Name: מניפולציה גנטית ב Δku80 זנים לאנליזה גנומית תפקודית של Toxoplasma gondii (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטה יעילה להחלפת גנים ב-Toxoplasma gondii באמצעות זני Δku80. הפרוטוקול מנצל רקומבינציה הומולוגית וסמן HXGPRT ליצירת מחיקות גנים מדויקות ותיוגים, ומאיץ מחקר גנומי תפקודי בטפיל זה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לDJB (AI041930, AI073142, AI075931, וAI091461).

<ol><li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5%27-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li>
<li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+model+apicomplexan%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li>
<li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxoDB%3A+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+research%22%5BJournal%5D)">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma%3A+the+next+100+years%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li>
<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
<li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li>
<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
<li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%27intracellular%27+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li>
<li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+%28TgAMA1%29+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מספקים פרוטוקול לגן המיקוד יעיל בזני הטפיל ku80 Δ כדי לאפשר התאוששות היעילה של צאצאי מניפולציות גנטית שיש ממוקדים מחיקות גנים, תחליפי גן, ו / או גנים מתויגים. הביצוע הרציף של שיטות אלה מספק גישה אמינה לבידוד של מוטציות טפילות המכילות מניפולציות גנטיות ממוקדות בודדות או מרובות 1-3. בעוד הדור של מחיקה ממוקדת תלוי בגורמים רבים, השימוש במתח Δ ku80 עם אסטרטגיה ופרוטוקול המובא מגדיל מאוד את היעילות וקלות מה שהופך את הזנים מוטנטים מוגדרים במדויק של ט gondii ללימודים הגנומי תפקודיים. הגנום של ט &#39; gondii במהלך שלבי זוויגיים הוא הפלואידים. כך בחשבון בעת תכנון לעשות כדי למחוק גן הוא, כי הגן לא חייב להיות חיוני במבחנה. יחד עם זאת, את היעילות של targeknockouts טינג גנים בזני Δ ku80 הוא גבוה מאוד, וזה מאפשר בידוד של זנים מוטנטים עם שיעורי שכפול לקויים באופן משמעותי. אם גן ממוקד הוא חיוני, טפילים לעתים קרובות יפסיקו לשכפל במהלך בחירה. גורם קריטי נוסף במניפולציה גנטית ממוקדת הוא שההומולוגיה מושלמת עם לפחות 620 נ&quot;ב של אגף המיקוד הגנומי נדרש כדי להשיג אינטגרציות ממוקדות לגילוי 2. אזורים ארוכים יותר הומולוגיה לייצר יעילות גבוהה יותר של מיקוד ומיקוד באמצעות אגפי ה-DNA של כ -1,000 נקודות בסיס הוא גישה אמינה ויעילה 1-4. מסיבה זו חשוב שאגפי מיקוד גנומית נוצרים מאותו הזן של ט gondii (RH, Pru) כזן אשר נמצא במניפולציות גנטית. חוסר ההומולוגיה מספקת יכול לעתים קרובות לגרום לאינטגרציה ממוקדת של אגף מיקוד אחד הגנומי, אבל לא את השני. אינטגרציה הושלמה, או אי קבלת תואר שני בנוקאאוטy להיות גם עקב התמדת episomal. מייד לאחר transfection, כל מולקולות המיקוד הם nonintegrated episomes, ולפעמים מולקולות מיקוד יכולות להימשך כepisomes במשך דורות רבים. באמצעות אגפי DNA היעד של ~ KBP 1 וממשיך להעביר טפילים מתחת לפני בחירה מחדש subcloning לעתים קרובות פותר בעיות הקשורות להתמדת episomal. ברגע שהוא תוקף נוקאאוט וסמן HXGPRT מוסר, ניתן לחזור על אסטרטגיית המיקוד בגן GOI שני לייצר מחיקות מרובות בגני זן טפיל חד 1-3. הדור של מחיקות, תחליפים, או גנים המכילות את התווית גם ניתן להשיג על ידי שימוש בסמנים שונים (לבחירת bleomycin, חתול, pyrimethamine עמיד DHFR, וכו &#39;). למרות שהסמן לבחירת CAT כרגע נמצא בסוג השני Δ ku80 Pru הגנום 1, ניתן להסירו באמצעות סמן זה HXGPRT </em&gt; פרוטוקול בחירה מתואר כאן. בידיים שלנו, בחירת HXGPRT היא הבטוחה ביותר וסמן יעיל ביותר עם ​​היעילות הגבוהה ביותר שבו מיקוד החדרה ממוקדת עותק יחידה היא מספיק חזקה לבחירה בMPA + X בינוני. HXGPRT גם מספק גישה רק שימושית כיום למחיקה ממוקדת של סמן לבחירה (איור 3) באמצעות 6 thioxanthine (6TX) מבחר 2,3. לכן פרוטוקול זה מספק גישה הנוכחית רק לפיתוח זנים מוטנטים מוגדרים עם כמה מניפולציות גנטיות ממוקדות. פרוטוקול זה מספק שיטה יקר ויעילה למניפולציה גנטית ממוקדת בזני Δ ku80 של Toxoplasma gondii וישים לניתוח של גן יחיד, משפחה של גנים, או מחקרים גנומיים פונקציונליים הגנום. לפני הזמינות של 1,2 Δ ku80 זנים, גישות אלו לא היו נרחבת ריאלי בשל inefficiency של שיטות אלה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הוא ישים באופן נרחב למניפולציה גנטית ממוקדת של Toxoplasma gondii, והוא נגיש לכל החוקרים המתעניינים בטיפול במגוון רחב של שאלות על טפיל ביולוגיה, תגובה מארחת, וגנומיקה פונקציונלית.

Toxoplasma gondii הוא טפיל שלעתים קרובות protozoan תאי מחייב שכיח וכרוני מדביק מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם 5. ההערכה היא כי יותר מ 1 מליארד בני אדם כיום ונגוע כרוני על ידי פתוגן זה. בנוסף לחשיבות של מחלה הנגרמת על ידי ט gondii זיהום, הזמינות הגוברת של כלים ניסיוניים, משאבי גנומיקה עוצמה 6, קלה בצמיחת מבחנה ומודלי עכבר מצוין עשה ט gondii מערכת מודל מוביל למחקר הרחב יותר של פתוגנים אוקריוטים תאיים וטפילי apicomplexan משמעותיים אחרים הגורמים למחלות הרסניות כגון מלריה (Plasmodium sp.) וCryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. מגבלה משמעותית של Toxoplasma gondii כאורגניזם מודל כבר לא יעילה ההתאוששות של צאצאים שנושאים ממוקדות מניפולציות גנטיות. זה probleמ &#39;במיקוד גן בשל תדירות נמוכה של הומולוגי רקומבינציה יחסית לתדר הגבוה מאוד של nonhomologous רקומבינציה בזני הבר מסוג של ט gondii גם כאשר ה-DNA הומולוגיה נרחבת ניתן במולקולות מטרת דנ&quot;א המשמשים במחקרים גנטיים 2. לאחרונה חסמו גנטי המסלול העיקרי של nonhomologous רקומבינציה בסוג I וסוג II Toxoplasma gondii זנים של ידי מחיקת גן מקודד החלבון 1,2 KU80. סוג כתוצאה מכך אני וזנים מסוג II Δ ku80 מפגינים שיעורי צמיחה נורמלים, גודל והתנהגות הן במבחנה in vivo במהלך tachyzoite ושלבי bradyzoite במבחנה ובחי, עם זאת, זנים אלה מפגינים בעצם תדר 100% מהומולוגיים רקומבינציה וזה הפנוטיפ מגביר את הסבירות של מהירות צאצאי בידוד רצוי של מניפולציות גנטיות ממוקדות על ידי כמה מאה עד כמה אףUSand פי 1,2,4. השימוש האחרון בקהילה רחבה של סוגים והזנים שאני סוג II Δ ku80 יש ramped באופן משמעותי את הקצב, מגוון, כמו גם את שיעור ההצלחה של גישות גנטיות ממוקדים בט gondii 1-4,8-13. כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף לממוקד מחיקת גן, החלפת גן, ותיוג גן בזני Δ ku80 של ט gondii. נדגים לנו כיצד לעצב ומהימן למקד מניפולציות גנטיות לגנים ספציפיים או לוקוסים גנטיים בזני Δ ku80 של Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>פריימרים חופפים</td> טכנולוגיות <td></td><td>DNA משולבות</td><td>4 nmole אולטרה אוליגוס DNA</td></tr><tr><td>אימות פריימרים</td><td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA משולבות <td>100 nmole DNA Oligo</td></tr><tr><td>זן שמרים #90845</td><td>ייעוד ATCC</td><td></td><td>FY834</td></tr><tr><td>וקטור מעבורת pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>מרק SOC בערכה עם E. coli</td></tr><tr><td>מאגר השעיה מאגר</td><td>Qiagen</td><td></td><td>P1 ב-QIAprep ספין מיני-פרפ</td></tr><tr><td>ערכת מיני-פרפ</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep ספין מיני-פרפ ערכת</td></tr><tr><td>זכוכית חרוזים</td><td>תעשיות מדעיות</td><td>SI-BG05</td><td>0.5 מ"מ שטוף חומצה</td></tr><tr><td>Qiacube אוטומטי רובוטי תחנת עבודה</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורציה קובט</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>9104-5050</td><td>2 מ"מ פער</td></tr><tr><td>BTX600 אלקטרופורטור</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep ספין Maxiprep ערכת</td></tr><tr><td>25 ס"מ2 בקבוק אטם צוואר צוואר</td><td>430168</td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 ס"מ2 בקבוק אטם תקע צוואר מצופה 430823</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי פיברובלסטים של עורלה אנושית (HFF) ATCC</td><td></td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מסנן Swin-lok</td><td>Whatman</td><td>420200</td><td>ממברנה בקוטר 25 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore ממברנה חרוטה במסלול 3 מ"מ גודל נקבוביות, חומצה</td></tr><tr><td>מיקופנולית (MPA)</td> בקוטר 25 מ"מ סיגמא <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסנטין (X)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגש תרבית רקמות 96 באר</td><td>קורנינג קוסטאר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 בארות מגש תרבית רקמות</td><td>קורנינג קוסטאר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (אנטי)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>עמוד ספין</td><td>פרים מעבדות</td><td>PAE-100</td><td>ערכת ספין מיצוי DNA קלה לניקוי</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-תיאוקסנטין</td><td>אקרוס אורגני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רקמות DNA Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA מיני ערכת</td></tr><tr><td>תרבית תאים מדיה להקפאה/שחזור</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>מינוס סידן, מינוס מגנזיום</td></tr></tbody></table>

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; toxoplasma gondii</em

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

מניפולציה גנטית ממוקדת באמצעות הומולוגי רקומבינציה היא שיטת בחירה של אנליזה גנומית תפקודית לקבל תצוגה מפורטת של תפקוד גן והפנוטיפ (ים). הפיתוח של זנים מוטנטים עם מחיקות ממוקדות, מוטציות גנטיות ממוקדות, תפקוד גן כהשלמה, ו / או גנים מתויגים מספק אסטרטגיות חזקות כדי לטפל בתפקוד גן, במיוחד אם מניפולציות גנטיות אלה יכולים להיות ממוקדות ביעילות למוקד הגן של עניין באמצעות תיווך אינטגרציה על ידי לחיצה כפולה לחצות הומולוגי רקומבינציה. בשל שיעור גבוה מאוד של nonhomologous רקומבינציה, אנליזה גנומית התפקודית של Toxoplasma gondii היה מוגבל בעבר על ידי העדר שיטות יעילות למיקוד מחיקות גנים והחלפות גן ללוקוסים גנטיים ספציפיים. לאחרונה, ביטל את המסלול העיקרי של nonhomologous רקומבינציה בסוג I וסוג II זנים של ט gondii ידי מחיקת encodin הגןגרם החלבון 1,2 KU80. את Δku80 הזנים להתנהג כרגיל במהלך tachyzoite (אקוטי) וbradyzoite (כרוני) שלבים במבחנה ובחי ולהציג למעשה תדר 100% מהומולוגיים רקומבינציה. זני ku80 Δ לעשות מחקרים גנומיים פונקציונליים אפשריים בגן היחיד, כמו גם בקנה מידת הגנום 1-4. כאן אנו מדווחים שיטות לשימוש בסוג זה אני וזנים מסוג II Δku80Δhxgprt לקדם גישות המתמקדות בגנים ב ט gondii. אנו מתארים שיטות יעילות להפקת מחיקות גנים, תחליפי גנים, וגנים מתויגים על ידי החדרה או מחיקה ממוקדות של הסמן (HXGPRT) phosphoribosyltransferase hypoxanthine-xanthine-גואנין לבחירה. הגן תאר מיקוד פרוטוקול יכול לשמש במגוון רחב של דרכים בΔku80 זנים לקדם ניתוח פונקציונלי של הגנום הטפיל ולפתח זנים יחידים שנושאיםמרובים ממוקד מניפולציות גנטיות. יישום שיטה זו גנטית והמבחנים פנוטיפי הבאים יחשוף היבטים בסיסיים וייחודיים של הביולוגיה של ט &#39; gondii ופתוגנים אנושיים משמעותיים נלווים הגורמים למלריה (Plasmodium sp.) וCryptosporidiosis (Cryptosporidium).

תבנית מפורטת מסופקת לבניית פלסמיד מיקוד למחוק גן, כולל מיקום של אתרי אנזים הגבלה והדור של פריימרים המאפשרים מיקוד גנטי ואימות של גן מיקוד, כמו גם בניית פלסמיד למחיקה הבאה של HXGPRT ב תהליך בשלב יחיד (איורים 1 א-C, איור 2 א, איור 3 א). סכמטי כללית מוצג לביצוע מחיקת גן ממוקד (איור 2 א), לזוגות פריימר משמשים כדי לאמת את המחיקה של נוקאאוט, למשל, אני סוג rop18 (איור 2), ותוצאות מייצגות של אימות PCR מוצגות (איור 2 ג). תוצאת נציג זו מוצגת כדי להמחיש את מגוון רחב של תוצאות שניתן להשיג בלוקוסים גנטיים שקשה יחסית ליעד. מחיקת גן ממוקדת בהצלחה תגרום להיעדרות של הגן של במוצר terest PCR (1 PCR), הנוכחות של 3 &#39;מיקוד אגף גנומית (PCR2), ואת הנוכחות של הסמן לבחירת HXGPRT המשולב כראוי בין 5&#39; צלעות מיקוד הגנומי &#39;3 המגדירות את המחיקה (PCR3 וPCR4) ו . 3 שיבוטים, 4, 5, 6, 8, 9, ו -11 הם תוקף מחיקות גן ממוקדות (knockouts) שבו החליף את HXGPRT GOI (איור 2 ג). שיבוט שאינו מכיל מחיקת גן יכול להיות מיוצג על ידי מגוון רחב של דפוסי banding. בדרך כלל, שיבוט ללא מחיקת גן יהיה במראה את הלחץ ההורי (דפוס הורי) עם להקות שנצפו לPCR1 וPCR2, אך לא לPCR3 או PCR4 כפי שניתן לראות לשיבוטי 1 ו -2 (איור 2 ג). &quot;דפוס הורי&quot; זה נובע מכמה מנגנונים אפשריים. לפעמים, טפילים עמידים MPA נבחרו לשאת episomes מתמיד nonintegrated של pΔGOI מיקוד פלסמיד, ונציין, כי בחירת המשך לעתים קרובות מאלצת episomes אלהלשלב. אנחנו גם שומרים קצת רקע נדיר בסוג I Δ ku80 מתח בשל שילוב לא מכוון של pΔGOI מיקוד פלסמיד, המכיל cDNA HXGPRT הביע באמצעות אלמנטים של פרומוטר DHFR 5 &#39;3 ו&#39;, או למוקד או לDHFR HXGPRT נמחק באופן חלקי לוקוס 14. אמנם האירוע הנדיר הזה הוא שילוב ממוקד, זה לא היה שילוב המיועד ומשמש כנקודת מפתח שיש לזכור בעיצוב כל אסטרטגית החלפת גנים. הומולוגיה-DNA גדול יותר מ -120 נ&quot;ב נשא על pΔGOI המיקוד שלך לפלסמיד עשויה לספק אתר חלופי לרקומבינציה בku80 זני Δ 2 שיכולים לתת בחזרה רקע בלתי רצוי. בסוג הזן השני Pru Δ ku80 רקע זה מצטמצם או לא קיים בהשוואה להקלדה אני משום הסמן לבחירת HXGPRT מבוסס על סוג I רצפים שיש לי פולימורפיזמים נוקלאוטיד בהשוואה עם ה-DNA מסוג II המקטין באופן משמעותי רקע נדיר זו בניסויים בשימוש בסוג השני Pru Δ ku80 זן 1. אם מוקד גן חיוני (לא ניתן למחוק), או שיש גן נמוך מאוד מיקוד תדירות במוקד, או אם מתמיד [nonintegrated] episomes לא בוטל בקלות באמצעות צמיחה ובחירה, דפוס הורי זה ישלוט הדפוס שנצפה בMPA שיבוטים עמידים. לחלופין, מולקולת הדנ&quot;א המיקוד לעתים נצפתה לשלב רק ב 5 &#39;או 3&#39; אגף מיקוד הגנומי ולהקה הוא ציין גם עבור PCR3 או PCR4 (אך לא את שניהם), יחד עם PCR1 וPCR2 כפי שניתן לראות לשיבוט 10 (5 &quot;אינטגרציה) ושיבוט 7 (3 &#39;אינטגרציה) (איור 2 ג). דפוסים אלה מצביעים על התופעה נדירה של צלב יחיד על שילוב של מיקוד פלסמיד במוקד המשלב HXGPRT אבל אינטגרציה ממוקדת זו אינה מוחקת את הגן של עניין. דפוס זה (נתיבים 7 &amp; 10 באיור 2 ג)phasizes הצורך לדווח על נתוני ה-PCR כדי לוודא שהאינטגרציה ממוקדת התרחשה במקום יחידה הומולוגי לחצות ואינטגרציה שנייה nonhomologous של מולקולת המיקוד. לעיתים נדירות, אנו רואים תערובת גנטית מיוצגת על ידי 12 שיבוט (איור 2 ג) שמייצג גם דפוס הורי ודפוס מחיקה ממוקד. דפוס זה ככל הנראה נובע בהזדמנות משני גנוטיפים טפילים שנמצאים באותו המקום בשיבוט היטב. סכמטי כללית להסרת HXGPRT מΔ ku80Δgoi :: HXGPRT למחוק HXGPRT מהזן מוצג (איור 3 א). זוג פריימר משמש לאימות הסרת HXGPRT מΔ Δ ku80 gra2 :: HXGPRT (איור 3) מגביר ~ להקת KBP 1.2 ייחודית בPCR5 כפי שניתן לראות בשיבוטי 4, 7, 9, 11 ו -12 (איור 3 ג). אם HXGPRT לא הוסר מהלוקוס, ~ 3.4 KBP להקה הוא ציין (1 שיבוטים, 2, 3, 6, 8, 10, ובקרת ההורים). מספר מנגנונים לפעול כדי להפוך את הסרת HXGPRT (6TX בחירה) יותר מאתגר ופחות יעילה מאשר שילוב של HXGPRT (MPA + X מבחר). בחירת MPA היא פשוט יעילה יותר מ6TX בחירת 14,16. בנוסף, רמות גבוהות יותר של ביטוי HXGPRT נדרשות לבחירת 6TX מאשר לMPA בחירות 16,24. כתוצאה מכך, מוטציות שעשויות להפחית את פעילות אנזים HXGPRT או מוטציות או שינויים אפיגנטיים המפחיתים את רמת הביטוי של HXGPRT במוקד של גן עלולים לבטל את האפקטיביות של בחירת 6TX. אפילו עם אתגרים של בחירת 6TX אלה, שיעור ההצלחה של בחירת 6TX בזני ku80 Δ הוא יותר מ -90% בניסיון הראשון 1-3. תכנית כללית לתיוג C-מסוף ישיר של חלבון קידוד גנים מוצג (איור 4). זהתכנית עושה שימוש באינטגרציה ישירה באמצעות צלב כפול מעל הומולוגי רקומבינציה של HXGPRT 3 &#39;של הגן מתויג ומעסיקה גם אסטרטגיות אימות דומות לאלה שתוארו לעיל. כאשר יש חשד לגן להיות גן חיוני זה ניתן לאמת באמצעות transfection שנייה עם ה-DNA מיקוד באופן עצמאי בודד פלסמיד. שיטות חלופיות, כגון תוכניות לביטוי מוסדר גן, זמינות לאימות נוספת, אם גן הוא חיוני 25. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של העיצוב של ה-DNA פלסמיד מיקוד. . סכמטי לעיצוב חפיפה פריימרים המשמשים לPCR להגביר אגפי היעד 5 &#39;3 ו&#39; עם 33 נ&quot;ב חופף לוקטור מעבורת pRS416 וקלטת minigene HXGPRT. פריימרים המתוארים בסכימה היוהשתמש כדי ליצור את 5 &#39;ו 3&#39; צלעות היעד של pΔROP18 10. אסטרטגיה כוללת לעיצוב ב &#39;מולקולת הדנ&quot;א מיקוד. עמוד השדרה של pΔGOI הוא אורציל pRS416 מעבורת הווקטור המכיל (אורה) ו( AMP) סמנים לבחירת אמפיצילין. הכניס היא לתוך pRS416 ~ 1 KBP 5 &#39;אגף יעד DNA מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף לקלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות primers F1 וR1, ~ KBP 3 1&#39; אגף יעד DNA מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף ל קלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות primers F2 ו R2 ואת קלטת minigene HXGPRT. אתרי אנזים ההגבלה הייחודיים הבאים לעכל מתווספים לפריימרים: RE.X (אתר חתך אנזים הגבלת X) בפריימר F1 כדי לחתוך את הפלסמיד ב5 &quot;סוף של 5 &#39;אגף יעד ה-DNA, בRE.Y R2 פריימר לחתוך את הפלסמיד ב&#39;סוף 3 &#39;3 אגף יעד ה-DNA וRE.Z בפריימרים R1 וF2 כדי בלו דקות HXGPRTרצפי קלטות igene. ג פריימר השתמשו כדי ליצור את מבנה המיקוד למחיקה של rop18. האזורים המודגשים מתאים לט רצף הגנומי gondii, ואזורי nonbold מתאים לאתרי אנזים ההגבלה והרצפים אשר חופפים pRS416 וקלטת minigene HXGPRT. זוג פריימר HX_F וHX_R מגביר את קלטת minigene 14 HXGPRT. פריימרים לקרוא מ5 &#39;ל 3&#39;. לוח מותאם פנטרס ואח&#39; 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> איור 2. סקירה כללית של הפרוטוקול למחיקה של גנים באמצעות HXGPRT. . Disruption של אירוע רקומבינציה הומולוגית באמצעות ~ 1 &#39;אגף יעד ה-DNA ו~ KBP 3 1&#39; KBP 5 אגף יעד ה-DNA בpΔGOI פלסמיד GOI בזן ku80Δhxgprt Δ ידי מוצלב כפול. אסטרטגיה באמצעות PCR PCR1, PCR2, PCR3, וPCR4 (שלא בקנה מידה) מוצגים המאפשרת אימות גנוטיפ כדי לאמת את השיבוטים עם שילוב ממוקד של HXGPRT ומחיקה של לוקוס GOI. זוגות פריימר נציג B. נועדו לאמת את המחיקה של rop18 . ROP18_DF וROP18_DR להגביר PCR1, ROP18_ExF וROP18_CxR להגביר PCR2, ROP18_CxF וDHFR_CxR להגביר PCR3 וDHFR_CxF וROP18_CxR להגביר PCR4 (ראה איור 2 א). פריימרים לקרוא מ5 &#39;ל 3&#39;. לוח מותאם פנטרס אח&#39; 10 תוצאות נציג. ג האימות של מחיקת גן ממוקדת (rop18) באמצעות HXGPRT. Transfection הבאה של pΔROP18 פלסמיד לתוך Δ ku80Δhxgprt ובחירה בMPA +X, X + MPA שיבוטים העמידים היו assayed למחיקה של rop18. בקרת ההורים היא המתח חיובית עבור 1 PCR (~ 400 נ&quot;ב) וה-PCR 2 (~ 650 נ&quot;ב) ושלילית למוצר ה-PCR 3 (~ 1,200 BP) ו-PCR 4 (~ 1,300 BP) מוצר. נוקאאוט GOI ממוקד הוא חיובי עבור מוצרי PCR2, PCR3 וPCR4 ושלילי למוצר ה-PCR 1 (ראה איור 2 א). מוצגים הם פנלים מייצגים של תוצאות PCR1 וPCR2 (פנל עליון), PCR3 (פנל באמצע), וPCR4 (פנל תחתון). 3 שיבוטים, 4, 5, 6, 8, 9 ו -11 מציגים את דפוס הפסים הנכון של 1-PCR, PCR2, PCR3 וPCR4 שמגדיר את אירוע מחיקת גן ממוקד בשיבוט. 1 שיבוטים, 2, 7, 10 ו -12 אינם מחיקות גנים, ומתאימים לתוצאות נציג פוטנציאליות אחרות. (C = זן בקרת ההורים Δ ku80Δhxgprt, מ = סמני גודל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> איור 3. סקירה כללית של הפרוטוקול למיקוד מחדש את הגן של עניין למחוק HXGPRT. האסטרטגיה א &#39;להסרת הסמן לבחירת HXGPRT ידי מוצלב כפול אירוע רקומבינציה הומולוגית בזן Δ ku80Δgoi :: HXGPRT באמצעות ~ 1&#39; אגף יעד ה-DNA ו~ 1 KBP 3 &#39;KBP 5 אגף יעד ה-DNA בpΔGOIc פלסמיד. אסטרטגיית ה-PCR לאימות גנוטיפ מתוארת באמצעות זוג פריימר לassay עבור מוצר ה-PCR (PCR5) החובק את המחיקה (שלא בקנה מידה). ב &#39;זוג פריימר נציג שנועד לאמת את ההסרה של הסמן לבחירת HXGPRT מgra2 לוקוס בזן Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF וGRA2_CxR להגביר PCR5. פריימרים<html> לקרוא מ5 &#39;ל 3&#39; פנל. נציג ג השיבוטים 6TX העמידים שהיה יכולים להתקבל transfection הבאה של pΔGOIc פלסמיד לתוך Δ ku80Δgoi :: HXGPRT והבחירה ב6TX. שיבוטים 4, 7, 9, 11 ו -12 מציגים את הדפוס הנכון של פסי PCR5 המתאימים למחיקה ממוקדת של סמן HXGPRT (~ 1.2 KBP מוצר שמשתרע על פני &#39;אגף עם חפיפה קלה עם 5&#39; 3 אגף ומחוצה לו 3 &#39; אגף). 1 שיבוטים, 2, 3, 6, 8, ו -10 (הלהקה הזאת היא אור) מייצגים את דפוס הפסים הצפוי של כ ~ 3.4 KBP שמתאים לגנוטיפ השיבוט ההורי, למרות ששיבוטים אלה הציגו מידה מסוימת של התנגדות ל6TX שמותרית הבחירה שלהם (הפנוטיפ זה לעתים יכול להיווצר באופן ספונטני על ידי כיבוי ביטוי HXGPRT (ראה הערה בפרוטוקול 2.1 (שלב 8) וסעיף נציג תוצאות). (C, M = סמני גודל = זן בקרת ההורים Δ ku80Δgoi :: HXGPRT).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> איור 4. עיצוב של מולקולת הדנ&quot;א מיקוד לתייג סוף C-המסוף של חלבון. האסטרטגיה מבוססת על יכולתו של סמן HXGPRT גם לתפקד כאזור רגולציה במורד הזרם 3 &#39;. עמוד השדרה של pΔGOItag הוא אורציל מכיל pRS416 מעבורת הווקטור (אורה) ו( AMP) סמנים לבחירת אמפיצילין. הכניס היא לתוך pRS416 ~ &#39;אגף ה-DNA היעד מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף לקלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות Fgoi וRtag פריימרים, ~ KBP 3 1&#39; 1 KBP 5 אגף יעד DNA מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף ל קלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות F2 וR2פריימרים וקלטות minigene HXGPRT. אגף ה-DNA יעד 5 &#39;מחליף את קודון הסיום עם התג (HA, Myc,, וכו&#39;) ואחרי קודון סיום החלפה. MPA + X מבחר משלב את תג C-המסוף וHXGPRT במורד הזרם, ומעביר את &#39;3 UTR לעמדה הבא סמן HXGPRT. אתרי אנזים ההגבלה הייחודיים הבאים לעכל מתווספים לפריימרים: RE.X (אתר חתך אנזים הגבלת X) בפריימר Fgoi לחתוך את הפלסמיד ב5 &quot;סוף של 5 &#39;אגף יעד ה-DNA, וRE.Y ב R2 פריימר לחתוך את הפלסמיד ב&#39;סוף 3 &#39;3 אגף יעד ה-DNA, וRE.Z בRtag ופריימרים F2 כדי בלו קלטת minigene HXGPRT לשימוש לבנייה לפלסמיד למקד מחדש את לוקוס הגן מתויג למחוק סמן HXGPRT שישחזר את המיקום של &#39;3 UTR.

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג II<em&gt; Δku80</em&gt; זנים של<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; כדי לייצר ביעילות מחיקות גן ממוקדת והחלפות גן לאנליזה גנומית תפקודית.

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא החלפה יעילה ואמינה של גנים באמצעות זני delta 2 80 מסוג one ו-type two של Toxoplasmic ndii. הדבר מושג תחילה על ידי בניית מולקולת DNA למכוון (targeting DNA) הממזגת את הסמן לבחירה HX GPRT בכיוון קדמי (forward orientation) בין מקטעי שוליים (flanks) נבדלים של DNA למכוון גנים בקווי ה-five prime וה-three prime. השלב השני של הפרוצדורה הוא טרנספקציה של מולקולת ה-DNA למכוון לתוך זן toxoplasma DYI מסוג one או type two.השלב השלישי הוא בחירה סבלנית של אירועי רקומבינציה הומולוגית עם ש crossover כפול ובידוד של קלונים בודדים. השלב הסופי הוא תיקוף של נוכחות אירוע תכנון הגנים (gene targeting) בקלוני המוטנטים המבודדים. בסופו של דבר, תוצאות הליך זה יכולה להראות את תפקודם של גנים בטפילים באמצעות ניתוח של השבתות גנים ממוקדות (gene knockouts), החלפת גנים ותיוג גנים באמצעות מגוון יישומים המשכיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות המשתמשות בזני פרא של טפיל זה הוא שרקעי הטפיל delta 2 80 מסוג אחד ומסוג שני מאפשרים כעת ברירה אמינה ביותר של אירועי רקומבינציה הומולוגית של כrossover כפול ממוקד, לצורך יצירת זנים מוגדרים גנטית באופן מדויק. טכניקה זו תאיץ באופן משמעותי את גילוי יעדים חדשים לטיפול תרופתי בפלסמות נוגדי רעלים ואת הפיתוח של זני חיסון מוחלשים בטוחים ויעילים, במיוחד כאשר היא משולבת עם המשאבים הגנומיים המתוכננים היטב הנמצאים באופן מקוון ב-toxodb.org@. באופן כללי, אנשים שאינם בקיים בשיטה זו עשויים להתקשות בהנדסת מולקולות DNA ממוקדות או במניפולציות גנטיות עם Toxoplasma Gandhi.עם זאת, תרגול של המטופלים ותכנון של מולקולות תargeting אמינות יבטיחו את ההצלחה. התחילו את הפרוטוקול על ידי הגברה ב-PCR של רצפי ה-flanks הגנומיים ב-5' וב-3' עבור הגן הנבדק מתוך DNA גנומי. לאחר מכן, הגבירו ב-PCR את הסמן הבריר HX GPRT יחד עם רצפי ה-DHFR flanks ב-5' וב-3' מתוך קסאט המיני-גן HX GPRT CD NA.השתמשו ברקומבינציה של שמרים או בשיטה דומה כדי לחבר את מולקולות ה-DNA התלת-ממדיות בכיוון הנכון שלהן מקצה חמישי לשלישי עם הפלסמיד PRS 416, ובכך צרו את הפלסמיד p delta GOI שיכוון למחיקה של הגן המבוקש. לאחר מכן, הכינו דגימה של 100 µL המכילה 15 עד 30 µg של פלסמיד targeting לינארי עבור טרנספקציה לתוך T gia, כ-68 עד 72 שעות לאחר הזרקת בקבוק של 25 cm של תאי HFF קונפלואנטים. ודאו את נוכחותם של טפילים ש acabado-lyzed על ידי אישור חזותי ש-90 עד 95% מתאי ה-HFF עברו ליזה; טפילים חיוניים הכרחיים עבור targeting של הגן.ערבבו את הטפילים החיים לתוך התמיסה על ידי ניעור חזק של הבקבוק הסגור, מבלי להתיז נוזל על החלק הפנימי של המכסה או על צוואר הבקבוק. אספו את הטפילים מהבקבוק והכינו אותם לטרנספקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בצעו אלקטרופורציה של הפלסמיד המכוון אל תוך זן ה-toxoplasma delta CO 80.העבירו את התערובת שעברה אלקטרופורציה לבקבוק של 150 סנטימטר המכיל תאי HFF במצב של התמזגות (confluent) ו-30 מיליליטר של Medium זיהום. דגרו את התרבית המזוהמת למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, כ-20 שעות לאחר הטרנספקציה. החליפו את המצע במצע ברירה של MPA plus X.כעת יש לאפשר לטפילים להדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך כשמונה ימים, ללא הפרעה. ברגע שפלאקים (plaques) יהיו גלויים, נעקוף את הבקראק כדי לשחרר טפילים חוץ-תאיים מהשכבה החד-שכבתיים (monolayer) ליצירת תמיסת טפילים. העבירו כ-0.5 mL מתמיסת הטפילים לבקראק חדש של 25 cm המכיל תאי HFF קונפלואנטיים ב-5 mL של מצע ברירה MPA plus X.סמנו תרבית זו כ-PAs one A כעבור כשלושה ימים. חזרו על העברת 0.5 mL של תמיסת הטפיל מהבקבוק המקורי לבקבוק אחר של תאי HFF עם אותו מצע ברירה. סמנו תרבית זו כ-PAs one B במהלך חמשת הימים הבאים.עקבו אחר מעבר אחד A ואחד B עבור pfu. בחרו במעבר אחד A או במעבר אחד B לתתי-שיבוט על בסיס מספר מספיק של יותר מ-25 אזורי זיהום. בכל פעם שהטפילים גורמים לליזה של תאי HFF, העבירו את התרבית לבקבוק חדש של 25 סנטימטר עם תאי HFF קונפלואנטים במצע ברירה. שלושה שבועות לאחר הטרנספקציה, בצעו תתי-שיבוט של טפילים שהוחדרו טריים על ידי דילול הטפילים לריכוז המתאים במצע MPA plus X, והפיצו באופן שווה את תמיסת הטפילים למגש של 96 בארות המכיל תאי HFF קונפלואנטים.הכינו מגש אחד בריכוז של טפיל אחד לכל באר, והכינו מגש שני בריכוז של שני טפילים לכל באר. דגרו את שני המגשים בטמפרטורה של 37 °C לאחר תאריך הטרנספקציה המקורי. אין לבצע סב-קלון של הטפילים לפני היום ה-20 עבור טפילים מסוג 1, או לפני היום ה-25 עבור טפילים מסוג 2.המשיכו להעביר את הבקבוק בנפח 25 סנטימטר בלוח זמנים שבועי כפי שמתואר בטקסט המקוון, עד אשר זן ה-knockout יאומת. לאחר כשבוע, בצעו דירוג (score) של תבניות 96 הבארים תחת הגדלה של 40 עד 60 x. בחרו רק בארים המכילים PFU בודד, שזוהה כאזור זיהום בודד, באמצעות פיפט המכוון ל-50 microliters.ערבבו את תכולת בארות אלו על ידי הכוונת זרימת הנוזל מעל ה-PFU כדי לפזר את הטפילים ברחבי הבאר. ארבעה עד חמישה ימים לאחר ערבוב הבארות הנבחרות, בחרו תריסר שיבוטים עם תאים שעברו ליזה. העבירו 12 שיבוטים מגש 96 הבארות ל-12 בארות של גש 24 בארות. בצעו זאת על ידי גירוד עם קצה פיפט בתחתית הבאר ושאיבה של 6 µL.העבירו את התמיסה לבאר בפלטה של 24 בארות עם תאי HFF בשכבה רציפה (confluent) במיליליטר אחד של MPA בתוספת X selection. Medium. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C ועקבו אחר ליזיס של תאי ה-HFF. בצעו מעבר (Passage) של הטפילים מבאר שעברה ליזיס בפלטה של ה-24 בארות בלוח זמנים שבועי.השתמשו בטכניקת השריטה והציור (scratch and draw) כדי להעביר 2 µL של תמיסת הטפילים לצלחת חדשה עם MPA ובחירה על X. לאחר המעבר, אספו את הטפילים מהפלטה המקורית בעלת 24 הבארות והעבירו אותם למבחנות קטנות לצורך איסוף DNA.לסיום, השתמש ב-PCR כדי לבחון את מחיקת הגן המבוקש, על מנת לוודא את האינטגרציה של האגפים המטרה ב-5' וב-3', ואת נוכחותו של הסמן הבורר HX GPRT. פרוטוקול זה מיועד להסרת הסמן HX GPRT מזן ה-delta Q 80 המהונדס, והוא מפורט בטקסט המקוון.שיטת P delta GOYC שואפת להסיר את HX GPRT מהטפיל באמצעות ברירה שלילית תוך שימוש בשישה מצעי TX. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-PCR כדי לאשר את אובדן HX GPRT, כפי שמעידה פס של 1.2 Kilobase pair במקרים שבהם HX GPRT לא הוסר מהלוקוס. קיימת פס של 3.4 kilobase pair.החלק האחרון של פרוטוקול זה, תיוג של קצה C של חלבונים, מתואר אף הוא בפירוט בטקסט המקוון. לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר למחיקה ממוקדת של גן, נעשה שימוש ב-PCR כדי לאמת את המחיקה של knockout של type one R 18, אתר שבאופן כללי קשה לתיקוד. PCR 1 מראה את היעדרה של תוצר ה-PCR של הגן R 18.בדיקת PCR שתיים מעידה על נוכחותו של רצף ה-flank הגנומי של R 18 ב-3', ובדיקות PCR שלוש וארבע מעידות על כך שהסמן לברירה שולב כראוי בין רצפי ה-flank הגנומיים ב-5' וב-3', דבר המגדיר את מחיקת R 18. על מנת להשתמש שוב בסמן לברירה לצורך ביצוע מחיקות עוקבות בזן, יש להסיר תחילה את HX GPRT המקורי מהלוקוס. לאחר ביצוע הפרוטוקול המתואר.HX GPRT הוסר משני האתרים של GRA שנמחקו בזן delta two 80 delta GRA two HX. נעשה שימוש ב-G-P-R-T-P-C-R כדי לאשר את אובדן HX GPRT, כפי שהודגם על ידי פס של 1.2 KILOBASE. כאשר H-X-G-P-R-T לא הוסר, הופיע פס של 3.4 kilobase לאחר שלב התargeting הגנטי הראשוני. ניתן להחיל שיטות targeting גנטי נוספות כדי לבנות knockouts מרובים באותו זן מסוג one או מסוג two, או כדי לתייג או להשלים זן מוטנטי כדי לענות על שאלות נוספות כמו, היכן חלבון זה ממוקם בתא?או מהו הדומיין או הפעילות המרכזית של חלבון זה או של מסלול זה המסבירה את תפקודו הביולוגי? טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום להגביר את חקירת תפקוד הגנים של טפילים בקומפלקס AP המודלי ובטפיל toxoplasma. Gandhi eye.אל תשכחו שעבודה עם toxoplasma עלולה להיות מסוכנת, ויש לשמור על אמצעי זהירות, כגון הקפדה על כל הנחיות BSL 2, לאורך כל הפרוצדורה.

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Forward genetics היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים בפתוגנים תוך-תאיים החשובים לעמידות לחסינות אוטונומית של התאים. הגישה הנוכחית משתמשת בתאי חיסון מולדים, במיוחד מקרופאגים, כדי לזהות גנים חדשים של טוקסופלזמה גונדי החשובים להתחמקות חיסונית.

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

ג'ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

פרטים מוצגים על איך מיפוי QTL עם גנום שלם רצף גנטי מבוסס ניתן להשתמש כדי לזהות הגן עמידות התרופה ב Toxoplasma gondii וכיצד ניתן לאמת זאת עם מערכת CRISPR / Cas9 כי ביעילות עריכת יעד גנומי, במקרה זה גן ההתנגדות לסמים.

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

מוצג כאן הוא פרוטוקול להעריך את היעילות עכבות של תרכובות כימיות נגד הצמיחה מחוץ למוח טוקסופלזמה gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה. הטכניקה משמשת כדי לאשר את העיכוב ספציפיות על ידי מחיקה גנטית של הגן היעד המתאים. עיכוב של LHVS נגד TgCPL פרוטאז מוערך כדוגמה.

קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר וגנוטיפ של זני טוקסופלזמה גונדי באמצעות ריצוף ננופורים נייד של סמנים גנטיים נבחרים, המאפשר זיהוי זן ממוקד וניתן להרחבה במבודדים המתוחזקים במעבדה, עם יישום פוטנציאלי בעתיד בסביבות ניטור.

ריצוף רב-לוקוס לטייפון זן של טוקסופלזמה גונדי

למד שיטה יעילה להחלפת גנים ב-Toxoplasma gondii באמצעות זני Δku80. הפרוטוקול מנצל רקומבינציה הומולוגית וסמן HXGPRT ליצירת מחיקות גנים מדויקות ותיוגים, ומאיץ מחקר גנומי תפקודי בטפיל זה.

מניפולציה גנטית ב

גלה סרטונים נוספים