.5 milliliters; דגרו במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר לפני הסנטריפוגה, לאחר הסרת הנוזל העליון. שטפו את שרף המטריצה כדי להסיר כל סימון שאינו פעיל, ואלוטו את הרצפטור המסומן בעזרת 100 microliters של Elian buffer על ידי דגירה על קרח למשך שעה אחת.הפרד את הדגימות המסומנות באמצעות SDS-PAGE בתנאים מחזרים. שטוף את הגלים קצרות ב-PBS לפני סימון של zeto fee. GPCR באמצעות פלואורסצנציית Ingel תוך שימוש בסורק פלואורסצנציה קונפוקאלי עם לייזר באורך גל של 488 nanometer כדי לזהות רצפטור ששונה באמצעות פלואורסצאין.מתודולוגיית מוטגנזה של חומצות אמינו לא טבעיות שימשה להחדרה ספציפית של גששים מולקולריים לאתר C ב-A-G-P-C-R באמצעות טכנולוגיית דיכוי קודון amber. לאחר מכן, ניתן להשתמש בטכניקת קישור צולב פוטו-כימי (photo cross-linking) כדי לחקור את ההיבטים המבניים של קומפלקסים של ליגנדים ב-GPCR בתאים חיים; ליגנד של מולקולה קטנה המסומן רדיואקטיבית בטריטיום שימש לזיהוי אתר הקישור שלו ב-G-P-C-R-C-C-R five.בדוגמה זו, הקרנת UV על תאים המבטאים zeto fee. CCR five variance שעברו דגירה מוקדמת עם Ravi מסומן בטריטיום, גורמת להיווצרות קומפלקסים מקושרים קוולנטית שניתן לזהות באמצעות התג הרדיואקטיבי הרגיש שעל הליגנד.מבין מספר העמדות ב-CCR5, נבדקו lucine 28 zeto fee ו-tryptophan 86 zeto fee, אשר היו מסוגלים לבצע צליבה פוטוכימית (photo crosslink) ל-tritiated Ravi Rock, כפי שמתואר בספירות סינטיליציה גבוהות משמעותית. הרצפטור מסוג הפרא (wild type) לא הראה צליבה לליגנד הרדיואקטיבי. ניתן להשתמש בכימיה של סימון ביו-אורתוגונלי כדי לבצע מודיפיקציה ספציפית לאתר C של zeto feed.אסטרטגיה אחת לשינוי GPCR כוללת סימון ממוקד של אפיתופים של A-G-P-C-R בתאים חיים באמצעות תגית פפטיד מצומדת, פפטיד flag. ריאגנט סימון Tri AAL PHOSPHINE משמש לשינוי ספציפי וסלקטיבי של zeto fee. שינוי CCR five המוצג כאן הוא נתון מייצג מאסטרטגיית זיהוי EISA רגישה ורב-שלבית המשמשת לזיהוי מיקומים המסומנים בפפטיד flag.מבין העמדות ב-CCR5 נבדקו כל מוטציות ה-zeto. וריאנטים של CCR5 בוטאו על פני השטח של התא, וכמחצית מהם עברו בהצלחה תיוג ממוקד של אפיתופים. CCR5 מסוג wild type שימש כביקורת שלילית לתיוג האפיתופים, כפי שהודגם על ידי היעדר אות Anti-Flag. באסטרטגיה חלופית, PCRs של zeto feed G מומסים בדטרגנט הוקבעו על מטריצת אימונו-אפיניות, כגון נוגדן מונוקלונלי anti 1D four המצומד לשרף Spheros two B, ותויגו בעזרת תוית fluoro four מצומדת.תמונת הפלואורסצנציה של Ingel מדגימה סימון פלואורסצנטי מוצלח של ה-GPCR opsin בשלושה מיקומים שונים כמצופה; ה-opsin מסוג הטיפוס הפראי (wild type) לא הראה סימון רקע, כפי שעולה מהיעדרו של פס פלואורסצנטי במשקל המולקולרי הצפוי של הרצפטור. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאשר את הביטוי המלא בעדשה של ה-GPCR מטרה באמצעות חומצה AOL Alanine ספציפית שהוכנסה. לאחר פיתוחה.טכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של רצפטורים לחקור כל קומפלקס של רצפטור וליגנד או לסמן רצפטור מטרה. זאת באמצעות שימוש בחומצת אמינו לא טבעית שהוכנסה לאתר ספציפי, p zeto phenol alanine, כגשש ריאקטיבי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בניאוגנזה של חומצות אמי노 לא טבעיות כדי להחדיר גשש מולקולרי ל-A-G-P-C-R, במטרה להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קומפלקסים של איתות GPCR באמצעות טכניקות של צמירה מצולבת פוטו-מכוונת וסימון ביו-אורתוגונלי.

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

שיטות פשוטות לזיהוי הפעלה סלקטיבית של חלבוני G על ידי קולטנים מצומדים לחלבון G נותרו אתגר יוצא דופן באיתות תאים. כאן, חיישנים ביולוגיים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) של Fӧrster פותחו על ידי קשירה זוגית של פפטידי חלבון GPCR ל-G כדי לחקור שינויים קונפורמטיביים בריכוזים מבוקרים בתאים חיים.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי BRET למדידה בזמן אמת של הפעלת חלבון G בתאי HEK293 חיים על גירוי ליגנד קולטן מצומד לחלבון G. כאן, קולטן β2-אדרנרגי וקולטן קנבינואיד מסוג 1 משמשים כדוגמאות להדגמת היעילות של חיישנים עבור מספר תת-סוגים של חלבון G ועל פני GPCRs שונים.

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

למד שיטה גנטית לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G באמצעות שילוב חומצת האמינו הלא-טבעית p-azido-L-phenylalanine. השיטה מאפשרת צילום צולב ממוקד ותיוג ביואורתוגונלי לחקירת מבנה ותפקוד GPCRs.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

גלה סרטונים נוספים