לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ולפרק מראש פפטידים מחומר פורמלי וקבוע ומשובץ פרפין או FFPE לניתוח פרוטאומי. זה מושג על ידי בידוד הרקמה הרצויה על ידי מיקרודיסקציה, ואחריה ליזה של תאים. השלב השני הוא יצירת פפטידים על ידי עיבוד דגימות.

שימוש במסנן עיכול רב אנזימים סייע בהכנת הדגימה. לאחר מכן מכמתים את הפפטידים על ידי מדידת הקרינה הטריטופנית שלהם. השלב האחרון הוא פיצול הפפטידים באמצעות טכניקת הפרדה מבוססת מחליף אניונים חזק לפיצול פפטידים.

בסופו של דבר, הדגימות המוכנות מאפשרות ניתוח של פרוטאומים מכמויות זעירות של חומר לעומק של 10,000 חלבונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בג'ל או בעיכול תמיסה, הוא שהיא ישימה לכמויות זעירות של דגימות קליניות כגון תאי מיקרודיסקט לייזר. השיטה מספקת דגימות המכילות פפטידים מושלמים וטהורים.

מה מקל על חקירה פרוטאומית של רקמות ומחלות אנושיות? הפרוטוקול כולו מורכב מטכניקות שפותחו ופורסמו בעבר. אלה כוללים התאוששות גבוהה, קצות פיפט וקביעת תכולת פפטיד על סמך פלואורסצנטי טריפטופן המדגים את ההליך יהיה גברת

קטינה ליישב טכנאי מהמעבדה שלנו כדי להתחיל להכין פרוסות רקמה לקטעים חתוכים במיקרודיסקט עם מיקרוטום. עובי הפרוסות תלוי במדגם. בדרך כלל מיקרודיסקציה עובדת היטב עם פרוסות של שבעה עד 10 מיקרומטר.

לאחר הקרנת מגלשות הממברנה באור UV למשך 45 דקות, הרכיבו עליהן את החלקים לפני הייבוש בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. דה חלקו את החלקים המורכבים בשתי דגירות רצופות בצנצנות קסילן רצופות למשך שתיים וחצי דקות ודקה וחצי. לאחר מכן החזר את החלקים ברצף.

דגירה של דקה אחת באתנול מוחלט, 70% אתנול. ולבסוף, מים. לאחר צביעת הקטעים בהמטין של מאייר למשך 20 שניות.

יש לשטוף במים למשך דקה אחת ולהניח לייבוש באוויר. אסוף את אוכלוסיית התאים המעניינת באמצעות מערכת מיקרו-דיסקציה ללכידת לייזר. בעת השימוש במכשיר כף היד, אסוף את הדגימות במכסי הדבק באמצעות שלושה מיקרוליטרים של מאגר ליזה של רקמות עבור 10 ננוליטר מרקמת המיקרו-דיסקט.

מרחו את המאגר על החומר המנותח במיקרו במכסה וסגרו את הצינור. אסוף את המתלים לאחר צנטריפוגה קצרה. לאחר מכן כינים את הרקמה המנותחת של המיקרו ב-99 מעלות צלזיוס בבלוק חימום עם תסיסה למשך שעה.

הבהירו את התמצית הגולמית על ידי צנטריפוגה ב -16, 000 גרם ו -18 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבבים עד 50 מיקרוליטר מהליזט המובהר עם 200 מיקרוליטר מתמיסת UA ביחידת סינון אולטרה. ואז צנטריפוגה ב -14, 000 GS עד שפחות מ -10 מיקרוליטר מהתמיסה נשארים במסנן.

בדרך כלל שלב זה דורש 10 עד 15 דקות של צנטריפוגה. לאחר מכן, פיפטה 200 מיקרוליטר מתמיסת UA ליחידת הסינון האולטרה-צנטריפוגה. כמו קודם, רוקן את צינור האיסוף לפני פיפטינג של 50 מיקרוליטר מתמיסת I A לתוך יחידת הסינון האולטרה.

מערבבים בחום של 600 סל"ד במיקסר תרמו בטמפרטורת החדר למשך דקה וצנטריפוגה. כמו קודם, המשך בשלבי סינון וצנטריפוגה אולטרה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לסרטון זה. לאחר מכן העבירו את יחידות הסינון לצינורות איסוף חדשים.

פיפטה 40 מיקרוליטר של מאגר עיכול עם אנדו פרוטאינאז lic C לפני ערבוב ב-600 סל"ד במיקסר התרמו למשך דקה אחת. דגרו את היחידות בתא רטוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. לאחר צנטריפוגה של יחידות המסנן כפי שנעשה קודם לכן, פיפטה 160 מיקרוליטר של מאגר DB וצנטריפוגה.

יחידות המסנן שדרכן הזרימה המאוחסנת מכילות את הפפטידים המשתחררים על ידי אנדו פרוטאז lic C.Next אוספים את פפטידי הטריפטיכון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מדידת תכולת הפפטיד בעיכול החלבון יכולה להתבצע במאגר מדולל מכיוון ששאריות הטריפטופן נגישות היטב לממס. כדי לכמת פפטידים יש תחילה פיפטה של 0.2 מיליליטר של מאגר בדיקה DB לתוך וטרינר הקוורץ Q.

לאחר מכן הנח את וטרינר ה-Q לתוך מחזיק המכשירים ורשום את ספקטרום הפליטה עבור הריק. הכן עקומת כיול באמצעות שלבים של 0.1 מיקרוגרם על ידי הוספת כמות מיקרוליטר אחת של התמיסה הסטנדרטית של טריפטופן לווטרינר Q וערבוב עדין עם המאגר db. לאחר ניקוי וטרינר ה-Q, הכניסו את הדגימה פנימה ורשמו את ספקטרום הדגימה.

המשך לחשב את ריכוז החלבון והפפטיד כמתואר בפרוטוקול הטקסט לפני הפיצול. הכן את עמודת קצה ה-SAX על ידי ערימת שש שכבות של EM. ייבא קרום יונים בקצה פיפטה נפוץ של 0.2 מיליליטר. צור שתי עמודות קצה SAX לכל דוגמה.

לאחר מכן, הכן את קצה הבמה על ידי ערימת שלוש שכבות של M four C 18. בקצה פיפטה של 0.2 מיליליטר, הכינו שישה טיפים לבמה לכל דגימה. להתחיל.

הפיצול מדלל את תמיסות הפפטיד המתקבלות על ידי עיכול עם ly C עם 0.2 מיליליטר של BRI ומאגר אוניברסלי של רובינסון. pH 11 מדלל באופן דומה את תמיסות הפפטיד המתקבלות על ידי עיכול עם טריפסין עם 0.2 מיליליטר של מאגר בריטניה ורובינסון אוניברסלי. pH 5 מרכיבים את עמודת קצה ה-SAX במכסה מתאם הצינור הצנטריפוגלי לפני הכביסה ומשיגים איזון של עמודת קצה ה-SAX וקצות שלב C 18 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, הרכיבו את עמודת קצה ה-SAX בקצה C 18 stage. טען את פתרונות הדוגמה לעמודות קצה SAX מאוזנות וצנטריפוגה את העמודות ב-5,000 Gs למשך שלוש דקות. שוטפים את עמודי קצה הפיפטה עם 0.1 מיליליטר מהדגימות המדוללות.

הקל על הזרימה על ידי צנטריפוגה ב-5,000 Gs.העבר את עמודת קצה ה-SAX לקצה השלב הבא של C 18 והמשך להוציא את הפפטידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר שטיפת קצות שלב C 18 עם 0.05 מיליליטר של מאגר a מסירים את השברים עם 0.05 מיליליטר של מאגר B לבקבוקונים, ששימשו מאוחר יותר להזרקת הדגימות למערכת כרומטוגרפיה נוזלית שהורכבה עם נציג ספקטרומטר מסה. תוצאות מיצוי ועיכול החלבון מוצגות כאן.

ליזה של 250 ננוליטר של רקמה, המקבילה לשטח מנותח מיקרו של 25 מילימטרים רבועים מפרוסה של 10 מיקרומטר, מביאה לכ-45 מיקרוגרם של חלבון כולל לאחר עיכול רציף דו-שלבי בפורמט צום עם פרוסת אנדו פרוטאז C וטריפסין מביאה לתפוקה של יותר מ-50% מכלל החלבון. מוצגת כאן מדידת פלואורסצנטיות מייצגת של תכולת הפפטיד, הספקטרום של תקן טריטופן והדגימה מראים מקסימום ב-350 עד 360 ננומטר. עוצמת הקרינה פרופורציונלית לתכולת הטריטופן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות מרקמה גבוהה לניתוח פרוטאומי באמצעות טכניקת מיקרודיסקציה, עיבוד דגימות ופיצול פפטידים לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות בתוספת זמן הדרוש לקשיי עיכול חלבון. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בפרוסות רקמה טריות שהוכנו לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאומיקה לחקור את הפרוטאומים של רקמות ותאים ואת החריגות בבני אדם באמצעות arval for in fixed and paren embedded material.