בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להחדיר גשש (probe) אינפורמטיבי בודד אל קולטנים המצומדים לחלבון G (G-Protein coupled receptors) כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קומפלקסים של סיגנלינג. דבר זה מושג על ידי טרנספקציה של תאים עם הפלסמידים הדרושים לביטוי המכניקה התרגומית הנחוצה לשילוב החומצת האמינו הלא-טבעית zeto, phenylalanine, או zeto fee בתוך GPCR מבוטא. ניתן לאחר מכן להשתמש בגרסת ה-zeto fee של ה-GPCR בשלושה אופנים שונים כדי לחקור את המבנה ואת התפקוד של הקולטן.

ראשית, ה-zeto fee משמש כקשר צולב (crosslinker) המופעל על ידי אור ב-GPCR, מה שמאפשר זיהוי של אתר הקישור של ליגנד טריטיומי. לאחר מכן, ניתן להשתמש ב-zeto fee כידית כימית ריאקטיבית על מנת להצמיד פרובה פלואורסצנטית או פפטיד מצומד ל-GPCR באמצעות כימיה של סימון ביו-אורתוגונלי; התוצאות המתקבלות מראות כי שימוש בפרובה המולקולרית zeto fee מאפשר קישור צולב פוטו-מכוון, תיוג אפיתופ מכוון וסימון פלואורסצנטי של GPCRs, בהתבסס על שיטות ביוכימיות ובתאי חיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בליגנדים בעלי זיקה פוטו-כימית או סימון ציסטאין, הוא הגמישות להחדרה ספציפית לאתר של חומצת אמינו לא טבעית, P zeto phenol alanine, שהיא ריאקטיבית ואינרטית ביולוגית, במיקום ידוע ברצפטור המטרה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השליחויות של GPCR, כולל מיפוי אתרי האינטראקציה בקומפלקס רצפטור-ליגנד בסביבת הממברנה הטבעית, והקלה על מחקרי פלואורסצנציה של מולקולה בודדת על ידי זיהוי מיקומים ב-GPCR המתאימים לסימון ביו-অর্থוגונלי. שלישית, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המנגנון המולקולרי של רצפטורים המצומדים לחלבון G, וניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון מגוון חלבונים תאיים וממברנליים. לפני תחילת ניסוי זה, יש לתחזק תאי HEC 293T בתווך KO's modified eagle medium, בתוספת 10% fetal bovine serum בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5% CO2.

בצע טרנספקציה לתאים במידת התכנסות (confluence) של 60 עד 80% בצלحية של 10 סנטימטרים עם G pcr, r CD, NA באמצעות ריאגנט lipectomy plus כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. למחרת, החלף את מצע הגידול ב-DMEM המכיל 10% FBS ו-0.5 millimolar fee. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נתח את הביטוי כפי שמתואר בטקסט.

המשיכו לנהלי הצילום, הקישור הצולב (cross linking) או הסימון כפי שמתואר בהמשך סרטון זה. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, שאבו את המצע מהתאים והחליפו אותו בארבעה מיליליטרים של phosphate buffered saline בריכוז 1x או PBS; החזירו ל-37 °C למשך 15 דקות כדי שהתאים יתנתקו מהפלטה. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים ב-1x PBS והעבירו למבחנה מסוג Falcon; צנטריפוגו במהירות של 1500 RPM למשך שתי דקות.

כדי לשקע את התאים, שאבו את העל-נוזל (supernatant) לפני השעייה מחדש של משקע התאים בתוך תמיסת Hanks buffered salt solution בריכוז 1x, המכילה את הליגנד המסומן בטריטיום בריכוז קשירה רווי, שהוכנה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. דגרו את המשקע בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הנדרש כדי להבטיח היווצרות של קומפלקס רצפטור-ליגנד, התלוי ברצפטור ובליגנד הספציפיים. לאחר מכן, העבירו את תרחף התאים לפלטה בעלת 24 או 96 בארות.

לאחר מכן, בצעו פוטו-אקטיבציה של ה-zeto fee באמצעות מנורת ultraviolet באורך גל של 365 nanometers למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, תוך שמירה על הפלטה על קרח כדי למנוע חימום של הדגימה וליזיס של התאים. לאחר הפוטו-אקטיבציה, העבירו את התאים למסורת einor וסובבו במסנטריפוגה כדי להשקיע את התאים. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והמשיכו לאנליזה.

שחזר את משקע התאים בבופר ליזיס, והדגר את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סבב במרכזית את ליזאט התאים למשך 10 דקות ב-16,000 ×g. לפני העברת הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה, הוסף לנוזל העליון SROs modified 1D four monoclonal antibody two B resin והדגר למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C כדי לטהר אימונולוגית את ה-GPCR באמצעות האפיטופ של הנוגדן החד-שכבתי 1D four המוהנדס בקצה הקרבוקסילי (C-terminus). למחרת, שטוף את החרוזיים מספר פעמים עם בופר ליזיס. אלוט את הדגימות עם 1% SDS בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת תוך써 ניעור.

העבר חלק מה-EENT למבחנה של 15 מיליליטר המכילה נוזל סינטינציה, ומדוד במונה סינטינציית בטא כדי לכמת את כמות הקישור הספציפי של הליגנד המסומן בטריטיום לקולטן. הפר את ה-EENT המטוהר שנותר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל סטנדרטית תוך שימוש בג'ל SDS בריכוז של 4% עד 12% עם סולם חלבונים סטנדרטי. לאחר מכן, בצע העברה חצי-יבשה לממברנת A-P-V-D-F לצורך אימונו-בלוטינג.

חסמו את ממбраסת ה-PVDF באמצעות 5% חלב בבופר TBS המכיל 0.05% Tween 20. בדקו את הממברסה כדי לאשר ביטוי של הרצפטור באורכו המלא באמצעות נוגדן חד-שבטי 1D, ולאחר מכן השתמשו בנוגדן משני anti-US IgG המשורשר ל-HRP. לאחר מכן, טפלו בממברסה באמצעות ריאגנט כימילומינצנציה מוגבר.

חשפו את הממברנה לסרט אוטו-רדיוגרפיה כדי להמיס את הפסים. לאחר מכן, חתכו את הממברנה בעזרת להב תער כדי להפריד בין נתיבי הדגימות, וחתכו בנקודות של סמני משקל מולקולרי ספציפיים. העבירו את מקטעי הממברנה למבחנות המכילות נוזל סינטילציה, וכמותו את כמות ה-tritium בכל מקטע ממברנה באמצעות ספירה במונה סינטילציית בטא.

זהו את קשרי הצילום (photo cross link) החיוביים באמצעות זיהוי טריטיום במסה מולקולרית נראית השווה לסכום ה-GPCR והליגנד. לאחר שטיפה וספירת תאים, הכשיר פלטת 96 בארות בעלת קישור גבוה ותחתית שקופה באמצעות 100 µL של 10 µg/mL Poly D lycine לכל בארה; הדגרה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו שוב ושוב עם 1XPBS, ולפני ההשארה לייבוש באוויר, זרעו את התאים שעברו טרנספקציה בנפח של 200 µL ובצפיפות של 60 עד 80,000 תאים לבאר, בתוך פלטת 96 בארות, והחזירו לטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5%CO2. למחרת.

הכינו את התאים לסימון. שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים עם 100 µL לבאר באמצעות XPBS כדי להסיר שאריות של מצע גידול המכיל zeto fee. הכינו תמיסת באפר המכילה 50 עד 200 µM של רכיב הסימון flag Tri AAL PHOSPHINE כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.

העבירו 60 µL לכל באער. שמרו על קבוצה של באערים ללא טיפול בתווית ובבופר. כללו גם בקרת GPCR מסוג wild type לצורך השוואה עם וריאנט של GPCR המוזן בזטו (zeto).

החזירו את הפלטה לטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות עד ארבע שעות לאחר ההדגרה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 µL לבאר של תמיסת חסימה (blocking buffer) כדי להסיר לחלוטין את הסימון הבלתי פעיל. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 100 µL לבאר של 4% paraform aldehyde והדגריו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיצת חסימה (blocking buffer). בצעו פרוטוקול EISA סטנדרטי לפני שטח התא כדי לזהות את הרצפטור המסומן ואת ביטוי הרצפטור, ראשית על ידי דגירה עם נוגדן ראשוני למשך 1.5 שעות על קרח. לאחר מכן, בצעו דגירה עם נוגדן שני בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

בשלב הבא, הוסף 100 µL של נוגדן Anti-Flag M two מדולל כדי לזהות את האפיטופ של פפטיד ה-flag של ריאגנט סימון ה-flag. Tri AAL phosphine. כמו כן, בדוק בארות שלא עברו סימון כביקורת שלילית.

לאחר מכן, הוסיפו נוגדן anti CCR5 2D7 מדולל לסדרות נפרדות של בארות כדי לקבוע את ביטוי CCR5 על פני השטח של תאי GPCR מסוג wild type או zeto fee. שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיסת חסימה (blocking buffer) והדגירו אותם עם 100 µL של נוגדן anti-US IgG מדולל המשוער ל-HRP.

לאחר שטיפה קפדנית של התאים חמש פעמים עם באפר חסימה (blocking buffer), יש להוסיף 50 µL של באפר גילוי ולהדגיר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, יש לאסוף נתונים ספקטרליים באמצעות קורא לוחיות רב-בארים פלואורסצנטי באורך גל עירור של 530 nm ובאורך גל פליטה של 590 nm. התחילו את הליך הסימון על ידי ליזיס של 10 מיליון תאים שנאספו המבטאים wild type או zeto fee.

דגיין של רוד-אופסין (Rod opsin) במיליליטר אחד של בופר להמסה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C. אסוף את פראקציית העל למשך סבב צנטריפוגציה של ליזאט התאים ב-15,000 ×g למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 µL של שרף 1D4 monoclonal antibody modified spheros 2B כדי ללכוד את הרצפטור באמצעות האפיטופ 1D4 המהונדס בקצה ה-C.

לאחר דגירה במשך 12 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שטפו את שרף המטריצה שלוש פעמים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, סמנו את הרצפטור המקובע על מטריצת האפיניות האימונולוגית על ידי הוספת 0.1 millimolar fluorescein phosphine לנפח כולל של 0.3 עד 0.5 milliliters; דגרו במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר לפני הסנטריפוגה, לאחר הסרת הנוזל העליון. שטפו את שרף המטריצה כדי להסיר כל סימון שאינו פעיל, ואלוטו את הרצפטור המסומן בעזרת 100 microliters של Elian buffer על ידי דגירה על קרח למשך שעה אחת.

הפרד את הדגימות המסומנות באמצעות SDS-PAGE בתנאים מחזרים. שטוף את הגלים קצרות ב-PBS לפני סימון של zeto fee. GPCR באמצעות פלואורסצנציית Ingel תוך שימוש בסורק פלואורסצנציה קונפוקאלי עם לייזר באורך גל של 488 nanometer כדי לזהות רצפטור ששונה באמצעות פלואורסצאין.

מתודולוגיית מוטגנזה של חומצות אמינו לא טבעיות שימשה להחדרה ספציפית של גששים מולקולריים לאתר C ב-A-G-P-C-R באמצעות טכנולוגיית דיכוי קודון amber. לאחר מכן, ניתן להשתמש בטכניקת קישור צולב פוטו-כימי (photo cross-linking) כדי לחקור את ההיבטים המבניים של קומפלקסים של ליגנדים ב-GPCR בתאים חיים; ליגנד של מולקולה קטנה המסומן רדיואקטיבית בטריטיום שימש לזיהוי אתר הקישור שלו ב-G-P-C-R-C-C-R five.

בדוגמה זו, הקרנת UV על תאים המבטאים zeto fee. CCR five variance שעברו דגירה מוקדמת עם Ravi מסומן בטריטיום, גורמת להיווצרות קומפלקסים מקושרים קוולנטית שניתן לזהות באמצעות התג הרדיואקטיבי הרגיש שעל הליגנד.

מבין מספר העמדות ב-CCR5, נבדקו lucine 28 zeto fee ו-tryptophan 86 zeto fee, אשר היו מסוגלים לבצע צליבה פוטוכימית (photo crosslink) ל-tritiated Ravi Rock, כפי שמתואר בספירות סינטיליציה גבוהות משמעותית. הרצפטור מסוג הפרא (wild type) לא הראה צליבה לליגנד הרדיואקטיבי. ניתן להשתמש בכימיה של סימון ביו-אורתוגונלי כדי לבצע מודיפיקציה ספציפית לאתר C של zeto feed.

אסטרטגיה אחת לשינוי GPCR כוללת סימון ממוקד של אפיתופים של A-G-P-C-R בתאים חיים באמצעות תגית פפטיד מצומדת, פפטיד flag. ריאגנט סימון Tri AAL PHOSPHINE משמש לשינוי ספציפי וסלקטיבי של zeto fee. שינוי CCR five המוצג כאן הוא נתון מייצג מאסטרטגיית זיהוי EISA רגישה ורב-שלבית המשמשת לזיהוי מיקומים המסומנים בפפטיד flag.

מבין העמדות ב-CCR5 נבדקו כל מוטציות ה-zeto. וריאנטים של CCR5 בוטאו על פני השטח של התא, וכמחצית מהם עברו בהצלחה תיוג ממוקד של אפיתופים. CCR5 מסוג wild type שימש כביקורת שלילית לתיוג האפיתופים, כפי שהודגם על ידי היעדר אות Anti-Flag. באסטרטגיה חלופית, PCRs של zeto feed G מומסים בדטרגנט הוקבעו על מטריצת אימונו-אפיניות, כגון נוגדן מונוקלונלי anti 1D four המצומד לשרף Spheros two B, ותויגו בעזרת תוית fluoro four מצומדת.

תמונת הפלואורסצנציה של Ingel מדגימה סימון פלואורסצנטי מוצלח של ה-GPCR opsin בשלושה מיקומים שונים כמצופה; ה-opsin מסוג הטיפוס הפראי (wild type) לא הראה סימון רקע, כפי שעולה מהיעדרו של פס פלואורסצנטי במשקל המולקולרי הצפוי של הרצפטור. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאשר את הביטוי המלא בעדשה של ה-GPCR מטרה באמצעות חומצה AOL Alanine ספציפית שהוכנסה. לאחר פיתוחה.

טכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של רצפטורים לחקור כל קומפלקס של רצפטור וליגנד או לסמן רצפטור מטרה. זאת באמצעות שימוש בחומצת אמינו לא טבעית שהוכנסה לאתר ספציפי, p zeto phenol alanine, כגשש ריאקטיבי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בניאוגנזה של חומצות אמי노 לא טבעיות כדי להחדיר גשש מולקולרי ל-A-G-P-C-R, במטרה להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קומפלקסים של איתות GPCR באמצעות טכניקות של צמירה מצולבת פוטו-מכוונת וסימון ביו-אורתוגונלי.