פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להרכיב ולהשתמש בפלטפורמה מבוססת מיקרופלואידית אוטומטית למחצה כדי לטפח ולעורר אוכלוסיות קטנות של תאים ולשחזר ליזטים של תאים לניתוחים מולקולריים. זה מושג על ידי הקמת תרביות תאים בקנה מידה מיקרו בנימי מיקרו מצופים פיברונקטין המכונים תאי זלוף תאים. השלב השני הוא חיבור תאי הזלוף למיקרופלואידיקה דיגיטלית או מודול DMF, המספק אמצעי גמיש שבאמצעותו ריאגנטים מנותבים אל תרביות התאים המיקרו-סקאלה וממנה.

לאחר מכן, מודול ה-DMF מספק את הגירוי המעניין לתאי הזלוף והתאים מודגרים עם הגירוי לזמן חשיפה קבוע מראש. לבסוף, התאים עוברים ליזה באמצעים כימיים והליזטים משוחזרים על מודול DMF לניתוח מולקולרי. לאחר מכן מנותחים הליזטים המשוחזרים באמצעות R-T-P-C-R כמותי על מנת לאפיין את תגובת השעתוק של אוכלוסיית התאים לגירוי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות תרבית תאים קונבנציונליות, יתכן בטכניקה זו שתוכלו לבצע מחקרי גירוי תאים באמצעות כמויות קטנות של תאים, וגם להשתמש בכמויות קטנות של ריאגנטים. המחקר שלנו הוכיח כי הטיפול המדויק של הפלטפורמה בתאים ומגיב בקנה מידה מיקרו ממזער את השונות של ניסוי לניסוי. הפלטפורמה מגוונת מאוד גם כן.

מודול המיקרו-זרימה הדיגיטלי יכול לנתב תאים וריאגנטים אל תאי הזלוף ומהם בגמישות רבה כך שניתן להתאים אישית ניסויים ולהגדיר אותם מחדש במהירות ובקלות. כדי להתחיל, הכינו תמיסה סטרילית של 50 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין והשתמשו במשאבת מזרק מרובת יציאות כדי לשאוב 30 מיקרוליטר מהתמיסה לכל מיקרו נימי כדי להאיץ את הציפוי של המשטחים הפנימיים המיקרו-נימיים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואז משכו והשליכו את תמיסת הפיברונקטין והניחו לנימים המיקרו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך שש שעות.

לאחר מכן, חבר את הנימים המיקרו או תאי הזלוף המצופים בסיבים נין לצינורות פוליקרבונט ואת הצינור למשאבת המזרק באמצעות אביזרי קפיט. ההתקנה המוצגת כאן משתמשת במשאבת מזרק יציאת סיוע התומכת בשישה תאי זלוף. בעזרת סרט, אבטח את הגוף של כל תא זלוף לגוש חום והגדר את טמפרטורת גושי החום ל -37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן טבלו את הקצוות הפתוחים של תאי הזלוף במאגר המכיל תאים, תלויים בצמיחה טרייה, בינוניים מפוזרים באופן שווה בריכוז של מיליון תאים למיליליטר. הורה למשאבת המזרק למשוך 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים לכל תא זלוף. לאחר מכן הסר את הקצוות הפתוחים של תאי הזלוף ממתלה התא והורה למשאבת המזרק למשוך מספיק אוויר כדי להעביר את פקקי הנוזל לתוך החלקים המאובטחים לגוש החום.

אפשר לתאים להיצמד למשטחים הפנימיים המצופים פיברונקטין של תאי הזלוף על ידי דגירה שלהם ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. בינתיים, העבירו את הקצוות הפתוחים של תאי הזלוף למאגר חדש המכיל מצע גידול טרי. לאחר תקופת ההדבקה, הורה למשאבת המזרק לשלוח את פקקי הנוזל לפסולת ולאחר מכן למשוך 10 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל תא שפע, ואחריו מספיק אוויר כדי למקם את המדיום הטרי מעל התאים המודבקים.

המשיכו לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והחליפו את המדיום כל שעתיים עד שהתרביות מאוזנות ומורחבות מספיק. תבנית. הצלחת התחתונה של מודול DMF עם 46 אלקטרודות תחמוצת פח אינדיום. באמצעות טכניקות פוטוליטוגרפיות סטנדרטיות מצפים את הצלחת התחתונה של מודול ה-DMF בחמישה מיקרון של Lene C באמצעות שקיעת אדים כימית, ולאחר מכן מסתובבים עם ציפוי של 50 ננומטר של טפלון af.

מעיל הסיבוב הבא ומצע זכוכית תחמוצת פח אינדיום לא מעוצב עם 50 ננומטר של טפלון AF שישמש כצלחת העליונה. השתמש במסגרות דחיסה ממתכת כדי לקבע את הלוחות ביציקת פולימר עם שקעים השומרים על מרווח של 400 מיקרון בין הלוחות. מרווח זה בשילוב עם גודל אלקטרודת ההפעלה של 2.5 מילימטרים בריבוע מגדיר את נפח הטיפה כ-2.5 מיקרוליטר לאלקטרודה.

לאחר מכן הכנס מיקרו נימי העברה מצופים טפלון לחלל שבין לוחות ה-DMF. מיקום כל אחד מהם כך שישתרע עד לקצה אלקטרודת ההפעלה הקוגנטית שלו לקצה הנגדי של כל העברה. מיקרו נימי להצמיד אביזר קפיט.

לאחר מכן, הפעל את המחברים החשמליים כדי לספק מתח לאלקטרודות תחמוצת האינדיום 10. רצפי הפעלת אלקטרודות מתבצעים באופן אוטומטי באמצעות ממשק אלקטרוני מבוקר מחשב המפעיל סקריפטים שנקבעו מראש. לאחר מכן מלאו את מודולי ה-DMF במאגרים המשולבים בריאגנטים המתאימים לגירוי תאים, שטיפה וליזה.

במקרים מסוימים, עדיף להעמיס את הגירוי עצמו בשלב מאוחר יותר ממש לפני השימוש בו, לשאוב מהמאגרים העמוסים על הסיפון, להוציא טיפות מיקרו על מודול ה-DMF. בדיקה, הפעלה של טיפות המיקרו, כולל הובלתן בין מודול ה- DMF לבין נימי המיקרו ההעברה. בלייס. ראשית, הכינו את הגירוי במדיום טרי עם 0.1% אוניק F1 27 בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר מכן טען 80 עד 100 מיקרוליטר מהגירוי למאגר המיועד לו על הסיפון. לאחר מכן, הסר את הקצוות הפתוחים של תאי הזלוף מהמאגר הבינוני והכנס אותם לאביזרי הקפיט המוצמדים לקצות ההעברה מיקרו נימי ההעברה ואז הורה למשאבת המזרק לשלוח את פקקי הנוזל בתוך תאי הזלוף למיכל הפסולת. לאחר מכן, הנחו את מודול ה-DMF לייצר 10 טיפות מיקרוליטר של גירוי ולהעביר אותן לתאי הזלוף דרך מיקרו-נימי ההעברה.

דגרו על התאים עם הגירוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד ארבע שעות במידת הצורך. החלפה בגירוי טרי במרווחי זמן קבועים לאחר תקופת הגירוי. הורה למשאבת המזרק לשלוח את הגירוי למיכל הפסולת והורה למודול DMF להעביר טיפה של 10 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל תא זלוף.

דגרו על התאים עם מאגר הכביסה למשך חמש דקות. לאחר מכן החלף את מאגר הכביסה ב -10 מיקרוליטר תמיסת ליזה ודגר למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, הורה למשאבת המזרק לשלוח כל ליזאט תא למודול DMF.

הסר את הצלחת העליונה של מודול ה-DMF והקפד לא להטות את הצלחת הצידה מכיוון שהדבר עלול לגרום לזיהום צולב בין טיפות. לבסוף, אסוף את הליזטים ממודול ה-DMF הפתוח באמצעות איש פיפטה לניתוח מחוץ לפלטפורמה, כגון ביטוי גנים, פרופיל באמצעות R-T-P-C-R כמותי כדי להכין את הפלטפורמה לניסוי הבא. ראשית, טבלו את נימי המיקרו העברה, אביזרי CAPITE וצלחות מודול DMF ב-10% אקונומיקה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, לוחות מודול ה-DMF נשטפים באיזופרופנול ואחריהם מים נטולי יונים ומייבשים באמצעות גז חנקן, ולאחר מכן אופים ב-160 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

שיטות הזריעה המתוארות בפרוטוקול זה הביאו להיצמדות של כ-500 מקרופאגים מירן לכל תא זלוף. לאחר דגירה של התאים עם מצע גידול ב-37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, גודל האוכלוסייה הוכפל לכ-1000 תאים לכל תא זלוף. מוצגות כאן תוצאות מניתוח כמותי של R-T-P-C-R של ארבעה גנים הידועים כממלאים תפקידים חשובים בתגובות חיסוניות מולדות לחיידקים.

המקרופאגים גודלו בתרביות קונבנציונליות או בקנה מידה מיקרו ועוררו עם חלקיקי ביו אי קולי למשך שעה או ארבע שעות. הפסים הכחולים מציינים את העלייה הממוצעת בביטוי הגנים עם גירוי של תאים מתורבתים קונבנציונליים, ואילו הפסים האדומים מצביעים על ביטוי מושרה בתאים שגדלו ועוררו. בתרבויות בקנה מידה מיקרו, פסי השגיאה מצביעים על סטיות תקן בין שכפולים ביולוגיים משלושה ניסויים עצמאיים.

תוצאות פרופיל ביטוי הגנים היו דומות מאוד, למרות שהתרבויות הקונבנציונליות השתמשו ב-96 צלחות באר עם כ-50,000 תאים לבאר, בעוד שהתרבויות בקנה מידה מיקרו השתמשו במיקרו-נימים עם כ-1000 תאים לכל תא זלוף ניסוי לניסוי השונות הייתה לפחות דומה ולעתים קרובות מופחתת בתרביות בקנה מידה מיקרו כפי שמצוין על ידי פסי השגיאה הקצרים יותר הפועלים במיקרו-סקאלה. צריכת תאים מופחתת פי חמישה וצריכת ריאגנטים מופחתת פי שלושה עד פי 50. יחסית לניסויים הקונבנציונליים.

השיטה יכולה לשמש לתרבית, כמעט כל סוג של תא הדבקה, במקרים מסוימים באמצעות רכיב מטריצה חוץ-תאי אחר או גידול. סוגי תאים בינוניים שאינם נצמדים יכולים להיות מאתגרים, אך אסטרטגיות קשירת תאים הוכחו כמוצלחות בהקשרים דומים. הגישה המתוארת כאן תומכת בתרבית בקנה מידה מיקרו עד 24 שעות.

הפלטפורמה כוללת את כל הפונקציה לבצע גם תרבית לטווח ארוך, אך יש לפתח פרוטוקול מעבר תאים. מודולים נוספים עשויים להיות משולבים בתא מיקרופלואידית דיגיטלי באמצעות חיבורי המיקרו-נימי. באופן זה, ה-DMF משמש כרכזת מרכזית לחיבור המודולים ההיקפיים לביצוע זרימות עבודה מורכבות.

התמקדנו בעיקר באפיון תגובות שעתוק מארח לגורמים זיהומיים, אך הפלטפורמה נועדה להיות רב-תכליתית ביותר ולכן היא צריכה לתמוך במגוון רחב של יישומי מחקר.