מניפולציה גנטית ב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא החלפה יעילה ואמינה של גנים באמצעות זני delta 2 80 מסוג one ו-type two של Toxoplasmic ndii. הדבר מושג תחילה על ידי בניית מולקולת DNA למכוון (targeting DNA) הממזגת את הסמן לבחירה HX GPRT בכיוון קדמי (forward orientation) בין מקטעי שוליים (flanks) נבדלים של DNA למכוון גנים בקווי ה-five prime וה-three prime. השלב השני של הפרוצדורה הוא טרנספקציה של מולקולת ה-DNA למכוון לתוך זן toxoplasma DYI מסוג one או type two.

השלב השלישי הוא בחירה סבלנית של אירועי רקומבינציה הומולוגית עם ש crossover כפול ובידוד של קלונים בודדים. השלב הסופי הוא תיקוף של נוכחות אירוע תכנון הגנים (gene targeting) בקלוני המוטנטים המבודדים. בסופו של דבר, תוצאות הליך זה יכולה להראות את תפקודם של גנים בטפילים באמצעות ניתוח של השבתות גנים ממוקדות (gene knockouts), החלפת גנים ותיוג גנים באמצעות מגוון יישומים המשכיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות המשתמשות בזני פרא של טפיל זה הוא שרקעי הטפיל delta 2 80 מסוג אחד ומסוג שני מאפשרים כעת ברירה אמינה ביותר של אירועי רקומבינציה הומולוגית של כrossover כפול ממוקד, לצורך יצירת זנים מוגדרים גנטית באופן מדויק. טכניקה זו תאיץ באופן משמעותי את גילוי יעדים חדשים לטיפול תרופתי בפלסמות נוגדי רעלים ואת הפיתוח של זני חיסון מוחלשים בטוחים ויעילים, במיוחד כאשר היא משולבת עם המשאבים הגנומיים המתוכננים היטב הנמצאים באופן מקוון ב-toxodb.org@. באופן כללי, אנשים שאינם בקיים בשיטה זו עשויים להתקשות בהנדסת מולקולות DNA ממוקדות או במניפולציות גנטיות עם Toxoplasma Gandhi.

עם זאת, תרגול של המטופלים ותכנון של מולקולות תargeting אמינות יבטיחו את ההצלחה. התחילו את הפרוטוקול על ידי הגברה ב-PCR של רצפי ה-flanks הגנומיים ב-5' וב-3' עבור הגן הנבדק מתוך DNA גנומי. לאחר מכן, הגבירו ב-PCR את הסמן הבריר HX GPRT יחד עם רצפי ה-DHFR flanks ב-5' וב-3' מתוך קסאט המיני-גן HX GPRT CD NA.

השתמשו ברקומבינציה של שמרים או בשיטה דומה כדי לחבר את מולקולות ה-DNA התלת-ממדיות בכיוון הנכון שלהן מקצה חמישי לשלישי עם הפלסמיד PRS 416, ובכך צרו את הפלסמיד p delta GOI שיכוון למחיקה של הגן המבוקש. לאחר מכן, הכינו דגימה של 100 µL המכילה 15 עד 30 µg של פלסמיד targeting לינארי עבור טרנספקציה לתוך T gia, כ-68 עד 72 שעות לאחר הזרקת בקבוק של 25 cm של תאי HFF קונפלואנטים. ודאו את נוכחותם של טפילים ש acabado-lyzed על ידי אישור חזותי ש-90 עד 95% מתאי ה-HFF עברו ליזה; טפילים חיוניים הכרחיים עבור targeting של הגן.

ערבבו את הטפילים החיים לתוך התמיסה על ידי ניעור חזק של הבקבוק הסגור, מבלי להתיז נוזל על החלק הפנימי של המכסה או על צוואר הבקבוק. אספו את הטפילים מהבקבוק והכינו אותם לטרנספקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בצעו אלקטרופורציה של הפלסמיד המכוון אל תוך זן ה-toxoplasma delta CO 80.

העבירו את התערובת שעברה אלקטרופורציה לבקבוק של 150 סנטימטר המכיל תאי HFF במצב של התמזגות (confluent) ו-30 מיליליטר של Medium זיהום. דגרו את התרבית המזוהמת למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, כ-20 שעות לאחר הטרנספקציה. החליפו את המצע במצע ברירה של MPA plus X.

כעת יש לאפשר לטפילים להדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך כשמונה ימים, ללא הפרעה. ברגע שפלאקים (plaques) יהיו גלויים, נעקוף את הבקראק כדי לשחרר טפילים חוץ-תאיים מהשכבה החד-שכבתיים (monolayer) ליצירת תמיסת טפילים. העבירו כ-0.5 mL מתמיסת הטפילים לבקראק חדש של 25 cm המכיל תאי HFF קונפלואנטיים ב-5 mL של מצע ברירה MPA plus X.

סמנו תרבית זו כ-PAs one A כעבור כשלושה ימים. חזרו על העברת 0.5 mL של תמיסת הטפיל מהבקבוק המקורי לבקבוק אחר של תאי HFF עם אותו מצע ברירה. סמנו תרבית זו כ-PAs one B במהלך חמשת הימים הבאים.

עקבו אחר מעבר אחד A ואחד B עבור pfu. בחרו במעבר אחד A או במעבר אחד B לתתי-שיבוט על בסיס מספר מספיק של יותר מ-25 אזורי זיהום. בכל פעם שהטפילים גורמים לליזה של תאי HFF, העבירו את התרבית לבקבוק חדש של 25 סנטימטר עם תאי HFF קונפלואנטים במצע ברירה. שלושה שבועות לאחר הטרנספקציה, בצעו תתי-שיבוט של טפילים שהוחדרו טריים על ידי דילול הטפילים לריכוז המתאים במצע MPA plus X, והפיצו באופן שווה את תמיסת הטפילים למגש של 96 בארות המכיל תאי HFF קונפלואנטים.

הכינו מגש אחד בריכוז של טפיל אחד לכל באר, והכינו מגש שני בריכוז של שני טפילים לכל באר. דגרו את שני המגשים בטמפרטורה של 37 °C לאחר תאריך הטרנספקציה המקורי. אין לבצע סב-קלון של הטפילים לפני היום ה-20 עבור טפילים מסוג 1, או לפני היום ה-25 עבור טפילים מסוג 2.

המשיכו להעביר את הבקבוק בנפח 25 סנטימטר בלוח זמנים שבועי כפי שמתואר בטקסט המקוון, עד אשר זן ה-knockout יאומת. לאחר כשבוע, בצעו דירוג (score) של תבניות 96 הבארים תחת הגדלה של 40 עד 60 x. בחרו רק בארים המכילים PFU בודד, שזוהה כאזור זיהום בודד, באמצעות פיפט המכוון ל-50 microliters.

ערבבו את תכולת בארות אלו על ידי הכוונת זרימת הנוזל מעל ה-PFU כדי לפזר את הטפילים ברחבי הבאר. ארבעה עד חמישה ימים לאחר ערבוב הבארות הנבחרות, בחרו תריסר שיבוטים עם תאים שעברו ליזה. העבירו 12 שיבוטים מגש 96 הבארות ל-12 בארות של גש 24 בארות. בצעו זאת על ידי גירוד עם קצה פיפט בתחתית הבאר ושאיבה של 6 µL.

העבירו את התמיסה לבאר בפלטה של 24 בארות עם תאי HFF בשכבה רציפה (confluent) במיליליטר אחד של MPA בתוספת X selection. Medium. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C ועקבו אחר ליזיס של תאי ה-HFF. בצעו מעבר (Passage) של הטפילים מבאר שעברה ליזיס בפלטה של ה-24 בארות בלוח זמנים שבועי.

השתמשו בטכניקת השריטה והציור (scratch and draw) כדי להעביר 2 µL של תמיסת הטפילים לצלחת חדשה עם MPA ובחירה על X. לאחר המעבר, אספו את הטפילים מהפלטה המקורית בעלת 24 הבארות והעבירו אותם למבחנות קטנות לצורך איסוף DNA.

לסיום, השתמש ב-PCR כדי לבחון את מחיקת הגן המבוקש, על מנת לוודא את האינטגרציה של האגפים המטרה ב-5' וב-3', ואת נוכחותו של הסמן הבורר HX GPRT. פרוטוקול זה מיועד להסרת הסמן HX GPRT מזן ה-delta Q 80 המהונדס, והוא מפורט בטקסט המקוון.

שיטת P delta GOYC שואפת להסיר את HX GPRT מהטפיל באמצעות ברירה שלילית תוך שימוש בשישה מצעי TX. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-PCR כדי לאשר את אובדן HX GPRT, כפי שמעידה פס של 1.2 Kilobase pair במקרים שבהם HX GPRT לא הוסר מהלוקוס. קיימת פס של 3.4 kilobase pair.

החלק האחרון של פרוטוקול זה, תיוג של קצה C של חלבונים, מתואר אף הוא בפירוט בטקסט המקוון. לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר למחיקה ממוקדת של גן, נעשה שימוש ב-PCR כדי לאמת את המחיקה של knockout של type one R 18, אתר שבאופן כללי קשה לתיקוד. PCR 1 מראה את היעדרה של תוצר ה-PCR של הגן R 18.

בדיקת PCR שתיים מעידה על נוכחותו של רצף ה-flank הגנומי של R 18 ב-3', ובדיקות PCR שלוש וארבע מעידות על כך שהסמן לברירה שולב כראוי בין רצפי ה-flank הגנומיים ב-5' וב-3', דבר המגדיר את מחיקת R 18. על מנת להשתמש שוב בסמן לברירה לצורך ביצוע מחיקות עוקבות בזן, יש להסיר תחילה את HX GPRT המקורי מהלוקוס. לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר.

HX GPRT הוסר משני האתרים של GRA שנמחקו בזן delta two 80 delta GRA two HX. נעשה שימוש ב-G-P-R-T-P-C-R כדי לאשר את אובדן HX GPRT, כפי שהודגם על ידי פס של 1.2 KILOBASE. כאשר H-X-G-P-R-T לא הוסר, הופיע פס של 3.4 kilobase לאחר שלב התargeting הגנטי הראשוני. ניתן להחיל שיטות targeting גנטי נוספות כדי לבנות knockouts מרובים באותו זן מסוג one או מסוג two, או כדי לתייג או להשלים זן מוטנטי כדי לענות על שאלות נוספות כמו, היכן חלבון זה ממוקם בתא?

או מהו הדומיין או הפעילות המרכזית של חלבון זה או של מסלול זה המסבירה את תפקודו הביולוגי? טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום להגביר את חקירת תפקוד הגנים של טפילים בקומפלקס AP המודלי ובטפיל toxoplasma. Gandhi eye.

אל תשכחו שעבודה עם toxoplasma עלולה להיות מסוכנת, ויש לשמור על אמצעי זהירות, כגון הקפדה על כל הנחיות BSL 2, לאורך כל הפרוצדורה.