פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להרכיב ולהשתמש בפלטפורמה מיקרופלואידית חצי-אוטומטית לגידול וגירוי של אוכלוסיות תאים קטנות, ולהשגת ליזטים של תאים לצורך אנליזות מולקולריות. דבר זה מושג תחילה על ידי הקמת תרביות תאים במיקרו-קנה מידה בתוך מיקרו-נימיים מצופים בפיברונקטין, המכונים תאי פרפוזיה לתאים. השלב השני הוא חיבור תאי הפרפוזיה למודול מיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF), המספק אמצעי גמיש להעברת ריאגנטים אל תרביות התאים שבמיקרו-קנה מידה וממנה.

בשלב הבא, מודול ה-DMF מעביר את הגירוי הרלוונטי לתאי הפרפוזיה והתאים מדגגרים עם הגירוי למשך זמן חשיפה שנקבע מראש. לבסוף, התאים מולסים באמצעות אמצעים כימיים והליזאטים נאספים אל מודול ה-DMF לצורך אנליזה מולקולרית. הליזאטים שנאספו מנותחים לאחר מכן באמצעות quantitative R-T-P-C-R כדי לאפיין את התגובה השבטנית של אוכלוסיית התאים לגירוי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות שגרתיות לתרבית תאים הוא האפשרות לבצע מחקרי גרייה של תאים תוך שימוש בכמויות קטנות של תאים וכן בכמויות קטנות של ריאגנטים. מחקרנו הדגים כי הטיפול המדויק בתאים ובריאגנטים במיקרו-קנה מידה על ידי הפלטפורמה ממזער את השונות בין ניסוי לניסוי. הפלטפורמה היא רב-גונית מאוד.

מודול המיקרו-זרימה הדיגיטלית יכול לנתב תאים וריאגנטים אל תאי הפרפוזיה ומהם בגמישות רבה, כך שניתן להתאים ולהגדיר מחדש ניסויים במהירות ובקלות. כדי להתחיל, הכין תמיסה סטרילית של 50 µg/mL פיברונקטין והשתמש במשאבת מזרק רב-שסתומים כדי לשאוב 30 µL מהתמיסה לתוך כל מיקרו-קפילרה כדי להאיץ את ציפוי המשטחים הפנימיים של המיקרו-קפילרה. דגרי ב-37 °C למשך שעתיים, לאחר מכן שאב החוצה והשלך את תמיסת הפיברונקטין ואפשר למיקרו-קפילרות להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שש שעות.

בשלב הבא, חברו את מיקרו-קפילריות המצופות ב-fiber nin או את תאי הפרפוזיה לצינורות פוליקרבונט, ואת הצינורות למשאבת המזרקים באמצעות מחברי capite. המערך המוצג כאן משתמש במשאבת מזרקים מסוג aid port התומכת בשישה תאי פרפוזיה. בעזרת סרט הדבקה, קבעו את גוף כל תא פרפוזיה לבלוק חימום והגדירו את טמפרטורת בלוק החימום ל-37 °C.

לאחר מכן, טבול את הקצוות הפתוחים של תאי הפרפוזיה במאגר המכיל תאים, התלויים בתוך מצע גידול טרי ומפוזרים באופן אחיד בריכוז של 1 מיליון תאים למילליליטר. הגדר למשאבת המזרק לשאוב 10 µL של ת сусפנזיית התאים לתוך כל תא פרפוזיה. לאחר מכן, הוצא את הקצוות הפתוחים של תאי הפרפוזיה מסוספנזיית התאים והגדר למשאבת המזרק לשאוב מספיק אוויר כדי להזיז את פקקי הנוזל אל המקטעים המקובעים לגוש החימום.

אפשר לתאים להיצמד למשטחים הפנימיים של תאי הפרפוזיה המצופים בפיברונקטין על ידי דגירה ב-37 degrees Celsius למשך שעה עד שעתיים. בינתיים, העבר את הקצוות הפתוחים של תאי הפרפוזיה למאגר חדש המכיל מצע גידול טרי. לאחר תקופת ההיצמדות, הגדר למשאבת המזרק להעביר את פקיקי הנוזל לפסולת ולאחר מכן לשאוב 10 microliters של מצע טרי לכל תא פרפוזיה, ולאחריו כמות מספקת של אוויר כדי למקם את המצע הטרי מעל התאים ההיצמדים.

המשיכו לדגרי את התאים בטמפרטורה של 37 °C, תוך החלפת המצע בכל שעתיים, עד שהתרביות יהיו מאוזנות ומומרחבות מספיק. דפוס. הלוח התחתון של יחידת ה-DMF עם 46 אלקטרודות של indium tin oxide. באמצעות טכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות, צפו את הלוח התחתון של יחידת ה-DMF בשכבה של חמישה מיקרון של Lene C באמצעות מראי אדים כימיים (CVD), ולאחר מכן בצעו ציפוי ספין של 50 ננומטר של Teflon af.

בשלב הבא, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של 50 nanometers של Teflon AF על מצע זכוכית מסוג indium tin oxide ללא תבנית, שישמש כלוח העליון. השתמשו במסגרות דחיסה ממתכת כדי לקבע את הלוחות בתוך יציקת פולימר בעלת שקעים השומרים על מרווח של 400 micron בין הלוחות. מרווח זה, בשילוב עם גודל אלקטרודת ההפעלה של 2.5 millimeters squared, מגדיר את נפח הטיפה כ-2.5 microliters לאלקטרודה.

לאחר מכן, הכניסו מיקרו-קפילריות העברה מצופות טפלון לתוך הרווח שבין לוחות ה-DMF. יש למקם כל אחת מהן כך שתגיע מקצה אלקטרודת ההפעלה התואמת לה ועד לקצה השני של כל העברה. חברו מחבר (fitting) לקצה המיקרו-קפילריה.

בשלב הבא, חברו את המחברים החשמליים כדי לספק מתח לאלקטרודות תחמוצת האינדיום 10. רצפי הפעלת האלקטרודות מבוצעים באופן אוטומטי באמצעות ממשק אלקטרוני הנשלט על ידי מחשב ומריץ סקריפטים שנקבעו מראש. לאחר מכן, מלאו את המאגרי המובנים של יחידות ה-DMF בריאגנטים המתאימים לגירוי התאים, שטיפה וליזיס.

במקרים מסוימים, עדיף להטעין את הגורה המגרה עצמו בשלב מאוחר יותר, ממש לפני השימוש בו, על ידי שאיבה מהמאגרים המובנים שהוטענו, ולהניח טיפות מיקרוסקופיות על מודול ה-DMF. יש לבדוק את הפעלת טיפות המיקרו, כולל העברתן בין מודול ה-DMF לבין מיקרו-קפילריות ההעברה. Blais. ראשית, הכין את הגורה המגרה במדיום טרי עם 0.1%onic F1 27 בריכוז סופי של 100 µg/mL.

לאחר מכן, טענו 80 עד 100 µL של הגירוי למאגר הייעודי שלו על גבי המכשיר. בשלב הבא, הוציאו את הקצוות הפתוחים של תאי הפרפוזיה ממאגר המצע והכניסו אותם למחברי ה-capite המחוברים לקצוות של מיקרו-קפילרות ההעברה, ולאחר מכן הגדירו למשאבת המזרק להעביר את פלגי הנוזל שבתוך תאי הפרפוזיה למכל הפסולת. לבסוף, הגדירו למודול ה-DMF ליצור טיפות של 10 µL של הגירוי ולהעביר אותן לתאי הפרפוזיה באמצעות מיקרו-קפילרות ההעברה.

דגרו את התאים עם המגרה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת עד ארבע שעות במידת הצורך. החליפו למגרה טרייה במרווחי זמן קבועים לאחר תקופת הגירוי. הגדירו למשאבת המזרק להזרים את המגרה למכל הפסולת והגדירו למודול ה-DMF להזרים טיפה של 10 µL של בופר שטיפה לכל תא פרפוזיה.

דגרו את התאים עם בופר השטיפה למשך חמש דקות. לאחר מכן, החליפו את בופר השטיפה ב-10 µL של תמיסת ליזיס ודגרו למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, הגדירו למשאבת המזרק להעביר כל ליזאט של תא למודול ה-DMF.

הסר את הפלטה העליונה של מודול ה-DMF תוך הקפדה לא להטות את הפלטה הצידה, שכן הדבר עלול לגרום לזיהום צולב בין הטיפות. לבסוף, אסוף את הליזטים ממודול ה-DMF הפתוח באמצעות פיפטמן לצורך אנליזה מחוץ לפלטפורמה, כגון ביטוי גנים או פרופיל באמצעות quantitative R-T-P-C-R, כדי להכין את הפלטפורמה לניסוי הבא. ראשית, השקע את מיקרו-קפילרי ההעברה, את חיבורי ה-CAPITE ואת פלטות מודול ה-DMF ב-10% bleach למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; את פלטות מודול ה-DMF שוטפים ב-isopropanol ולאחריו במים דה-יוניים ומייבשים באמצעות גז חנקן, ולאחר מכן מבצעים אפייה ב-160 degrees Celsius למשך 10 דקות.

שיטות הזריעה המתוארות בפרוטוקול זה הביאו להיצמדות של כ-500 מקרופאגים של miren לכל תא פרפוזיה. לאחר דגירה של התאים במצע גידול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 16 שעות, גודל האוכלוסייה הוכפל לכ-1000 תאים לכל תא פרפוזיה. מוצגים כאן תוצאות של אנליזת R-T-P-C-R כמותית של ארבעה גנים הידועים כבעלי תפקידים חשובים בתגובות חיסוניות מולדות לבקטריות.

המקרופאגים גודלו בתרביות קונבנציונליות או בתרביות במיקרו-קנה מידה (microscale) ועברו סטימולציה באמצעות חלקיקים ביולוגיים של e coli למשך שעה אחת או ארבע שעות. הפסים הכחולים מציינים את ממוצע עליית הפילי (fold increase) בביטוי הגנים בעקבות סטימולציה של תאים שגודלו באופן קונבנציונלי, בעוד שהפסים האדומים מציינים ביטוי מושרה בתאים שגודלו ועברו סטימולציה. בתרביות במיקרו-קנה מידה, פסי השגיאה מציינים סטיות תקן בין חזרות ביולוגיות משלושה ניסויים בלתי תלויים.

תוצאות פרופיל ביטוי הגנים היו דומות מאוד, למרות שבטיפוחים הקונבנציונליים נעשה שימוש בלוחיות 96 בארות עם כ-50,000 תאים לבער, בעוד שבטיפוחים במיקרו-קנה מידה נעשה שימוש בנימי מיקרו עם כ-1000 תאים לניסוי בתא פרפוזיה. השונות בין הניסויים הייתה לפחות דומה, ולעתים קרובות פחותה בטיפוחים במיקרו-קנה מידה, כפי שמעידים פסי השגיאה הקצרים יותר בעבודה במיקרו-קנה מידה. צריכת התאים פחתה פי חמישה וצריכת הרכיבים פחתה פי 3 עד 50 בהשוואה לניסויים הקונבנציונליים.

ניתן להשתמש בשיטה זו לתרבית של כמעט כל סוג של תאי היצמדות, ובמקרים מסוימים תוך שימוש ברכיב שונה של מטריצה חוץ-תאית או בתווך גידול. תרבית של סוגי תאים שאינם נצמדים עשויה להיות מאתגרת, אך אסטרטגיות של עיגון תאים (cell tethering) הוכחו כ spacers מוצלחים בהקשרים דומים. הגישה המתוארת כאן תומכת בתרבית בקנה מידה מיקרוסקופי למשך עד 24 שעות.

הפלטפורמה כוללת את כל הפונקציות המאפשרות גם תרבית לטווח ארוך, אך יש לפתח פרוטוקול למעבר תאים (cell passaging). ניתן לשלב מודולים נוספים בקוביה המיקרופלואידית הדיגיטלית באמצעות מחברי מיקרו-קפילריה. באופן זה, ה-DMF משמש כמרכז לחיבור מודולים היקפיים לביצוע תהליכי עבודה מורכבים.

התמקדנו בעיקר באפיון תגובות שעתוק של המאחסן לגורמים זיהומיים, אך הפלטפורמה תוכננה להיות רב-גונית ביותר ולכן היא אמורה לתמוך במגוון רחב של יישומים מחקריים.